安東賢，姚文兵，高向東，田 浤

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室，南京 211198）

GLP-1 由小腸L 細(xì)胞分泌產(chǎn)生，經(jīng)GLP-1R 介導(dǎo)，以葡萄糖依賴的方式作用于胰島β 細(xì)胞，促進(jìn)胰島素分泌[1]，刺激β細(xì)胞的增殖和分化，抑制β細(xì)胞的凋亡，從而增加胰島β 細(xì)胞的數(shù)量[2]，抑制胰島α 細(xì)胞分泌胰高血糖素[3]，降低肝臟糖異生[4]和肝臟脂肪貯存量[5]，還能減少腸蠕動、抑制胃排空[6]、降低食欲，有助于控制攝食，減輕體重[7]。GIP由小腸K 細(xì)胞合成和分泌，與GIPR 結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8]。GIP 既可以在高血糖條件下促進(jìn)胰島素分泌，也可以在低血糖條件下促進(jìn)胰高血糖素分泌，因此可作為雙功能多肽對血糖水平進(jìn)行調(diào)控，防止血糖過度波動[9]。GIP 還能促進(jìn)糖尿病模型鼠的胰島β 細(xì)胞生長分化與存活[10]。長期使用GIP 受體激動劑或者過表達(dá)GIP 的小鼠糖代謝得到改善，且無體重增加的不良反應(yīng)[11-12]。GLP-1 和GIP 也被稱為腸促胰島素分泌肽，簡稱腸促肽[13]。目前認(rèn)為，GLP-1 和GIP 這兩種內(nèi)源性多肽發(fā)揮了餐后促胰島素分泌的大部分作用[14]，使得GLP-1R和GIPR成為了治療2型糖尿病的良好靶點。

在目前的糖尿病治療中，腸促肽類降糖藥物占據(jù)了重要地位，其中以GLP-1R 激動劑為主[15]。由于糖尿病是一種復(fù)雜的綜合代謝性疾病，針對單一靶點的治療藥物往往具有局限性，而能夠靶向多種靶點以實現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)的治療藥物不僅能使療效最大化，還能降低不良反應(yīng)[16]。禮來制藥公司研發(fā)的Tirzepatide(LY3298176)是1 周注射1 次的GLP-1R/GIPR 雙激動劑，已經(jīng)獲得FDA 批準(zhǔn)上市，用于治療2 型糖尿病。在與索馬魯肽頭對頭的臨床試驗比較中，高、中、低劑量組Tirzepatide 的降糖效果均優(yōu)于索馬魯肽[17]。在減重方面，高劑量的Tirzepatide 效果優(yōu)于索馬魯肽[18]。然而Tirzepatide和市場上絕大多數(shù)治療2 型糖尿病的受體激動劑藥物一樣，通過皮下注射給藥，降低了患者的依從性[19]。目前，丹麥諾和諾德公司研制的口服索馬魯肽（oral semaglutide，Rybelsus?）是市面上唯一一款可口服的GLP-1R 激動劑，但是其在人體內(nèi)的絕對生物利用度只有1%[20]，因此開發(fā)患者依從性較高的口服腸促肽受體激動劑具有良好的應(yīng)用前景。

本實驗室前期基于GLP-1R 激動劑Exendin-4的結(jié)構(gòu)特征，利用計算機(jī)輔助設(shè)計得到了具有降糖活性的口服GLP-1R 激動劑OHP2[21]。與口服索馬魯肽不同，OHP2 無促吸收劑單獨給藥即可被口服吸收，在糖尿病小鼠模型中表現(xiàn)出了良好的藥效，如降低血糖、減少體質(zhì)量和緩解高血脂等[22]。本研究為進(jìn)一步優(yōu)化OHP2的治療潛力，在保留了其降糖活性和口服吸收能力的基礎(chǔ)上，引入了GIP的活性位點，以期為臨床提供更多的可口服降糖多肽候選分子。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、DMEM/F-12 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胰蛋白酶、G418（美國Sigma-Aldrich公司）；胎牛血清（FBS，美國CLARK Bioscience 公司）；Exendin-4（上海吉爾生化有限公司）；OHP2（南京金斯瑞生物科技有限公司）；ODA（合肥森爾生物科技有限公司）；異硫氰酸熒光素(異構(gòu)體Ⅰ，F(xiàn)ITC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Pierce BCA 法蛋白測定試劑盒（美國Thermo Scientific 公司）；牛血清白蛋白（BSA，廣州賽國生物科技有限責(zé)任公司）；氨芐青霉素、鏈霉素、潮霉素（上海生工生物工程有限公司）；Steady-Glo?Luciferase Assay System（美國Promega 公司）；RIPA（強(qiáng)）裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.2 動 物

