胡趙良，鄒文宇，宋 敏，杭太俊，陸宇婷

（中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009）

朱砂(Cinnabaris)是傳統(tǒng)礦物類中藥材，主含硫化汞(α-HgS > 98%)，性味甘，微寒，歸心經(jīng)。因其具有鎮(zhèn)驚安神之功效，朱砂常配伍用于兒童中成藥中，用于治療小兒高熱、小兒驚風(fēng)等[1]143?！吨腥A人民共和國藥典》（2020 版）收載了35 種含朱砂兒科制劑，如小兒驚風(fēng)散、小兒至寶丸、小兒清熱片等[1]。

汞是公認(rèn)的有毒重金屬，各種形式的汞化合物都可能造成體內(nèi)汞暴露量增高，引發(fā)毒性反應(yīng)[2]。朱砂作為含汞中藥材，不合理使用導(dǎo)致的汞中毒事件時(shí)有報(bào)道[3-5],使其安全性備受質(zhì)疑。兒童作為特殊的用藥群體，對(duì)汞化合物的毒性尤為敏感，因此含朱砂兒童專用制劑的臨床使用應(yīng)當(dāng)更為慎重。汞的毒性累及人體各個(gè)器官，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害尤甚[6]。對(duì)于處在發(fā)育階段的兒童，長期高水平的汞暴露可引起神經(jīng)發(fā)育障礙，包括記憶功能障礙、兒童自閉癥、注意力缺陷、閱讀及運(yùn)動(dòng)障礙等[7-8]。其中記憶功能障礙是兒童汞中毒后較為常見的一種表現(xiàn)，即使擺脫汞暴露，記憶功能也不易恢復(fù)[9]。

雖然朱砂的水溶性與口服生物利用度極低，毒性遠(yuǎn)小于其他形式的汞化合物，但已有研究表明，復(fù)方配伍與胃腸道消化作用能顯著增加機(jī)體對(duì)朱砂中汞的吸收，并促進(jìn)汞進(jìn)入大腦[10]。此外，兒童的血腦屏障發(fā)育不完善，更易受有害重金屬的影響[11]，極大地增加了含朱砂兒童專用制劑引發(fā)記憶功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)。

因此，本研究以幼年大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用冷原子-原子熒光光譜法(CV-AFS)測定幼鼠灌胃給予低、中、高劑量水平朱砂后不同發(fā)育階段的血汞暴露量，觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化，測試大鼠的記憶功能，并利用相關(guān)性分析揭示朱砂與記憶功能障礙間的劑量－血汞暴露量－毒性效應(yīng)關(guān)系，從而為含朱砂兒童專用制劑的臨床合理使用提供科學(xué)指導(dǎo)與理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

朱砂（鳳凰縣紅飛藥用朱砂有限責(zé)任公司，批號(hào)：20190401，硫化汞含量：98.8%，總汞含量：0.85 mg/mg，可溶性汞鹽小于0.10%，符合《中華人民共和國藥典》2020 年版一部“朱砂”項(xiàng)下的要求[1]143），汞單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：19041）。其余試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀 器

AF-640A 冷原子-原子熒光光譜儀（北京瑞利分析儀器有限公司）；AF-2型汞元素?zé)晒饪招年帢O燈；Morris 水迷宮設(shè)備、Xeye Aba V3.2 動(dòng)物行為軌跡視頻分析系統(tǒng)(北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)；正置顯微鏡（德國Leica 公司）；BS21S 分析天平（德國Sartorius 公司）。所有玻璃儀器均使用20%硝酸浸泡24 h以上，并用超純水洗凈。

