劉一靜,余科金,狄飛達,張馳松*,馮駿,方秋野

(1.成都市農林科學院,成都 611130;2.成都醫(yī)學院,成都 610500)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于動植物體內的四碳非蛋白質天然氨基酸,主要由谷氨酸(Glu)經谷氨酸脫羧酶(GAD,EC4.1.1.15)脫羧產生,是哺乳動物抑制性神經遞質[1],能夠參與多種代謝[2],起到免疫調節(jié)的作用[3]。具有降血壓[4]、調節(jié)心血管疾病[5-6]、活化肝功能、改善脂質代謝[7]、預防肥胖的功能[8]。研究表明,隨著年齡的增長以及外部環(huán)境壓力的增加,人體內的GABA含量會逐漸減少,因此在飲食中GABA的補充非常重要[9]。GABA的味道類似于谷氨酸的甜味,添加在食品中能夠增強食品的風味并具有醒酒、消臭等作用。在日本,以GABA為功能性營養(yǎng)因子的食品已經產業(yè)化,且已形成數百億日元的巨大市場規(guī)模[10]。近年來,GABA作為食品中一種新型的功能性成分[11],受到了人們的普遍關注。我國對富集GABA的豆制品和谷物類的研究也逐漸增多,曹晶晶[12]對發(fā)芽糙米進行了研究,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)芽時間的延長,GAD活性呈先升高后降低的趨勢:在發(fā)芽0～48 h內,GABA的含量增加了6倍以上;在48～60 h之間,GABA含量的增加不明顯;可以看出GABA含量受到GAD的調控。劉暢[13]的研究表明,對大豆采取不同的處理方式,GABA的含量也不盡相同,其中最重要的因素為發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間,GABA的最大含量可達到11.62 mg/g。申迎賓等[14]對5種不同豆類GABA富集的研究表明,在相同處理條件下,萌芽豇豆中GABA含量最高,達到131.36 mg/100 g,又通過響應面試驗確定了豇豆的最佳發(fā)芽工藝參數,在浸泡溫度34 ℃、浸泡時間25 h、發(fā)芽溫度33 ℃和發(fā)芽時間24 h的條件下,豇豆中GABA含量達到203.53 mg/100 g,是未發(fā)芽豇豆中GABA含量的7.48倍。

豆豉是百姓生活中經常出現(xiàn)的一種發(fā)酵豆制品,主要是通過微生物發(fā)酵,在保留大豆中大部分營養(yǎng)物質的條件下,將大豆中的大分子物質經過分解或者重組變成利于人體吸收的小分子物質,這些小分子物質多具有抗氧化活性和其他功能特性,如預防心血管疾病、抗氧化、抗癌等生理功能[2]。

本研究在將大豆進行豆豉前發(fā)酵的過程中富集GABA,觀察在整個過程中GABA的變化。通過優(yōu)化富集工藝開發(fā)出具有高GABA含量且具有功能性的豆豉,為將來功能性豆豉的開發(fā)提供了參考。

1 材料和設備

東升一號大豆:黑龍江鄉(xiāng)土農業(yè)科技開發(fā)有限公司;豆豉發(fā)酵劑:安琪酵母股份有限公司;GABA(純度>99%):上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、三氯乙酸(分析純)、乙酸(分析純)、鹽酸吡哆辛:成都市科隆化學品有限公司;β-疏基乙醇(分析純):北京瑞澤康生物科技有限公司;四硼酸鈉pH標準緩沖溶液:河南標準物質研發(fā)中心;次氯酸鈣:成都市科龍化工試劑廠。

高效液相色譜儀、Syncronis C18反相色譜柱(4.5 mm×250 mm,5 μm) 美國Thermo公司;精密可編程熱風循環(huán)烘箱 LEAD-Tech科學儀器有限公司;智能光照培養(yǎng)箱 寧波賽福實驗儀器有限公司;生物培養(yǎng)設備 深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司。

2 試驗方法

2.1 大豆發(fā)芽前處理及豆豉前發(fā)酵工藝

工藝流程:挑選籽粒飽滿無褶皺的大豆→用自來水清洗3次→用體積分數為1%的次氯酸鈣浸泡大豆10 min后用蒸餾水再次清洗大豆3次→將清洗好的大豆裝入燒杯中,加入蒸餾水浸泡,放入冰箱(4 ℃)中→將浸泡好的大豆裝入鐵盤中(上下各覆蓋3層紗布)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(30 ℃、相對濕度80%)發(fā)芽→將發(fā)芽后的大豆裝入燒杯中,放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa)→將蒸煮后的大豆按照體積分數添加豆豉發(fā)酵劑,攪拌均勻裝入漏篩→將裝入大豆的漏篩放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)→稱取大豆測量。

