曹楊港 陳月橋 胡 錦 陳瑋鈺 陶 然 譚利婷 隆曉榮 毛德文△

1.廣西中醫(yī)藥大學研究生院 (廣西 南寧, 530001) 2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī) 院肝病科

肝纖維化(HF)是指因病毒性肝炎、酗酒、自身免疫性肝炎、代謝相關性脂肪性肝病和膽汁淤積性肝病等各種原因,導致肝細胞受損后再生,細胞外基質(ECM)在肝臟中彌漫性過度沉積與異常分布的疾病,是肝臟自身病理性修復反應。肝纖維化若未得到有效控制,會導致肝細胞結節(jié)樣再生,形成假小葉結構,進展為肝硬化[1,2]。肝星狀細胞(HSC)的活化是肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié),HSC激活后,轉變?yōu)榧〕衫w維細胞(MFB),表達α-平滑肌動蛋白(α-SMA),同時合成ECM等,導致肝纖維化[3]。而轉化生長因子β (TGF-β)、Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、血小板衍生生長因子( PDGF)以及核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3(NLRP-3)/天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)通路已被公認為HSC活化和纖維化進展的關鍵信號通路[4]。

目前,現(xiàn)代醫(yī)學尚缺乏抗肝纖維化的有效治療藥物,而中醫(yī)藥抗纖維化效果顯著,已得到業(yè)界廣泛關注與認可。近年來,眾多研究表明中醫(yī)藥可通過調控TGF-β1/Smads信號通路治療HF,本文將對最新研究進展進行綜述。

1 TGF-β1/Smads信號通路概述

TGF-β是轉化生長因子超家族中的一種擁有廣泛的生物學功能的多功能細胞因子,廣泛參與調控細胞的增殖、分化、凋亡、免疫等過程,在哺乳動物中表現(xiàn)為TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3三個亞型,其中 TGF-β1為表達得最多最廣泛的亞型[5]。TGF-β1作為一種體內平衡因子,在器官損傷或感染后保持免疫系統(tǒng)的平衡,并協(xié)調復雜的組織修復過程,其在組織器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。TGF-β1主要通過TGF-β受體(TβR)傳導信號發(fā)揮其生物學效應,TβR主要分為3型：TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ。傳導信號主要通過其Ⅰ、Ⅱ型受體進行。當TGF-β1活化后,其與細胞膜上的TβRⅡ結合,然后吸附TβRⅠ并與其形成RⅡ-配體-RⅠ異源三聚體,TβRⅠ被TβRⅡ激酶磷酸化并被激活,活化的TβRⅠ磷酸化下游的Smads蛋白家族發(fā)揮信號傳導作用[7]。TβRⅢ除了發(fā)揮輔助呈遞作用外,最新研究發(fā)現(xiàn)其還可與Ⅰ型受體和Ⅱ型受體形成復合物,抑制TGF-β介導的Smad信號通路[8],此外其還參與介導TGF-β非經(jīng)典信號通路[9]。

TGF-β1與相應受體結合后,傳遞信號至下游的Smads蛋白家族,Smad蛋白家族可分為3種類型,分別是受體調節(jié)型Smad(R-Smad)：Smad1、2、3、5、8;共同介質型Smad(Co-Smad)：Smad4;拮抗型Smad(I-Smad)：包括Smad6、7。R-Smad 可與活化的TβRⅠ直接作用并被磷酸化激活,TβRⅠ磷酸化其C末端SXS基序中的絲氨酸導致R-Smad活化,其中TGF-β/activin/nodal亞家族的I型受體ALK4/5/7主要磷酸化Smad2/3,而BMP/GDF/AMH亞家族的ALK2/3/6和ALK1主要磷酸化Smad1/5/8。R-Smad磷酸化后與Co-Smad結合組成異聚體并繼續(xù)呈遞信號。Co-Smad是需要與R-Smad形成異源寡聚物的一類Smad蛋白,其無法被其他任何受體磷酸化。Smad 4和多數(shù)R-Smad (除Smad 2外)的MH 1區(qū)有結合DNA的序列,其可結合磷酸化的R-Smad,發(fā)揮轉錄因子樣作用。Smad主要起拮抗信號轉導的作用,由于I-Smads和R-Smads擁有相似的結構,二者存在競爭性結合RI的關系,并且I-Smads能更優(yōu)勢的結合RI,所以 Smad6和Smad7可拮抗R-Smads的激活,Smad7是廣譜抑制蛋白,可廣泛抑制TGF-β家族,而Smad6則特異性的抑制BMP信號[10,11]。