1.3 動(dòng) 物

清潔級(jí)SD 幼年大鼠32 只(雌性，3 周齡，體質(zhì)量為50 ± 2 g，浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（浙）2019-0001)，在清潔級(jí)無汞環(huán)境下飼養(yǎng)，每個(gè)鼠籠4 只大鼠。飼養(yǎng)室溫度（24 ± 1）℃，相對(duì)空氣濕度40% ～ 45%，12 h/12 h 光照/黑暗交替，自由飲水?dāng)z食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)過中國藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2020-03-007），符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指導(dǎo)原則。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按體質(zhì)量隨機(jī)分為4個(gè)劑量組：對(duì)照組(C group)、朱砂低劑量組(L group)、中劑量組(M group)、高劑量組(H group)，每組8 只。根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定的朱砂最高攝入限度0.5 g/d[1]143，按人鼠間體表面積折算大鼠劑量約為50 mg/kg，設(shè)置為低劑量，該劑量的5 倍(250 mg/kg)、20倍(1 000 mg/kg)分別為中、高劑量。對(duì)照組灌胃給予0.5%CMC-Na 水溶液，朱砂組分別灌胃給予朱砂混懸液（50 mg，250 mg，1 000 mg/kg；以0.5%CMC-Na 水溶液作為混懸介質(zhì)），每日1 次，連續(xù)灌胃14周。

每日記錄大鼠體質(zhì)量、飲水量、攝食量，觀察大鼠狀態(tài)；分別于第8周、10周、12周、14周末次給藥24 h 后，眼內(nèi)眥靜脈叢取血0.3 mL 至含有肝素鈉的離心管中，混勻，置-80 ℃保存待測；于第13 周進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)；于第14 周末次給藥24 h后，腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg)麻醉大鼠，暴露胸腔，心臟灌注生理鹽水約250 mL，低溫條件下取大鼠腦組織，稱重后置于4%多聚甲醛中固定24 h。

2.2 大鼠血汞暴露量的測定

2.2.1 大鼠全血樣品前處理 取全血0.2 mL，置50 mL凱氏燒瓶中，加入HNO3-HClO4(4∶1) 5 mL，混勻，過夜。于120 ～ 140 ℃加熱消解2 h，保持微沸，必要時(shí)補(bǔ)加HNO3適量，加熱至溶液澄清透明，溶液體積約1 mL，停止加熱，放冷。用5%HNO3-0.05% K2Cr2O7轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。同法制備空白溶液。

2.2.2 冷原子-原子熒光光譜檢測條件 以2%HNO3溶液為載流；0.1%KBH4-0.2%KOH 水溶液為還原劑；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為100 r/min；PMT 負(fù)高壓為-270 V；主燈電流為30 mA；原子化器溫度為200 ℃（冷原子，低溫）；載氣氬氣流量為400 mL/min；輔助氣流量為400 mL/min；原子化器高度為7mm；連續(xù)流動(dòng)程序?yàn)椋哼M(jìn)樣(8 s)；停泵(4 s)；注入(25 s)；停泵(1 s)；以峰面積定量，峰形對(duì)稱且平滑。

2.3 大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)病理檢測

固定后的腦組織經(jīng)脫水透明，石蠟包埋后切片，切片厚度為3 μm，烘干脫蠟后進(jìn)行HE染色，對(duì)切片進(jìn)行脫水透明，用中性樹膠封片。在正置顯微鏡下觀察和拍攝。

2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)在直徑150 cm，高60 cm 的宮體中進(jìn)行，宮體被平均分為4個(gè)象限，并在第4象限（目標(biāo)象限）放置直徑為10 cm，高為30 cm 的平臺(tái)，水溫為23 ～ 25 ℃。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)過程分為連續(xù)6 d的定位航行實(shí)驗(yàn)和第7天的空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。定位航行實(shí)驗(yàn)期間，設(shè)置平臺(tái)可見，訓(xùn)練大鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶，每天訓(xùn)練2 次，每次游泳時(shí)間為90 s；空間探索實(shí)驗(yàn)期間，撤去平臺(tái)，測試大鼠的記憶能力，分別記錄90 s 內(nèi)大鼠平臺(tái)潛伏期、目標(biāo)象限潛伏期、平臺(tái)停留時(shí)間、目標(biāo)象限停留時(shí)間、目標(biāo)象限停留總時(shí)間（平臺(tái)停留時(shí)間 + 目標(biāo)象限停留時(shí)間）以及穿臺(tái)次數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以±s表示，使用SPSS 23軟件進(jìn)行兩組之間的雙尾獨(dú)立樣本Student’st-test、Spearman 相關(guān)性分析與Pearson 相關(guān)性分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 8軟件繪制結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，使用R 語言Pheatmap 包繪制相關(guān)性熱圖。

