張 真,楊億然,王 慧,李劍慶,李?lèi)?ài)平,柏正平,劉 雨

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2. 湖南省中醫(yī)藥研究院,湖南 長(zhǎng)沙 410006;3. 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410006)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球第四大死因,預(yù)計(jì)到2030年將成為第三大死因[1]。2018年,王辰院士牽頭的“中國(guó)成人肺部健康研究”調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)20歲及以上成人COPD患病率為8.6%,40歲以上人群患病率高達(dá)13.7%,估算我國(guó)患者數(shù)近1億[2]。COPD特征是不可逆性的氣流受限,其發(fā)病與環(huán)境和遺傳因素有關(guān),吸煙是主要的危險(xiǎn)因素,深入研究其病理生理學(xué)機(jī)制將對(duì)COPD的個(gè)體化治療有重大意義。氣道黏液潴留是COPD的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[3-6]。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)是一種環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴(lài)的ATP門(mén)控性Cl-通道,對(duì)氣道液體運(yùn)輸和黏液濃度至關(guān)重要,與氣道慢性炎癥及黏液潴留密切相關(guān),CFTR的間接增效劑-羅氟司特治療COPD患者療效較好,并成功在歐美等地上市[7]。肺離子細(xì)胞是近期發(fā)現(xiàn)的一種氣道新的細(xì)胞類(lèi)型,CFTR被證實(shí)在肺離子細(xì)胞中大量表達(dá),破壞促肺離子細(xì)胞生成關(guān)鍵因子Foxi1可致CFTR表達(dá)喪失和氣道黏液潴留[8-9]。金水六君煎出自《景岳全書(shū)》,臨床上用于治療COPD咳喘痰多療效滿(mǎn)意,藥效學(xué)研究顯示金水六君煎能顯著增加氣管液體分泌量,促進(jìn)痰液排出[10]。本課題組前期研究亦表明,金水六君煎能明顯抑制COPD大鼠黏蛋白5ac(Muc5ac)的表達(dá),上調(diào)水通道蛋白5的表達(dá),以促進(jìn)氣道黏液排出[11]。本實(shí)驗(yàn)以COPD小鼠為研究對(duì)象,觀察了金水六君煎對(duì)氣道黏液潴留的干預(yù)作用和對(duì)CFTR、Foxi1表達(dá)的影響,以進(jìn)一步闡明金水六君煎治療COPD的可能機(jī)制及靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠72只,體重18～22 g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004,質(zhì)量合格證號(hào):ZS-202203150021。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±2)℃,濕度50%～60%,晝夜12 h交替照明,自由獲取標(biāo)準(zhǔn)食物和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LLBH-202201050001)。

1.2藥物及金水六君煎藥液制備 羅氟司特(批號(hào):155813)購(gòu)自MedChemExpress(MCE)公司。根據(jù)文獻(xiàn)[12-13],確定金水六君煎原方劑量:當(dāng)歸7.5 g、熟地黃15 g、陳皮5.5 g、半夏7.5 g、茯苓7.5 g、炙甘草4 g、生姜10 g,各中藥飲片購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房,并經(jīng)田其學(xué)主任藥師鑒定確認(rèn)。一煎按原藥材量加入10倍水,煎煮1 h后過(guò)濾,二煎加入8倍量水,煎煮1 h后過(guò)濾,合并2次濾液,分別濃縮成0.75 g/mL、1.5 g/mL、3.0 g/mL的藥液,并分裝存于4 ℃冰箱中備用。

1.3香煙和主要試劑 金圣牌香煙,江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),含焦油8 mg、煙氣煙堿0.8 mg、CO 9 mg。脂多糖(LPS,批號(hào):0000113255)購(gòu)自Millipore Sigma公司;4%多聚甲醛固定液(批號(hào):22242687)購(gòu)自北京蘭捷柯科技有限公司;蘇木素伊紅染液(批號(hào):03A220706)購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司;唾液酸試劑盒(批號(hào):20220901)、尿素試劑盒(批號(hào):20220825)購(gòu)自南京建成生物工程研究所;cAMP ELISA試劑盒(批號(hào):08/2022)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物有限公司;Muc5ac ELISA試劑盒(批號(hào):U22027015)購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司;V-ATPase ELISA試劑盒(批號(hào):Jul 2022)購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司;小鼠單抗CFTR(批號(hào):00100501)、小鼠單抗β-actin(批號(hào):10011066)購(gòu)自美國(guó)proteintech公司;兔多抗Foxi1(批號(hào):A90915N)購(gòu)自Themo Fisher公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠二抗(批號(hào):02E220621)、HPR標(biāo)記羊抗兔二抗(批號(hào):01C220617)購(gòu)自中國(guó)Abiowell公司;核酸染料(批號(hào):P1622)購(gòu)自北京普利萊公司;mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):10148)購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。