2 TGF-β1/Smads信號通路在HF中的作用

TGF-β1是重要的促纖維化細胞因子,參與了組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展的整個過程,TGF-β1的激活會導致膠原積累程序的啟動,一方面有助于器官的損傷修復,但另一方面過度表達會導致ECM生成與降解的平衡被打破,參與組織器官纖維化的發(fā)生及進展。TGF-β1作為許多不同類型細胞的有效生長抑制劑,在控制實質細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用,并刺激ECM成分的產(chǎn)生。在HF發(fā)生過程中,TGF-β1對HSC的活化及HSC向MFB轉化的起始、促進和進展至關重要,并且HSC自身可分泌TGF-β1,維持其自身的持續(xù)激活,TGF-β活性與數(shù)量的增加,使得ECM的生成和沉積增加,隨后發(fā)生的上皮間質轉化(EMT)也是HF發(fā)生和發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)[12],并且TGF-β1可抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的產(chǎn)生,同時促進金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的生成,從而使得ECM的生成與降解嚴重失衡[13],造成進行性的瘢痕纖維化和器官功能喪失。而Smads蛋白家族是TGF-β1下游重要的細胞內效應子,介導信號傳入細胞核,激活HSC,調節(jié)靶基因的轉錄,啟動膠原基因表達[14]。綜上,TGF-β1/Smads信號通路是HF發(fā)生發(fā)展的重要信號通路之一,靶向調控TGF-β1/Smads信號通路是重要的治療策略以及科學研究的熱點。

3 中醫(yī)藥干預TGF-β1/Smads信號通路治療HF

3.1 中藥單體成分及提取物 中藥單體成分及提取物是中藥發(fā)揮臨床療效的核心成分,提取有效成分有助于提高藥物作用效率,相關的機制研究可精確定位其作用靶點及信號通路,有助于抗纖維化新藥的研發(fā)與應用。

3.1.1 苷類 三七總皂苷是中藥三七的有效提取成分,王京凱等[15]發(fā)現(xiàn)其可改善HF模型大鼠的肝纖維化,并且降低肝組織TGF-β1、Smad3以及其mRNA的表達,調控TGF-β1 / Smads信號通路的傳導是其抗HF的可能機制。芍藥苷是芍藥的提取物,Ma等[16]發(fā)現(xiàn)其可降低輻射誘導的HF大鼠肝臟的羥脯氨酸(HYP)、透明質酸酶(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)及血清TGF-β1水平,同時下調Smad3/4的表達,上調Smad7表達,從而減少膠原沉積,拮抗HF。白首烏C-21甾體總苷是中藥白首烏的提取物,張婷等[17]發(fā)現(xiàn)其可抑制人肝星狀細胞內TGF-β1、p-Smad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA及核因子κB( NF-κB)蛋白表達,并上調NF-κB的抑制蛋白(IκB),調節(jié)NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路,抑制人HSC活化,是其抗HF的作用機制。

3.1.2 黃酮類 雙氫楊梅素是中藥藤茶中提取的黃酮類化合物,梁冰潔等[18]研究發(fā)現(xiàn)雙氫楊梅素可改善HF小鼠肝組織I型膠原蛋白(CoⅡ)、ColⅢ水平,下調α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad4和其mRNA的表達,上調Smad7及其mRNA的表達,改善肝功能,減少肝臟膠原蛋白沉積,發(fā)揮其抗HF作用。 白背葉總黃酮是從中藥白背葉中提取出的化合物,研究發(fā)現(xiàn)其可改善CCl4誘導的HF大鼠的肝功能指標,逆轉肝纖維化,降低HYP、PC-Ⅲ、CoⅡ、HA及LN的水平,抑制了TGF-β1/Smad信號通路的傳導和α-SMA的表達,提高抗氧化能力,減少HSC活化和ECM沉積[19]。甘草素是從甘草中提取的二氫黃酮單體復合物,Lee等[20]研究發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制CCl4誘導的HF大鼠的纖維化,阻斷TGF-β1誘導的Smad 3磷酸化的同時,抑制了人肝星狀細胞中纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)和MMP-2的轉錄水平,通過誘導YAP磷酸化增加了大抑癌基因蛋白1(LATS1)的活化,從而降低了YAP轉錄活性并遏制了TGF-β1/Smad信號通路的傳導。