C57BL/6JGpt 雄性小鼠（5 周齡），SPF 級，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，合格證號：SCXK（浙）2019-0004。所有動物實驗均符合中國藥科大學(xué)動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞株

CHO-GLP-1R-Luc（A11A）細(xì)胞株、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株Caco-2 由中國藥科大學(xué)江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室保存。

1.4 儀 器

AccuriC6 Plus 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；Infinite 200Pro多功能熒光酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ERS-2 細(xì)胞電阻儀（美國Merck Millipore 公司）；血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）。

2 方 法

2.1 ODA序列設(shè)計和結(jié)構(gòu)特征

2.1.1 ODA 序列設(shè)計 基于OHP2 的結(jié)構(gòu)，引入GIP 活性位點，同時OHP2 耐酶解位點保持穩(wěn)定，得到增強(qiáng)GIP 激動活性的ODA 序列（由合肥森爾生物科技合成）。從RCSB PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www. rcsb. org）獲取Exendin-4 和GLP-1 受體胞外結(jié)構(gòu)域的PDB 文件（5OTT）、GIP 和GIP 受體胞外結(jié)構(gòu)域的PDB 文件（2QKH），利用MOE（Molecular Operating Environment）分子操作系統(tǒng)和Rosetta Design 在線設(shè)計服務(wù)系統(tǒng)（http://rosettadesign.med.unc.edu）進(jìn)行親和力打分計算。

2.1.2 圓二色光譜（CD）檢測ODA 的二級結(jié)構(gòu)使用去離子水溶解樣品至0.5 mg/mL，用圓二色光譜儀Jasco J-810，在室溫下以1 nm 分辨率，50 nm/min的掃描速度在190 ～ 250 nm 范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行檢測。

2.1.3 SWISS-MODEL 模擬ODA 的三級結(jié)構(gòu) 利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)服務(wù)器SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org）進(jìn)行同源建模，ODA 和OHP2 均以Exendin-4 為模板序列，選擇全球性模型質(zhì)量估測（GMQE）值最高的建模結(jié)果。

2.2 ODA的入胞能力研究

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)法檢測ODA 在Caco-2 細(xì)胞中的入胞能力 細(xì)胞鋪板：Caco-2 細(xì)胞密度為每毫升1 × 105個細(xì)胞。細(xì)胞給藥：每孔加入FITC 標(biāo)記的ODA 5 μg，孵育2 h。細(xì)胞清洗：獲取細(xì)胞并清洗后用200目細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾。流式細(xì)胞術(shù)檢測：經(jīng)陰性對照管確定細(xì)胞群所在位置后，檢測陰性對照管的熒光強(qiáng)度，并據(jù)此設(shè)立FITC 陰性門和FITC陽性門。

2.2.2 熒光酶標(biāo)儀法檢測ODA 在Caco-2 細(xì)胞中的入胞能力 細(xì)胞培養(yǎng)鋪板和給藥方法同“2.2.1”項。細(xì)胞裂解：每孔加入RIPA 細(xì)胞裂解液30 μL，室溫置于搖板機(jī)上350 r/min 裂解5 min。FITC 標(biāo)記ODA 含量測定：使用多功能熒光酶標(biāo)儀測定FITC 標(biāo)記的ODA 熒光強(qiáng)度，條件為激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。細(xì)胞總蛋白含量測定：BCA 試劑盒檢測每孔內(nèi)總蛋白濃度。計算每孔FITC 標(biāo)記的ODA 的含量與細(xì)胞總蛋白含量的比值。

2.3 ODA的跨膜轉(zhuǎn)運能力研究

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞鋪板：Caco-2 細(xì)胞密度為每毫升1 × 105個細(xì)胞，每孔接種單細(xì)胞懸液250 μL于Transwell上室，下室加完全培養(yǎng)基1.5 mL，培養(yǎng)21 d。細(xì)胞給藥：使用細(xì)胞電阻儀測定細(xì)胞跨膜電阻，選取跨膜電阻在200 ～ 1 000 Ω/cm2的孔[23]，在上室加入FITC 標(biāo)記的ODA（0.2 mg/mL）。孵育8 h，每隔1 小時從下室取樣100 μL，然后向下室補(bǔ)充HBSS緩沖液100 μL。