3 結(jié) 果

3.1 朱砂對(duì)幼年大鼠生長發(fā)育、體質(zhì)量及腦組織臟器系數(shù)的影響

給藥期間，各組大鼠飲水?dāng)z食正常，生長發(fā)育情況良好，未見明顯中毒癥狀。如圖1 所示，各組大鼠體質(zhì)量增長速度接近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；給藥結(jié)束后，剝?nèi)∧X組織，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)（腦重/體質(zhì)量 × 100），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 大鼠灌胃朱砂后血汞暴露量檢測

3.2.1 大鼠血汞暴露量檢測方法學(xué)驗(yàn)證 對(duì)建立CV-AFS 血汞暴露量測定方法進(jìn)行了線性、專屬性、精密度、回收率、穩(wěn)定性考察。以全血系列標(biāo)準(zhǔn)樣品熒光峰面積(Y)對(duì)血汞暴露量(C, ng/mL)進(jìn)行回歸。典型回歸方程為Y= 32.26C+ 52.86，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 6。結(jié)果表明，血汞暴露量在5 ～ 80ng/mL 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限濃度為5 ng/mL。分別配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平(10、35、60 ng/mL)的全血總汞標(biāo)準(zhǔn)樣品各6份，同法操作并測定。結(jié)果表明，本法測定大鼠血汞暴露量的專屬性良好，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測定無干擾；低、中和高濃度樣品的批內(nèi)和批間精密度良好（RSD 均小于15%）；加樣回收率在91.68% ～ 109.1%之間。全血樣品在-80 ℃冰箱冰凍保存30 d，反復(fù)凍融3次，消解結(jié)束后室溫放置2 d 的穩(wěn)定性均良好，適用于血汞暴露量的測定。

3.2.2 大鼠血汞暴露量測定結(jié)果 各組大鼠不同發(fā)育階段的全血總汞濃度如圖2 所示。正常生理?xiàng)l件下，大鼠全血總汞質(zhì)量濃度范圍在10 ～ 30ng/mL，且全血總汞濃度隨周齡增加而上升[12-13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著給藥時(shí)間延長，各劑量組大鼠血汞暴露量呈上升趨勢，在給藥10周內(nèi)，血汞暴露量顯著升高，繼續(xù)給藥2 ～ 4 周，上升速度放緩，趨于平穩(wěn)，呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。低、中、高劑量組大鼠給藥后的血汞暴露量隨朱砂劑量依次升高，并且均顯著高于對(duì)照組(P< 0.001)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

Figure 1 Effect of Cinnabaris on rats’ body weights and brain coefficients (± s, n = 8)

Figure 2 Total mercury concentration in the rats’whole blood samples at different growth phases (± s, n = 8)

3.3 朱砂對(duì)幼年大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

各組大鼠海馬CA1 區(qū)、CA3 區(qū)及DG 區(qū)HE 染色結(jié)果如圖3 所示。對(duì)照組大鼠各區(qū)域海馬錐體細(xì)胞排列整齊，層次清楚，錐體細(xì)胞核大而圓，核仁明顯、數(shù)目多；朱砂低劑量組大鼠僅CA3 區(qū)錐體細(xì)胞出現(xiàn)輕微核固縮；中劑量組大鼠海馬DG 區(qū)未見明顯病變，CA1 區(qū)、CA3 區(qū)均出現(xiàn)不同程度的錐體細(xì)胞核固縮，CA3 區(qū)較為嚴(yán)重，且錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；高劑量組大鼠DG 區(qū)同樣未見明顯病變，CA1 區(qū)、CA3 區(qū)錐體細(xì)胞核固縮程度較重、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，且CA3 區(qū)出現(xiàn)錐體細(xì)胞排列紊亂的病理改變。