3.1.3 酚酸類 丹酚酸A是中藥丹參的酚酸類提取物,吳雄健[21]使用丹酚酸A干預CCl4誘導的HF大鼠模型,研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A可明顯降低TGF-β1、α-SMA和Smad3 mRNA和蛋白的表達,抑制TGF-β1/Smad信號通路來發(fā)揮拮抗大鼠HF的作用。沒食子酸是從余甘子中提取的酚酸類化合物,Rasha等[22]研究發(fā)現(xiàn)其具有保肝和抗氧化作用,可改善硫代乙酰胺(TAA)誘導的大鼠肝纖維化情況,并下調TGF-β1、磷酸化Smad3蛋白和總Smad3蛋白肝內表達。此外,下調miR-21的表達,同時上調miR-30和miR-200表達,其效應是通過抑制TGF-β1/Smad3信號傳導和差異化調節(jié)miR-21,miR-30和miR-200的肝臟表達水平來實現(xiàn)的。

3.1.4 萜類 莪術油是莪術的提取物,莪術醇是其中的活性成分之一,屬萜類化合物,鄭洋等[23]研究莪術醇抗肝纖維化的作用機制,發(fā)現(xiàn)莪術醇組小鼠Ishak評分及肝功能指標改善;莪術醇可下調實驗組小鼠TGF-β1、Smad2/3 mRNA以及Smad2/3的表達。Chen等[24]利用網(wǎng)絡藥理學預測并通過動物實驗以及轉錄組學技術驗證了莪術油可通過調控TGF-β1/Smads通路發(fā)揮抗纖維化作用。

3.1.5 其他 大蒜素為藥食兩用的大蒜的提取物,李曉翠等[25]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可有效改善HF大鼠的肝功能、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)水平以及膠原容積分數(shù)(CVF),顯著降低肝組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、ColⅠ、Col Ⅲ的表達,進而減少ECM生成,顯著改善HF?？嗵u睡茄內酯提取物是中藥苦蘵提取出的主要含酸漿苦素型的化合物,體內外實驗均證實其抑制YAP的表達及Smad2的磷酸化水平,下調YAP和TGF-β/Smad通路抑制HSC活化,有效減少ECM沉積,改善HF[26]。中藥覆盆子,又稱為紅樹莓,李彤等[27]研究發(fā)現(xiàn),紅樹莓可改善HF大鼠的肝功能,且病理切片結果顯示肝組織破壞程度降低,肝臟匯管區(qū)炎性細胞浸潤及膠原沉積也顯著減少,肝臟組織中TGF-β1蛋白表達顯著降低,Smad7表達顯著升高,通過干預TGF-β1/Smad信號通路起到抗HF作用。姜黃素是中藥姜黃的提取物,細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)其可抑制HSC增殖,降低ColⅠ、Col Ⅲ、α-SMA、p-smad2和p-65的表達;動物實驗表明姜黃素可有效改善CCl4誘導的HF和肝功能受損,抑制肝組織內p-smad2和p-65/NF-κB表達,下調TGF-β/smad2信號通路抑制HSC活化,從而減少肝臟內膠原的沉積[28]。

中藥單體成分及提取物成分單純,對其進行作用機制研究,有助于精確定位其靶點與通路,避免不同藥物之間的串擾,單體成分及提取物的進一步提純和多種成分的組合對于新型抗HF藥物的研發(fā)與推廣具有重大現(xiàn)實意義。但目前的研究大多以動物實驗、細胞實驗等基礎研究為主,應盡快轉入藥物開發(fā)研究,進行臨床實驗,促進新型藥物盡快問世并推廣應用,此外目前的研究主要聚焦于機制研究及療效研究,劑量探索研究較少,且缺乏安全性和耐受性研究,不利于進一步推廣應用。