1.4主要儀器 1.6 m×0.5 m×0.25 m亞克力透明煙熏箱(包含頂部和側(cè)面2個(gè)直徑8 cm的進(jìn)出氣孔),由上海易雕實(shí)業(yè)有限公司定制;LH-75型管道風(fēng)機(jī)(深圳市世化電器照明有限公司);PFT-MR型肺功能檢測(cè)儀(上海塔望智能科技有限公司);DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一生物科技有限公司);ChemiScope6100型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司);H1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);QuantStudio1型實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);PW-812型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、MB-530型多功能酶標(biāo)分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司);DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);BA210T型生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、COPD組、金水六君煎低劑量組、金水六君煎中劑量組、金水六君煎高劑量組、羅氟司特組,每組12只。除空白組外,余各組小鼠采用鼻腔滴注LPS加煙熏的方法建立COPD模型[14],即在連接風(fēng)機(jī)的自制煙熏箱中熏煙,2次/d,每次40min,中途間隔4h,每次使用20支香煙,每熏煙6 d休息1 d,共計(jì)60 d。除空白組使用生理鹽水滴鼻外,余各組在第1天和第14天使用LPS滴鼻,每只小鼠0.6 μg/μL,均在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行,當(dāng)日不煙熏。小鼠給藥劑量參考人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表[15],每只小鼠每千克體重給藥量按人(70 kg)的等效量為中劑量,0.5倍等效量為低劑量,2倍等效量為高劑量,換算出小鼠金水六君煎低、中、高劑量分別為3.705 g/(kg·d)、7.41 g/(kg·d)、14.82 g/(kg·d),羅氟司特按照65 μg/(kg·d)的劑量給予[16]。于實(shí)驗(yàn)第61天開(kāi)始,空白組和COPD組給予等量生理鹽水灌胃,其他組給予相應(yīng)劑量藥物灌胃,均1次/d,連續(xù)14 d。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1肺功能 小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后,分離暴露氣管,進(jìn)行氣管插管固定,使用小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀測(cè)定每分鐘通氣量(MV)、呼氣峰值流速(PEF)和吸氣峰值流速(PIF)。

1.6.2肺組織病理形態(tài) 取小鼠左肺組織,于4%多聚甲醛中固定24 h,干燥脫水,石蠟包埋切片,HE染色觀察病理形態(tài)。根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法,對(duì)肺泡結(jié)構(gòu)、肺上皮細(xì)胞、管腔情況和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行肺組織病理半定量評(píng)分,按照病變情況評(píng)分0～3分,無(wú)病變?yōu)?分、輕度病變?yōu)?分、中度病變?yōu)?分、重度病變?yōu)?分,累加各項(xiàng)評(píng)分的總分作為病理評(píng)分。每只小鼠取5個(gè)視野的評(píng)分均值作為最終結(jié)果。PAS染色觀察氣道黏液及杯狀細(xì)胞,Image J(v1.53)軟件測(cè)定陽(yáng)性著色面積與氣道管壁總面積的比值,每只小鼠選取5個(gè)支氣管的測(cè)量數(shù)據(jù)均值作為最終結(jié)果。

1.6.3肺泡灌洗液中唾液酸、尿素和Muc5ac含量小鼠脫頸處死后,立即取出完整肺組織,血管夾夾閉左主支氣管,使用0.5 mL PBS溶液灌洗右肺3次,每次反復(fù)抽吸2次,回收率超過(guò)80%,4 ℃ 1 000 r/min離心10 min,收集上清液,放置在-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。參考Esther等[18]的方法,取部分肺泡灌洗液配制成含有1%濃度的甲酸溶液,并在80 ℃下孵育1 h,再利用比色法檢測(cè)各組肺泡灌洗液中唾液酸的含量,尿素選取未處理的肺泡灌洗液檢測(cè),最后計(jì)算兩者的比值。肺泡灌洗液中Muc5ac含量嚴(yán)格按ELISA說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)。

1.6.4肺組織中cAMP和V-ATP酶含量 稱(chēng)取小鼠肺組織100 mg,剪碎后放入組織研磨器(勻漿管)中,然后加入1 mL 1× PBS溶液,制成勻漿,置于-20℃過(guò)夜。經(jīng)反復(fù)凍融2次破壞細(xì)胞膜,2～8 ℃下5 000 r/min離心5 min,取上清液備用。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)cAMP和V-ATP酶含量。