2.3.2 跨膜轉(zhuǎn)運量測定 使用多功能熒光酶標(biāo)儀測定下室中FITC 標(biāo)記的ODA 熒光強(qiáng)度，檢測條件為激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

2.4 ODA的體外生物活性研究

2.4.1 熒光素酶報告基因法評價ODA 對GLP-1R的激活能力 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10%胎牛血清、潮霉素B、G418 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)A11A 細(xì)胞。細(xì)胞鋪板：A11A 細(xì)胞密度為每毫升2 × 105個細(xì)胞，培養(yǎng)4 h。細(xì)胞給藥：ODA 初始濃度為4 800nmol/L，按4倍倍比梯度稀釋得到9個濃度，每孔加入藥物20 μL，孵育4 h。化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測定：每孔加入Steady-Glo 100 μL，350 r/min 振蕩15 min。振蕩結(jié)束后每孔吸取樣品180 μL 轉(zhuǎn)移至全白酶標(biāo)板，使用多功能酶標(biāo)儀測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

2.4.2 分子對接模擬ODA 與GIPR 結(jié)合能力 靶標(biāo)分子預(yù)處理：從RCSB PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www. rcsb. org）下載GIP 和GIP 受體胞外結(jié)構(gòu)域的PDB文件（2QKH），選擇Quick Prepare 對分子進(jìn)行加氫去水并賦予電荷，修正PDB 結(jié)構(gòu)缺陷。定義活性位點（site）以確定配體分子結(jié)合部位。配體分子預(yù)處理：通過MOE 同源建模獲得配體分子的PDB 文件，加氫去水并賦予電荷。分子對接：選擇蛋白-蛋白對接以半柔性對接方法計算結(jié)果。

2.5 ODA在小鼠體內(nèi)的降糖活性研究

2.5.1 實驗動物 選取5 周齡的C57BL/6J 雄性小鼠飼養(yǎng)一個星期適應(yīng)環(huán)境。正式實驗前小鼠需禁食16 h，并將小鼠隨機(jī)分組并稱重標(biāo)記。

2.5.2 藥物配制 3%碳酸氫鈉溶液，Exendin-4溶液（0.02 mg/mL），葡萄糖溶液（0.2 g/mL），OHP2溶液（0.424 mg/mL），ODA 溶液（0.848 mg/mL，0.424 mg/mL，0.212 mg/mL）。

2.5.3 給藥測定 陽性對照組皮下注射給藥Exendin-4 溶液（0.10 mg/kg），實驗組OHP2 溶液（0.424 mg/mL）和ODA 溶液（0.848 mg/mL，0.424mg/mL，0.212 mg/mL）用3% NaHCO3溶液稀釋4 倍，口服灌胃給藥。每組小鼠給藥時刻記為-30 min，0 min 時按2 g/kg 的劑量給每組小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，用血糖儀測量小鼠血糖值。

3 結(jié) 果

3.1 ODA序列設(shè)計和結(jié)構(gòu)特征

基于GLP-1（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG）、GIP（YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ） 、 Exendin-4（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSS -GAPPPS）和OHP2（HGEGTFTSDLSSQMEEEAVKEFIEWLVNGGPSSGAPPPSC）的分子結(jié)構(gòu)，在保留OHP2 良好的抗酶解活性以及口服GLP-1R 激動活性的前提下，通過進(jìn)一步引入GIP 的活性位點，本實驗設(shè)計了一條新型口服降糖多肽——ODA。通過Rosetta Design 評估其對GLP-1 和GIP 兩個受體的親和力，親和力強(qiáng)度與打分絕對值呈正相關(guān)。打分結(jié)果顯示，與OHP2 相比，ODA 保留了GLP 結(jié)合能力，同時提高了GIP受體親和力。（表1）。

為了得到ODA 的二級結(jié)構(gòu)信息，本實驗對ODA 的CD 譜進(jìn)行分析。如圖1-A 所示，與Exendin-4 和OHP2 的譜線相似，ODA 的譜線在193 nm附近處出現(xiàn)明顯的正峰，在208 nm 和222 nm 處出現(xiàn)2 個負(fù)峰，表明這3 種分子的二級結(jié)構(gòu)以α 螺旋為主。此外，ODA 的譜線向短波長方向移動，即發(fā)生藍(lán)移，表明ODA 的疏水性增加，親水性降低。提示ODA 有較好的親脂性，能夠較容易地與細(xì)胞膜產(chǎn)生接觸。