3.2 中藥復方

3.2.1 中成藥 中成藥是在中醫(yī)藥理論指導下,以中草藥為原料,加工配制而成的便于服用的制劑,具有服藥便捷高效的優(yōu)點,近年來基于TGF-β/Smads通路探討中成藥抗HF的機制研究同樣取得了較多成果。丁茂鵬等[29]研究發(fā)現(xiàn)鱉甲育肝顆?？筛纳艸F大鼠肝功能及肝纖維化相關指標,還使TGF-β1及Smad3 mRNA表達明顯下降,而Smad7 mRNA表達則明顯升高。郭輝等[30]研究發(fā)現(xiàn)消炎利膽片、膽通顆粒均可改善膽汁淤積性早期HF大鼠的肝組織纖維化情況,同時降低了TGF-β1水平及Smad2、Smad3蛋白表達。彭孟云等[31]使用參仁活血顆粒干預CCl4誘導的大鼠HF模型,發(fā)現(xiàn)其能明顯改善肝纖維化程度,降低TGF-β1、Smad3、Col I、Col 的表達,同時上調Smad7表達。 盧瑋等[32]研究發(fā)現(xiàn)安絡化纖丸可顯著改善HF大鼠的肝纖維化,并下調TGF-β1、α-SMA及TGF-β1、Smad2/3的 mRNA表達,抑制HSC的激活,這可能是其抗HF的作用機制。曹婷婷等[33]發(fā)現(xiàn)紫七軟肝顆粒可改善HF大鼠的肝功能及HF指標,降低肝組織氧化應激水平,使TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表達明顯下降,其抗HF機制可能是調控TGF-β/Smad通路,抑制HSC的活化。張家富等[34]發(fā)現(xiàn)肝樂顆粒其可明顯抑制肝組織中Collagen、TGF-β1、TβRⅠ、Smad2表達,可抑制HSC的激活與增殖,減少ECM的產(chǎn)生及在肝臟的沉積。劉慧敏等[35]研究發(fā)現(xiàn)六味五靈丸可抑制α-SMA、TGF-β1、Smad2/3的表達和Smad3的磷酸化,并上調Smad7的表達,從而減少肝臟膠原沉積,拮抗與逆轉HF。代夏歡[36]研究發(fā)現(xiàn)獨一味顆?？梢种艸F小鼠的Smad3、Smad3 mRNA表達,上調Smad7、Smad7 mRNA表達,改善肝臟病理改變,降低HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平,其抗HF機制可能與干預TGF-β1/Smads信號通路有關。

3.2.2 經(jīng)典方劑 經(jīng)典方劑是來源于中醫(yī)典籍中的久經(jīng)臨床檢驗的有效方劑,且具備完整詳備的理法方藥體系,傳承應用好經(jīng)典方劑并通過科學研究闡釋其科學內涵至關重要。劉世政[37]研究發(fā)現(xiàn),小柴胡湯可改善大鼠HF,升高血清Alb,降低ALT、AST、HA、LN、PCⅢ,且肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的表達水平降低,其抗HF的分子機制可能是調控TGF-β1/Smad信號通路。Zhou等[38]使用逍遙散干預CCl4誘導的HF大鼠,發(fā)現(xiàn)用藥后HF大鼠的肝功能及HF程度均得到改善,同時α-SMA和ColⅠ的表達下降,利用轉錄組學分析以及網(wǎng)絡藥理學構建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡,KEGG通路和GO富集分析表明,調控TGFβ1/Smad通路和Akt/FoxO3通路是其抗肝纖維化的機制。張建偉等[39]研究發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸能有效降低HF大鼠TGF-β1及Smad3的表達,提高Smad7的表達,改善肝細胞壞死變性,減少膠原沉著,減輕HF程度。柏干蘋等[40]研究發(fā)現(xiàn)鱉甲煎改良方(原方減去藥性峻猛,易傷正氣的蜂房、鼠婦等,加茯苓、黃芪)同樣能下調HSC-T6的TGFβ1、Smad3的表達,同時上調Smad7的表達,有效抑制HSC-T6的活化。