3.4 朱砂對(duì)幼年大鼠記憶功能的影響

如圖4 所示，灌胃給予朱砂14 周后，與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組大鼠平臺(tái)停留時(shí)間略有縮短，平臺(tái)穿越次數(shù)減少，但無顯著差異；平臺(tái)潛伏期與目標(biāo)象限潛伏期隨朱砂給藥劑量升高而延長，相較于對(duì)照組，中劑量組大鼠平臺(tái)潛伏期有顯著差異(P< 0.05)，高劑量組大鼠平臺(tái)潛伏期與目標(biāo)象限潛伏期均有顯著差異(P< 0.05)；目標(biāo)象限停留時(shí)間與目標(biāo)象限停留總時(shí)間則隨朱砂給藥劑量升高而縮短，相較于對(duì)照組，中、高劑量組大鼠均有顯著差異(P< 0.05)。長期給予高劑量朱砂可導(dǎo)致大鼠記憶功能受損，劑量越高，對(duì)記憶功能的影響越大。

3.5 朱砂與記憶功能障礙的劑量-血汞暴露量-毒性效應(yīng)相關(guān)性分析

對(duì)給藥劑量和不同發(fā)育階段各組大鼠的血汞暴露量進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析；對(duì)各發(fā)育階段血汞暴露量與水迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5 所示。結(jié)果表明，給藥8 ～ 14 周，大鼠血汞暴露量與朱砂劑量的Spearman 相關(guān)系數(shù)分別為0.87、0.94、0.95 和0.93，呈現(xiàn)極強(qiáng)的正相關(guān)(r> 0.87,P< 0.01)。目標(biāo)象限潛伏期與給藥8周、12周、14周的血汞暴露量呈現(xiàn)弱到中等程度的正相關(guān)(0.36

Figure 3 Effects of Cinnabaris on rats’ morphological features of hippocampal pyramidal neurons by HE staining (× 200)

Figure 4 Effects of Cinnabaris on rats’ memory functions (± s, n = 8)

4 討 論

由于朱砂含有大量重金屬汞，其臨床使用安全性備受關(guān)注。歐美等國家和地區(qū)對(duì)含朱砂中藥按化學(xué)藥品重金屬雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格的總汞量控制，并警告公眾警惕其質(zhì)量不合格以及潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)[14-15]。但是從化學(xué)角度分析，朱砂屬于共價(jià)化合物，極難溶于水，不易被人體吸收，用總汞量評(píng)價(jià)朱砂難免會(huì)高估其健康風(fēng)險(xiǎn)。本組前期朱砂體外溶出研究表明，在模擬胃腸液中朱砂的生物可利用汞含量僅為0.12 μg/g[16]，在醫(yī)生指導(dǎo)下使用，相對(duì)安全。但簡單的體外實(shí)驗(yàn)不能完全模擬復(fù)雜的體內(nèi)過程，因此以體內(nèi)汞暴露量評(píng)估朱砂的汞中毒風(fēng)險(xiǎn)更為科學(xué)合理。由于體內(nèi)過高的汞暴露會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷兒童的記憶功能，而朱砂引起的兒童汞暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估卻鮮有報(bào)道，《中華人民共和國藥典》對(duì)含朱砂兒童專用制劑也缺乏明確的安全限量。因此本實(shí)驗(yàn)以幼年大鼠為對(duì)象，圍繞給予朱砂后體內(nèi)汞暴露量與記憶功能損傷展開研究，為含朱砂兒童專用制劑的合理使用提供科學(xué)指導(dǎo)。

為了監(jiān)測給予朱砂后大鼠體內(nèi)汞暴露水平，需要選擇準(zhǔn)確可靠，容易獲得的生物樣本進(jìn)行檢測。常用于評(píng)價(jià)機(jī)體汞暴露水平的生物樣本有血液、尿液和毛發(fā)[17]。本組前期研究顯示，成年大鼠灌胃朱砂后，極少量的汞能被吸收進(jìn)入血液，并分布至腦、肝、腎等組織中，并且腦組織中的汞含量隨血汞暴露量上升而增加[10]。此外，血樣可及性高、易采集，本研究選擇血液作為生物樣本，用于評(píng)估大鼠體內(nèi)的汞暴露水平。血液中95%左右的巰基存在于紅細(xì)胞，由于Hg2+對(duì)巰基有高度的親和力，可迅速結(jié)合紅細(xì)胞，同時(shí)又可與血漿蛋白結(jié)合，選擇全血作為研究汞在血液中動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的檢測對(duì)象，使得汞暴露水平監(jiān)測更加準(zhǔn)確可靠。血汞暴露量檢測結(jié)果表明，大鼠血汞暴露量呈時(shí)間和劑量依賴式增高。前期研究表明，全血與腦組織中汞均表現(xiàn)出消除緩慢的特征[10]，因此在多次給予高劑量朱砂后，汞極易在腦中蓄積，極大地增加了朱砂對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的健康風(fēng)險(xiǎn)。