1.6.5肺組織中CFTR和Foxi1 mRNA表達(dá)情況使用Trizol試劑從小鼠肺組織中提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度與純度。使用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總mRNA轉(zhuǎn)換為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR,體系30 μL,預(yù)變性條件:95 ℃ 10 min,循環(huán)條件:95 ℃變性15 s,60 ℃延伸30 s,40次循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,空白組為對(duì)照,計(jì)算2-ΔΔCT,得到目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。在NCBI上搜索目的基因的序列,運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)引物,由北京擎科合成引物,見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.6.6肺組織中CFTR和Foxi1蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):稱(chēng)取25 mg肺組織,加入300 μL RIPA裂解液,在生物樣品均質(zhì)儀中研磨為組織勻漿,冰上裂解10 min,12 000 r/min離心15 min,提取上清液,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配置SDS-PAGE凝膠,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗稀釋(CFTR 1∶1 000、Foxi1 1∶500、β-actin 1∶5 000),與膜4 ℃孵育過(guò)夜,次日室溫放置30 min,1×PBST洗膜3次,每次15 min。二抗稀釋(1∶5 000),與膜共同室溫孵育90 min,1×PBST洗膜3次,每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯影,凝膠成像系統(tǒng)成像。Image J(v1.53)軟件測(cè)定各條帶光密度值,以目的條帶光密度值比β-actin條帶光密度值代表該蛋白的相對(duì)含量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺功能指標(biāo)比較 COPD組的MV、PEF、PIF均明顯低于空白組(P均<0.05)。金水六君煎各組和羅氟司特組的MV、PEF、PIF均明顯高于COPD組(P均<0.05),且金水六君煎高劑量組和羅氟司特組的MV、PEF、PIF均明顯高于其他組(P均<0.05),金水六君煎高劑量組和羅氟司特組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺功能指標(biāo)比較

2.2各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn) 空白組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,少見(jiàn)肺泡萎縮、塌陷和融合,肺泡間隔無(wú)增厚和水腫,氣道管腔內(nèi)無(wú)脫落上皮細(xì)胞和炎性滲出物,黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整,管腔外無(wú)充血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);COPD組小鼠肺泡腔可見(jiàn)滲出,肺泡間隔明顯增厚和水腫,并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),氣道管腔內(nèi)可見(jiàn)上皮細(xì)胞脫落,管壁增厚,管腔狹窄,局部塌陷,黏膜各層可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);羅氟司特組和金水六君煎各組的上述病理改變較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺組織HE染色形態(tài)(×200)

2.3各組小鼠氣道黏液分泌和杯狀細(xì)胞增生情況PAS染色可將黏蛋白染為紫紅色,陽(yáng)性染色主要見(jiàn)于氣道黏膜表面、杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體。與空白組比較,COPD組小鼠氣道有大量杯狀細(xì)胞增生,金水六君煎各組和羅氟司特組的杯狀細(xì)胞增生減輕,其中以羅氟司特組最為顯著。見(jiàn)圖2。

圖2 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

2.4各組小鼠肺組織病理評(píng)分和氣道陽(yáng)性著色面積占比比較 COPD組的肺組織病理評(píng)分和氣道陽(yáng)性著色面積占比均明顯高于空白組(P均<0.05)。金水六君煎各組和羅氟司特組的肺組織病理評(píng)分和氣道陽(yáng)性著色面積占比均明顯低于COPD組(P均<0.05),且金水六君煎高劑量組和羅氟司特組的肺組織病理評(píng)分和氣道陽(yáng)性著色面積占比均明顯低于其他組(P均<0.05),羅氟司特組氣道陽(yáng)性著色面積占比明顯低于金水六君煎高劑量組(P均<0.05),金水六君煎高劑量組和羅氟司特組肺組織病理評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺組織病理評(píng)分和氣道陽(yáng)性著色面積占比比較

2.5各組小鼠肺泡灌洗液中唾液酸、尿素和Muc5ac含量比較 與空白組比較,COPD組的唾液酸和Muc5ac含量及唾液酸/尿素均明顯升高(P均<0.05),尿素含量明顯降低(P<0.05)。與COPD組比較,金水六君煎各組和羅氟司特組的唾液酸和Muc5ac含量及唾液酸/尿素均明顯降低(P均<0.05),尿素含量均明顯升高(P均<0.05);金水六君煎高劑量組和羅氟司特組各指標(biāo)變化更為明顯,與其他組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),但此2組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);金水六君煎低劑量組和金水六君煎中劑量組唾液酸、尿素含量和唾液酸/尿素比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但金水六君煎中劑量組中的Muc5ac含量明顯低于金水六君煎低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺泡灌洗液中唾液酸、尿素、唾液酸/尿素和Muc5ac含量比較