Table 1 Affinity values of ODA and related peptides for GLP-1R and GIPR

本實驗通過SWISS-MODEL 模擬預(yù)測ODA 的三級結(jié)構(gòu)，由于序列的同源相似性，ODA 和OHP2的三級結(jié)構(gòu)模擬均以Exendin-4 為模板序列。Exendin-4，OHP2 和ODA 的GMQE 分別為0.71，0.73 和0.68。如圖1-B 所示，ODA 的三級結(jié)構(gòu)在突變位點處與Exendin-4，OHP2均有一定差異。

Figure 1 Determination of Exendin-4, OHP2 and ODA

3.2 ODA的胞吞能力優(yōu)于OHP2

為了評價ODA 的胞吞能力，對ODA 進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)和熒光酶標(biāo)儀法分析。如圖2-A 所示，與陰性對照Exendin-4 相比，ODA 組的FITC+細(xì)胞率顯著提高（P< 0.01）。熒光酶標(biāo)儀結(jié)果顯示，孵育2 h 后每毫克細(xì)胞總蛋白中FITC 標(biāo)記的ODA 含量（5 055.0 ± 1 299.1 ng/mg)顯著高于OHP2 組（2 836.4 ± 471.1 ng/mg)（P< 0.01）（圖2-B）。這些結(jié)果表明，在Caco-2 細(xì)胞中，ODA 比OHP2 的入胞能力更強(qiáng)。

3.3 ODA的轉(zhuǎn)胞吞能力優(yōu)于OHP2

本實驗通過Transwell法考察ODA在單層細(xì)胞模型上的跨膜轉(zhuǎn)運水平。結(jié)果如圖3-A所示，在1、2、3、4和8 h的5個采樣點，ODA組在下室中的濃度明顯高于Exendin-4 組和OHP2 組。孵育8 h 后，下室中ODA 的質(zhì)量濃度為（96.7 ± 6.3 ng/mL），顯著高于Exendin-4 組（53.6 ± 2.5 ng/mL）（P< 0.0001）和OHP2組（76.6 ± 4.3 ng/mL）（P< 0.01）（圖3-B）。這些結(jié)果顯示，在Caco-2 細(xì)胞的Transwell 單層細(xì)胞模型中，ODA具有更強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運能力。

Figure 2 Endocytosis of Exendin-4, OHP2 and ODA in Caco-2 cells

Figure 3 Transcytosis of Exendin-4, OHP2 and ODA in Caco-2 cells (± s, n = 3)

3.4 ODA保留了GLP-1R激動活性并可結(jié)合GIPR

本實驗采用熒光素酶報告基因法評估了ODA對GLP-1R 的激活能力，結(jié)果如圖4-A 所示，Exendin-4、OHP2 和ODA 均呈劑量依賴性地激活GLP-1R下游信號通路，促進(jìn)了熒光素酶的表達(dá)。OHP2和ODA 激活GLP-1R 的EC50分別為4.540 和5.506 nmol/L，雖然ODA 的EC50比OHP2 略高，但和其處在同一數(shù)量級上，表明ODA 保留了對GLP-1R的激動活性。利用MOE 將ODA 與GIPR 胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分子對接模擬，預(yù)測ODA 與GIPR 的結(jié)合模式與相互作用。結(jié)果如圖4-B 所示，GIPR 分子表面以親水親脂性展示，ODA 序列中的15Asp,16Lys,19Gln,20Lys,24Gln,26Leu 與GIPR 形成了較強(qiáng)的氫鍵，穩(wěn)定了ODA 與GIPR 的結(jié)合，提示ODA 具有潛在的GIPR激動能力。

3.5 ODA在小鼠體內(nèi)的降糖活性優(yōu)異

選取健康C57BL/6J 小鼠，通過腹腔注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT）考察口服不同劑量ODA 對血糖的控制作用，以皮下注射Exendin-4 組為陽性對照，ODA 單次口服給藥的糖耐量試驗結(jié)果如圖5-A所示，與PBS 組相比，口服高、中、低劑量的ODA后，小鼠血糖值相對于基礎(chǔ)值的偏移顯著降低，血糖時間曲線中峰值明顯變低，曲線下面積顯著減小。各組血糖時間曲線下面積計算結(jié)果顯示，高劑量組（922.6 ± 93.7 mmol/L·min）、中劑量組（1 021.9 ± 84.8 mmol/L·min）和低劑量組（1 035.1 ± 152.0 mmol/L·min）的 AUC 同樣顯著低于PBS 組（1 322.3 ± 99.5 mmol/L·min）（P<0.000 1）（圖5-B）。另一方面，口服ODA 高、中、低劑量組與口服OHP2 組（952.1 ± 81.5 mmol/L·min）相比，曲線下面積無顯著性差異。這些結(jié)果表明，口服低劑量ODA（0.53 mg/kg）能達(dá)到與口服OHP2（1.06 mg/kg）相當(dāng)?shù)慕堤撬?，提示ODA 具有較好的血糖控制能力。