海馬是大腦組織中負(fù)責(zé)記憶的關(guān)鍵區(qū)域，根據(jù)神經(jīng)元形態(tài)與排布關(guān)系，海馬通常被分為CA1、CA2、CA3和DG 區(qū)。海馬神經(jīng)元從內(nèi)嗅區(qū)發(fā)起，沿穿緣通路投射于齒狀回(dentategyrus，DG)顆粒細(xì)胞與CA1 區(qū)錐體細(xì)胞；DG 區(qū)顆粒細(xì)胞再通過苔狀纖維通路投射于CA3 區(qū)錐體細(xì)胞；最后由CA3 區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)出軸突，通過Schaffer 通路投射至CA1 區(qū)錐體細(xì)胞，由此構(gòu)成了海馬的三突觸回路。三突觸回路是記憶形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其中任何環(huán)節(jié)突觸聯(lián)系的損傷都會(huì)影響記憶功能。因此，本研究重點(diǎn)考察了各組大鼠海馬HE 染色中CA1 區(qū)、CA3區(qū)與DG 區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)變化，以評(píng)價(jià)朱砂對(duì)記憶功能相關(guān)組織結(jié)構(gòu)的影響。病理檢查結(jié)果表明，朱砂對(duì)DG 區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)影響較?。欢S著朱砂劑量增高，低劑量組大鼠腦組織CA3 區(qū)錐體細(xì)胞出現(xiàn)輕微核固縮，中、高劑量組大鼠腦組織CA1 區(qū)與CA3 區(qū)錐體細(xì)胞的病變程度依次加重，呈現(xiàn)劑量依賴性，且CA3 區(qū)較CA1 區(qū)更為嚴(yán)重。海馬組織各區(qū)域病變程度的不同可能與神經(jīng)元類型對(duì)汞暴露的敏感程度及組織內(nèi)汞局部暴露濃度差異有關(guān)。

Figure 5 Heatmap of Pearson correlation coefficients between in-vivo mercury exposure at different growth phases andevaluation indicators of Morris water-maze test (n = 8)

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果表明，朱砂低劑量組大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組大鼠無明顯差異，而朱砂中、高劑量組大鼠的平臺(tái)與目標(biāo)象限潛伏期依次延長，平臺(tái)與目標(biāo)象限停留時(shí)間依次縮短，且多數(shù)指標(biāo)與對(duì)照組大鼠有顯著差異，并呈現(xiàn)劑量依賴性。HE 染色與Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，分別從組織結(jié)構(gòu)與記憶功能的角度，共同驗(yàn)證了長期高劑量的朱砂攝入能夠引起記憶功能障礙的結(jié)論。

對(duì)朱砂和記憶功能障礙之間的劑量-血汞暴露量-毒性效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，朱砂劑量與各個(gè)發(fā)育階段的血汞暴露量之間均存在極強(qiáng)的正相關(guān)性，而血汞暴露量與水迷宮實(shí)驗(yàn)中的4個(gè)指標(biāo)都存在顯著的相關(guān)性。由此可以證明，體內(nèi)過高的汞暴露是朱砂引起記憶功能障礙的主要危險(xiǎn)因素，且記憶功能障礙程度與朱砂呈現(xiàn)出劑量－血汞暴露量－毒性效應(yīng)依賴式增加。

綜上所述，幼年大鼠長期超劑量給予朱砂后，體內(nèi)汞暴露水平增高，血液中的汞能透過血腦屏障侵入腦組織，破壞海馬組織正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響記憶功能。因此，在含朱砂兒科制劑的臨床使用過程中，應(yīng)防止超劑量長時(shí)間服用，以避免朱砂中汞對(duì)兒童大腦記憶功能的損害。