2.2 GABA含量的測定[15-16]

樣品前處理:樣品粉碎,過60目篩,4 ℃下保存。稱取1.5 g豆粉(含水量為80%),加入15 mL質量分數為8%的三氯乙酸,超聲波處理50 min后放入離心機中離心10 min(10 000 r/min),取上清液再次離心10 min。之后取出過0.45 μm的水相微孔濾膜,上機檢測。

HPLC色譜條件:Syncronis C18反相色譜柱(4.5 mm×250 mm,5 μm);流動相A:25 mmol/L乙酸鈉,用4%的乙酸調節(jié)pH至5.9;流動相B:純乙腈。A∶B為90∶10(體積比);流速1 mL/min;進樣量10 μL,檢測波長332 nm;柱溫40 ℃。

GABA標準曲線的繪制:在20～140 mg/dL質量濃度范圍內,用配制好的200 mg/dL的標準液配制成20,40,60,80,100,120,140 mg/dL系列質量濃度的標準液,OPA柱前衍生后上機檢測,制成標準曲線。用標準物色譜峰的保留時間定性;用外標多點校準法,以峰面積定量。采用外標面積歸一化法測得樣品含量。

2.3 富含GABA的豆豉前發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)液pH對發(fā)芽大豆GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數為1%的次氯酸鈣浸泡10 min。用蒸餾水清洗3次,分成5組,依次編號為A:pH 4.5、B:pH 5.0、C:pH 5.5、D:pH 6.0、E:pH 6.5,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡24 h,將浸泡好的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%、24 h)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.3.2 維生素B6濃度對GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數為1%的次氯酸鈣浸泡10 min,用蒸餾水清洗3次,分成5組,依次編號為A:0 mmol/L、B:1 mmol/L、C:2 mmol/L、D:3 mmol/L、E:4 mmol/L,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡24 h,將浸泡后的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%、24 h)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.3.3 浸泡時間對GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數為1%的次氯酸鈣浸泡10 min,用蒸餾水清洗3次,分成5組,依次編號為A:12 h、B:18 h、C:24 h、D:30 h、E:36 h,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡,將浸泡后的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%、24 h)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.3.4 發(fā)芽時間對GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數為1%的次氯酸鈣浸泡10 min,用蒸餾水清洗3次并分成5組,依次編號為A:12 h、B:18 h、C:24 h、D:30 h、E:36 h,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡24 h,將浸泡后的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.4 發(fā)芽處理大豆中GABA富集的正交試驗

在單因素試驗的基礎上,選取對豆豉中GABA含量有影響的培養(yǎng)液pH、發(fā)芽時間、浸泡時間為試驗因素,以GABA含量為試驗指標,分為三因素三水平,且不考慮交互作用,進行L9(34)試驗,試驗因素水平見表1,具體試驗設計見表2,試驗重復3次,結果以3次測定的平均值表示。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

表2 正交試驗設計Table 2 Orthogonal test design

3 結果與分析

3.1 GABA的高效液相色譜圖

本試驗采用高效液相色譜儀測定豆豉中GABA含量,在眾多的色譜圖中挑選兩張色譜圖,其中GABA的標準液相色譜圖見圖1,大豆的GABA液相色譜圖見圖2。

圖1 GABA標準色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of GABA

圖2 大豆GABA色譜圖Fig.2 Chromatogram of GABA in soybean

3.2 GABA標準曲線的繪制

用信號峰面積(Y)和GABA標準品濃度(X)進行線性回歸,結果見圖3。回歸方程為Y=0.109 2X+43.227 9。Y與X顯著相關,表明GABA在該濃度范圍內呈良好的線性。GABA的標準曲線見圖3。

圖3 GABA的標準曲線Fig.3 Standard curve of GABA

3.3 單因素試驗

3.3.1 培養(yǎng)液pH的影響

不同培養(yǎng)液pH下GABA含量變化情況見圖4。

圖4 不同培養(yǎng)液pH下GABA含量的變化Fig.4 Change of GABA content under different pH valuesof culture medium注:不同小寫字母表示樣品中GABA含量之間存在顯著性差異(P<0.05),下圖同。