3.2.3 自擬經(jīng)驗方 在中醫(yī)藥探索抗HF治療的漫漫征途中,涌現(xiàn)了大量簡便廉驗的經(jīng)驗方,經(jīng)驗方是中醫(yī)經(jīng)典理論、名醫(yī)學術思想以及寶貴臨證經(jīng)驗的智慧結晶,在中醫(yī)抗HF治療中占據(jù)重要地位。柔木丹是常占杰教授創(chuàng)制的治療HF的經(jīng)驗方,由黃芪、皂刺、鱉甲、柴胡、赤芍、丹參等組成,具有柔肝軟堅、活血消積的功效。李倩等[41]發(fā)現(xiàn)柔木丹可減輕模型小鼠的肝纖維化程度,降低血清中的ALT、AST、HYP的水平;減少CollagenⅠ、Ⅲ表達與膠原沉積,同時降低肝組織中TGF-β1、α-SMA以及Smad4表達強度,抑制HSC激活,減少膠原生成,抑制肝臟中ECM生成與沉著。扶肝化纖湯是治療肝纖維化的經(jīng)驗方,由四逆散加三七、丹參、當歸、鱉甲、黃芪,白術、絞股藍、黃精組成,具有調和肝脾、活血化瘀之效。肖政華等[42]發(fā)現(xiàn)扶肝化纖湯可降低HSC-T6細胞中Smad3、α-SMA、ColⅠ的mRNA表達,增加Smad7 mRNA表達,通過調控TGF-β1/Smad信號傳導通路,抑制HSC增殖和活化。柴竭抑肝纖是治療肝纖維化的經(jīng)驗方,由柴胡、血竭、白芍、赤芍、當歸、桃仁、紅花等組成,具有疏肝健脾行氣、活血化瘀散結之效,郭會君[43]發(fā)現(xiàn)其可顯著下調HSC-T6細胞的TGF-β1、α-SMA蛋白、Smad 2、Smad 3及Smad 4 的mRNA表達,從而抑制HSC的活化與增殖發(fā)揮抗纖維化作用。疏肝健脾活血方是浙江名中醫(yī)周庚生教授治療HF的經(jīng)驗方,由茯苓、甘草、白術、桃仁、參三七、丹參等組成,具有疏肝健脾,活血軟堅之功效,周凝[44]發(fā)現(xiàn)其含藥血清可減少HSC的活化及ColⅠ的合成,同時下調Smad2、Smad3、Smad4及Smad7 mRNA的表達,通過調控TGF-β1/Smads信號通路來延緩HF進展。軟肝散是張金良教授治療HF的經(jīng)驗方,由柴胡、白芍、白術、莪術、鱉甲、淫羊藿等組成,具有調肝理脾軟堅、補腎益精活血之效,劉定等[45]發(fā)現(xiàn)其可改善HF大鼠肝組織病理改變,減少肝組織中TGF-β1、Smad3蛋白的表達,干預TGF-β/Smad信號通路的傳導,發(fā)揮拮抗HF的作用。

抗HF的中藥復方組成以活血藥、理氣藥、補益藥等為主,大多具有調和肝脾、活血化瘀之效,復方相比單味藥及提取物,可發(fā)揮藥物協(xié)同作用,提升抗HF臨床療效,另一方面由于存在藥物間協(xié)同及串擾機制,增加了作用機制研究的復雜性,今后可對復方中的單味藥及成分進行逐一研究,對相關信號通路及靶點進行更全面探討與總結,闡釋其科學內涵,并篩選性能優(yōu)良者,進行新的藥物組合,開發(fā)療效更為顯著的新型復方制劑,此外也應當加強安全性及最佳給藥劑量研究。

4 總結與展望

在目前現(xiàn)代醫(yī)學對肝纖維化暫無有效治療藥物及治療方案的大背景下,大量的基礎研究及臨床研究均證實中醫(yī)藥阻斷和逆轉HF的臨床療效顯著。在我國,病毒性肝炎、酒精性肝病及代謝相關性脂肪性肝病等慢性肝病患者基數(shù)巨大,對HF進行定期的隨訪與及時的介入治療是慢性肝病防治的關鍵,對于防止疾病進展為肝硬化、肝衰竭、肝癌等終末期肝病至關重要。近年來,中醫(yī)藥靶向調控TGF-β1/Smads信號通路對拮抗HF的相關研究取得了較大進展,為中醫(yī)藥治療HF提供了科學依據(jù),為進一步深入科學研究及臨床應用推廣奠定了堅實基礎。

目前對中醫(yī)藥抗HF的基礎研究較多,但研究成果轉化及應用進展緩慢,研究局限于療效評價及機制研究,應盡快促進中藥藥理評價向創(chuàng)新藥物開發(fā)應用轉變,同時要加強安全性研究及藥代學研究。中醫(yī)藥治療疾病具有多效應、多靶點、多通路的特點,目前的研究只集中在單一信號通路的研究,未能全面揭示中醫(yī)藥抗HF的科學內涵,今后的研究應對相關的靶點及信號通路進行更全面的研究與總結,并明確各通路的相互關系或協(xié)同作用機制。目前相關研究未重視中醫(yī)證型的建模,今后對中醫(yī)藥抗HF的研究可建立相應證候模型,研究TGF-β1/Smads經(jīng)典信號通路在不同證型中的差異化傳導,從而更加符合中醫(yī)藥原創(chuàng)診療思維。臨床工作中發(fā)現(xiàn)中醫(yī)外治法干預HF也有著較好的療效,但目前相關機制研究較少,今后可進行深入探討,發(fā)掘更多抗HF的治療手段。