2.6各組小鼠肺組織中cAMP和V-ATP酶含量比較 COPD組的cAMP和V-ATP酶含量均明顯低于空白組(P均<0.05)。除金水六君煎低劑量組的cAMP含量與COPD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05),金水六君煎各組和羅氟司特組的cAMP和V-ATP酶含量均明顯高于COPD組(P均<0.05),且金水六君煎高劑量組和羅氟司特組的cAMP和V-ATP酶含量均明顯高于其他組(P均<0.05),金水六君煎高劑量組和羅氟司特組cAMP含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但金水六君煎高劑量組的V-ATP酶含量明顯高于羅氟司特組(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺組織中cAMP和V-ATP酶含量比較

2.7各組小鼠肺組織中CFTR、Foxi1 mRNA和蛋白表達(dá)情況比較 COPD組的CFTR、Foxi1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白組(P均<0.05)。金水六君煎各組和羅氟司特組的CFTR、Foxi1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于COPD組(P均<0.05),且金水六君煎高劑量組和羅氟司特組的CFTR、Foxi1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于其他組(P均<0.05);金水六君煎高劑量組的CFTR、Foxi1蛋白相對(duì)表達(dá)量與羅氟司特組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),CFTR、Foxi1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于羅氟司特組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3及表6。

圖3 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺組織中CFTR、Foxi1蛋白表達(dá)條帶

表6 空白組和慢性阻塞性肺疾病各組小鼠肺組織中CFTR、Foxi1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

COPD歸屬于中醫(yī)“肺脹”“喘證”等范疇,其病位在肺,繼則影響脾、腎,病性多屬本虛標(biāo)實(shí),痰飲始終是COPD的核心病機(jī)。肺主通調(diào)水道,通過(guò)宣發(fā)和肅降對(duì)水液的輸布、運(yùn)行和排泄進(jìn)行調(diào)節(jié),痰飲的形成與肺內(nèi)水道失于通調(diào),水津失布有關(guān),正如《醫(yī)學(xué)正傳》言:“津液粘稠,為痰為飲?！苯鹚宄鲎悦鞔鷱埦霸馈毒霸廊珪?shū)》“新方八陣·和陣”之首劑,其組方由二陳湯加熟地、當(dāng)歸而成,既可化痰理氣,又可補(bǔ)腎養(yǎng)陰,全方標(biāo)本兼顧,實(shí)有增水行痰之功效。

健康的氣道表面被覆著一薄層黏液,即氣道表面層,包括低黏度的纖毛周?chē)鷮雍透采w在纖毛表面的黏液層[19]。正常情況下,纖毛周?chē)鷮拥母叨却蠹s等于纖毛的高度(約7μm),黏液層則覆蓋在纖毛表面,纖毛周?chē)鷮映洚?dāng)有效的潤(rùn)滑層,促使黏液層在纖毛的擺動(dòng)下向咽部移動(dòng)[19-21]。但在COPD患者中,氣道表面層的水合不足和(或)黏蛋白分泌過(guò)多,纖毛周?chē)鷮咏档?黏液的黏彈性、黏附性和潤(rùn)濕性等物理性質(zhì)發(fā)生改變[22],從而潴留在氣道表面難以咳出,誘發(fā)感染、炎癥、氣流阻塞和肺功能下降。一直以來(lái),測(cè)量黏液濃度是一種反映氣道水合狀態(tài)的重要方法,但實(shí)際操作存在諸多困難。因此,本研究采用了一種替代方式[18],以唾液酸來(lái)反映氣道表面層中黏蛋白的含量,以尿素作為氣道表面層液相的標(biāo)志物,兩者比值即可反映黏液濃度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,COPD小鼠的肺功能各項(xiàng)指標(biāo)下降,肺組織炎癥評(píng)分升高,氣道管壁增厚,杯狀細(xì)胞增生,唾液酸、唾液酸/尿素和Muc5ac含量升高,尿素含量降低,提示氣道表面層水合不足和黏液高分泌,存在肺部炎癥和黏液潴留。而金水六君煎各組和羅氟司特組的以上指標(biāo)均有改善,提示氣道表面層水合增加,黏蛋白分泌減少,肺部炎癥和黏液潴留減輕。