由圖4可知,GABA含量在pH 4.5～5.0的范圍內緩慢增加,在pH 5.0～5.5的范圍內明顯增加,在pH 5.5時達到最大值141.612 6 mg/100 g;在pH 5.5～6.5的范圍內,GABA含量隨著pH的增加而減少。這可能是由于植物中GAD的最適反應pH值通常在5.5左右,在此pH值下,大豆中的酶活性最高,合成GABA含量也最高,而進一步提高pH值會使酶活力降低,降低大豆的代謝能力,從而使大豆中的GABA含量逐漸下降。因此,將最佳pH值設定為5.5左右,作為后續(xù)試驗最佳培養(yǎng)液pH值。

在最適pH的發(fā)酵過程中GABA含量變化情況見圖5。

圖5 最適pH的發(fā)酵過程中GABA含量變化Fig.5 Change of GABA content during the fermentation under the optimum pH value

由圖5可知,大豆經過浸泡和發(fā)芽后,GABA含量逐漸增加,發(fā)芽時GABA含量達到最大值141.612 6 mg/100 g,該值是未經過處理的大豆GABA含量的2.65倍。經過蒸煮和前發(fā)酵兩個過程后,發(fā)芽大豆的GABA含量趨于平穩(wěn),并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆的GABA含量無明顯影響。

3.3.2 維生素B6濃度的影響

不同維生素B6濃度下GABA含量變化情況見圖6。

圖6 不同維生素B6濃度下GABA含量的變化Fig.6 Change of GABA content under different vitamin B6 concentrations

由圖6可知,在0～3 mmol/L范圍內,隨著維生素B6濃度的不斷增加,豆豉中GABA的含量也不斷升高,并在濃度為3 mmol/L時GABA含量達到最大值126.881 0 mg/100 g;在3～4 mmol/L范圍內,隨著維生素B6濃度的增加,豆豉中GABA含量逐漸降低。因此,將最佳維生素B6濃度設定為3 mmol/L。磷酸吡哆醛是谷氨酸脫羧酶的輔酶,而維生素B6又是磷酸吡哆醛類似物,所以維生素B6具有促進谷氨酸脫羧酶活性的作用,可用維生素B6代替磷酸吡哆醛來促進GABA的積累。相關文獻報道,在豇豆中添加維生素B6,濃度達到3 mmol/L時,豇豆中GABA含量最高,這與本試驗結果相似。

在最適維生素B6濃度的發(fā)酵過程中GABA含量變化情況見圖7。

由圖7可知,大豆的GABA含量在浸泡和發(fā)芽后逐漸增加,并在發(fā)芽階段達到最大值126.881 0 mg/100 g,是未經過處理的大豆GABA含量的2.37倍。大豆中GABA含量曲線在發(fā)芽至前發(fā)酵的過程中趨于平緩,并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆GABA含量無明顯影響。

3.3.3 浸泡時間的影響

不同浸泡時間下GABA含量的變化情況見圖8。

圖8 不同浸泡時間下GABA含量的變化Fig.8 Change of GABA content under different soaking time

由圖8可知,在12～18 h范圍內,隨著浸泡時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量變化不明顯;在18～24 h范圍內,隨著浸泡時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量也逐漸升高。在浸泡24 h時豆豉中GABA的含量達到最大值121.453 3 mg/100 g,是未經過處理的大豆中GABA含量的2.28倍;在24～30 h范圍內,隨著浸泡時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量逐漸降低;在30～36 h范圍內,豆豉中GABA的含量隨著浸泡時間的延長又逐漸升高。大豆浸泡時間過長導致大豆膨脹過度,不利于大豆后期的生長,為后期發(fā)芽和制作毛霉型豆豉帶來困難。因此,根據GABA含量確定最佳浸泡時間為24 h,并將其作為后續(xù)試驗的最佳浸泡時間。相關文獻報道,隨著浸泡時間的不斷延長,大豆的吸水率也在逐漸增加,并在浸泡24 h時大豆吸水率達到最大,此時大豆完全吸收水分,將干物質轉化為可溶性物質,提高了大豆的代謝活性。在此階段,大豆的GABA含量達到最大值。當浸泡時間過長時,大豆細胞中的易溶性物質浸出,阻斷了GABA的合成通道,并將原有積累的GABA分解,此時大豆的 GABA含量又逐漸下降。

在最適浸泡時間的發(fā)酵過程中GABA含量變化情況見圖9。

圖9 最適浸泡時間的發(fā)酵過程中GABA含量變化Fig.9 Change of GABA content during fermentation underthe optimum soaking time

由圖9可知,大豆經過浸泡和發(fā)芽處理后,GABA含量逐漸增加,并在發(fā)芽末期達到最大值121.453 3 mg/100 g,是未經過處理的大豆GABA含量的2.28倍。大豆中GABA含量在發(fā)芽至前發(fā)酵的過程中趨于平緩,并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆GABA含量無明顯影響。