Figure 4 ODA binding ability to GLP-1R and GIPR in vitro

Figure 5 IPGTT of ODA in healthy mice (± s, n = 8)

4 討 論

口服索馬魯肽是目前市場上唯一一款可口服的GLP-1R 激動劑，依賴促吸收劑N-[8-（2-羥基苯甲?；?氨基]辛酸鈉（SNAC）才能實現(xiàn)口服吸收。SNAC 可在胃部升高局部區(qū)域的pH，通過短期局部緩沖作用保護(hù)索馬魯肽防止胃蛋白酶的降解[24]。同時SNAC 具有親脂性，能夠有效地插入到上皮細(xì)胞膜中，輕微改變細(xì)胞膜的流動性，促進(jìn)索馬魯肽的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運[25]。因此SNAC 只能短暫地促進(jìn)吸收，口服索馬魯肽的絕對生物利用度依然較低，僅有0.4% ～ 1%[26]。本實驗室前期工作中設(shè)計得到的OHP2 與之相比更有優(yōu)勢，單獨給藥即有1.31%的絕對生物利用度，并且結(jié)構(gòu)簡單，無非天然氨基酸引入和側(cè)鏈脂肪酸修飾等[22]。

綜合代謝性疾病如肥胖和糖尿病等通常具有異質(zhì)性和并發(fā)性等特點，單一靶點藥物治療有一定局限性[27]。因此本研究利用RCSB PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫，MOE 和Rosetta Design 軟件在OHP2 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入了GIP的活性位點，得到新型口服降糖多肽ODA。通過CD 光譜和SWISS-MODEL 研究了ODA 的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ODA 與Exendin-4 和OHP2相比，其親水性降低，親脂性增加，三級結(jié)構(gòu)也有一定差異。通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光酶標(biāo)儀研究ODA 的入胞能力，雖然ODA 入胞的陽性細(xì)胞率小于OHP2組，但是入胞量即每毫克總蛋白中的ODA含量卻幾乎是OHP2 的兩倍，結(jié)果表明ODA 的胞吞作用更強(qiáng)。并且通過Caco-2 細(xì)胞構(gòu)建Transwell單層細(xì)胞腸道吸收模型研究ODA 的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運能力，與入胞能力研究實驗結(jié)果一致，ODA 的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運量顯著高于Exendin-4 組和OHP2 組。這些結(jié)果表明ODA 的口服吸收能力顯著優(yōu)于OHP2。利用基于A11A 細(xì)胞的熒光素酶報告基因法研究ODA 對GLP-1R 的激動活性，雖然ODA 的EC50比OHP2 略高，但仍處于同一數(shù)量級，表明ODA 較好地保留了對GLP-1R 的激活能力。利用MOE 進(jìn)行了ODA 與GIPR 的分子對接，模擬了二者結(jié)合的空間狀態(tài)和相互作用，ODA 序列中多個氨基酸位點與GIPR 形成了較強(qiáng)的氫鍵，表明ODA 能與GIPR結(jié)合且較為穩(wěn)定。通過IPGTT 實驗研究ODA 在健康小鼠體內(nèi)的血糖控制能力，結(jié)果表明，口服低劑量ODA 即可發(fā)揮優(yōu)異的降糖活性，展現(xiàn)出口服ODA治療2型糖尿病的巨大潛力。

綜上所述，本研究設(shè)計得到的口服ODA 保留了OHP2 對GLP-1R 的激活能力，增強(qiáng)了與GIPR 的結(jié)合能力，從而服用小劑量ODA 即可達(dá)到降糖療效。此外，簡單的分子結(jié)構(gòu)不僅更易于工業(yè)化生產(chǎn)，還能避免過度修飾帶來的生物安全隱患。未來，口服ODA 將為糖尿病患者提供更安全、更便利、更有效的用藥選擇。