CFTR是一種cAMP依賴(lài)的ATP門(mén)控性Cl-通道。當(dāng)CFTR被激活時(shí),Cl-會(huì)被分泌到氣道腔中,管腔表面增加的鹽濃度將產(chǎn)生滲透驅(qū)動(dòng)力,促使水被動(dòng)地通過(guò)水通道蛋白或細(xì)胞旁途徑進(jìn)入氣道,以補(bǔ)充氣道表面層的水合[23],從而促進(jìn)黏液順利排出。在本研究中,COPD組小鼠肺組織中CFTR mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低,并存在氣道黏液潴留、肺部炎癥和肺功能下降。多項(xiàng)研究亦表明[24-26],COPD患者或動(dòng)物模型中的CFTR獲得性缺陷是導(dǎo)致氣道黏液潴留和肺功能下降的重要原因,與本研究相一致。羅氟司特是首個(gè)成功在歐美等地上市用于治療COPD的磷酸二酯酶4(PDE-4)抑制劑,其可通過(guò)抑制PDE-4來(lái)增加cAMP的濃度,進(jìn)而增強(qiáng)CFTR的磷酸化以促進(jìn)其開(kāi)放。既往研究表明,羅氟司特不僅能逆轉(zhuǎn)CFTR活性的降低,還可促進(jìn)CFTR mRNA的表達(dá),以增加氣道上皮氣道表面層的水合[27-29],與本研究結(jié)果相一致。金水六君煎各組小鼠肺組織中的cAMP濃度升高,CFTR mRNA和蛋白表達(dá)增加。既往藥理研究表明,陳皮中的主要藥效成分包括橙皮苷[30]、柚皮苷[31]、川陳皮素[32]和橘皮素[33]等黃酮類(lèi)化合物均能直接或間接地激活CFTR的功能和表達(dá),引發(fā)黏膜表面Cl-電流變化。據(jù)此推測(cè),金水六君煎改善氣道黏液潴留的機(jī)制可能與增加cAMP濃度和促進(jìn)CFTR表達(dá)有關(guān),方中陳皮可能是主要的藥效成分。

肺離子細(xì)胞是近年來(lái)通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種罕見(jiàn)氣道細(xì)胞類(lèi)型,僅占小鼠氣道細(xì)胞總數(shù)的0.42%,卻表達(dá)了超過(guò)50%的CFTR,而數(shù)目眾多的纖毛細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)時(shí)只表達(dá)其中的1.5%[8]。并且這種新型肺細(xì)胞還共表達(dá)Foxi1、V-ATP酶的多個(gè)亞基和CFTR,其中Foxi1屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族,其特征在于獨(dú)特的叉頭結(jié)構(gòu)域[34]。相關(guān)研究表明,Foxi1是肺離子細(xì)胞的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子,敲除小鼠肺離子細(xì)胞中的Foxi1會(huì)導(dǎo)致CFTR表達(dá)喪失及氣道黏液生理破壞,表現(xiàn)出囊性纖維化的特征[9]。V-ATP酶是一種依賴(lài)于ATP的質(zhì)子泵,廣泛存在于真核細(xì)胞的胞膜系統(tǒng)中,涉及膜運(yùn)輸、溶酶體蛋白降解、微生物清除和離子的二次轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞過(guò)程[35]。V-ATP酶可通過(guò)穩(wěn)定溶酶體膜來(lái)維持溶酶體活性,以對(duì)抗氧化應(yīng)激,具有減輕肺損傷的作用[36]?，F(xiàn)有研究已經(jīng)確定[9,34,37-38],V-ATP酶受到Foxi1的調(diào)控,包括正確組裝和驅(qū)動(dòng)表達(dá)等多種形式。綜上可知,Foxi1基因是肺離子細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序的核心,CFTR和V-ATP酶受到Foxi1的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,COPD小鼠的Foxi1、CFTR表達(dá)和V-ATP酶含量均減少,金水六君煎各組和羅氟司特組的Foxi1、CFTR表達(dá)和V-ATP酶含量增加,提示Foxi1的減少是導(dǎo)致COPD小鼠CFTR表達(dá)和V-ATP酶減少的可能原因,而金水六君煎和羅氟司特促進(jìn)CFTR表達(dá)和增加V-ATP酶含量可能與Foxi1有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)金水六君煎可促進(jìn)CFTR表達(dá),改善氣道水合狀態(tài),減輕肺部炎癥和氣道黏液潴留,并延緩其肺功能下降,其內(nèi)在機(jī)制可能與調(diào)控Foxi1有關(guān),為金水六君煎治療COPD提供了實(shí)驗(yàn)支持,但COPD中CFTR表達(dá)的降低和金水六君煎的干預(yù)作用是否涉及肺離子細(xì)胞還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。