3.3.4 發(fā)芽時間的影響

不同發(fā)芽時間下GABA含量的變化情況見圖10。

圖10 不同發(fā)芽時間下GABA含量的變化Fig.10 Change of GABA content under different germinating time

由圖10可知,在12～24 h范圍內,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量也在不斷升高,并在發(fā)芽24 h時豆豉中GABA含量達到最大值128.630 0 mg/100 g,是未經過處理的大豆中GABA含量的2.41倍;在24～30 h范圍內,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,豆豉中GABA含量逐漸降低;在30～36 h范圍內,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,豆豉中GABA含量逐漸升高?？紤]到36 h后大豆芽生長過長,為后期制作毛霉型豆豉帶來困難,因此,根據GABA含量確定最佳發(fā)芽浸泡時間為24 h,并將其作為后續(xù)試驗的最佳發(fā)芽時間。在發(fā)芽中期,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,GABA的合成速率逐漸加快,同時底物中谷氨酸含量也在逐漸增加,使得GABA含量在此過程中達到最大值;在發(fā)芽末期,隨著大豆體內代謝的進行和發(fā)芽時間的不斷延長,大豆體內微生物大量繁殖。同時,GABA的分解速度加快,谷氨酸底物含量逐漸下降,這些因素都不利于GABA的富集,所以GABA含量在達到最大值后開始下降。

最適發(fā)芽時間的發(fā)酵過程中GABA含量的變化情況見圖11。

圖11 最適發(fā)芽時間的發(fā)酵過程中GABA含量變化Fig.11 Change of GABA content during fermentation underthe optimum germinating time

由圖11可知,大豆的GABA含量在浸泡和發(fā)芽后逐漸增加,并在發(fā)芽階段達到最大值128.630 0 mg/100 g,是未處理的大豆GABA含量的2.41倍。大豆GABA含量的變化在發(fā)芽到前發(fā)酵的過程中趨于平緩,并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆GABA含量無明顯影響。

3.4 正交試驗設計結果與分析

按照表2中的正交試驗方案制備樣品,并測定樣品中GABA含量,按照正交試驗設計方案計算極差,結果見表3,RA>RB>RC,因此影響豆豉富集GABA的主次順序為培養(yǎng)液pH值(A)>發(fā)芽時間(B)>浸泡時間(C),最佳組合為A2B2C2。

表3 正交優(yōu)化試驗結果Table 3 Orthogonal optimization test results

由表4可知,利用方差分析對自由度、均方、F比值和顯著性等指標進行綜合分析可得出結論:豆豉中GABA含量隨試驗條件的變化而變化,并且在5%的顯著水平下,由計算可知,FA>F0.01(2,4)=18.000,則認為培養(yǎng)液pH值對試驗結果有極顯著影響;FB

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

4 結論

在豆豉富集GABA的工藝中,以GABA含量為指標,研究了培養(yǎng)液pH、發(fā)芽時間、浸泡時間和維生素B6濃度對豆豉中GABA富集的影響,同時對富集GABA的條件進行優(yōu)化,最后得到豆豉產品。通過單因素試驗,并對試驗數據進行分析可知,培養(yǎng)液pH值為5.5時,豆豉中GABA含量可達到最大值141.612 6 mg/100 g,是未經過處理的豆豉GABA含量的2.65倍;發(fā)芽時間為24 h時,豆豉中GABA含量可達到最大值128.630 0 mg/100 g,是未經過處理的豆豉GABA含量的2.41倍;浸泡時間為24 h時,豆豉中GABA含量可達到最大值121.453 3 mg/100 g,是未經過處理的豆豉GABA含量的2.28倍;維生素B6濃度為3 mmol/L時,豆豉中GABA含量可達到最大值126.881 0 mg/100 g,是未經過處理的豆豉GABA含量的2.37倍。通過正交試驗數據可得出結論:富含GABA的豆豉最佳前處理工藝條件為培養(yǎng)液pH值5.5、發(fā)芽時間24 h、浸泡時間24 h、維生素B6濃度3 mmol/L,此時豆豉中GABA的富集量為139.724 4 mg/100 g,是未經處理的大豆GABA含量的2.62倍。利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析整個發(fā)酵過程數據可得,在制作豆豉的過程中,蒸煮、發(fā)酵對豆豉中GABA含量無明顯影響(P>0.05),最終豆豉產品的GABA含量為139.724 4 mg/100 g,是未經過處理的豆豉中GABA含量的2.62倍。