吳儒龍，劉鈺馨，梁澤升，廖梁燕，李媛媛

（南寧師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，廣西天然高分子化學(xué)與物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

淀粉是一種天然高分子材料，主要來(lái)源于植物，屬于可再生資源。淀粉分子[1]有直鏈和支鏈兩種分子，前者通過(guò)α-1,4糖苷鍵連接，后者通過(guò)α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接。淀粉具有多種優(yōu)異性能，如可生物降解、價(jià)格低廉易獲取以及良好的生物相容性，在生物醫(yī)藥、化工和食品生產(chǎn)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[2]。但淀粉還存在著諸多不足，如木薯天然淀粉糊化溫度低，顆粒表面滑，沒(méi)有孔洞[3,4]。在很大程度上限制了它的應(yīng)用。為了充分利用和發(fā)揮淀粉的優(yōu)良性質(zhì)，拓寬其應(yīng)用范圍，需要對(duì)淀粉進(jìn)行改性處理。目前，改性淀粉的制備方法主要有化學(xué)、物理、生物和復(fù)合改性法，用酶改性淀粉是一種環(huán)保有效的生物改性方法。利用生物催化反應(yīng)可顯著降低淀粉的分子量，且具有酶用量少、速度快、無(wú)污染的特點(diǎn)[5]。近幾年國(guó)內(nèi)外對(duì)木薯淀粉的酶改性研究較多，已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。Kewalee等[6]用化學(xué)法和生物法對(duì)木薯淀粉進(jìn)行改性，酶改性木薯淀粉表面被侵蝕產(chǎn)生許多大淺孔，鹽酸水解淀粉則呈表面粗糙小圓形顆粒。鹽酸改性后淀粉結(jié)晶度增大。Jairo等[7]對(duì)木薯淀粉通過(guò)酶促修飾，酶改性淀粉顆粒外部受到腐蝕并降解，改性后結(jié)晶度增加，糊化溫度隨結(jié)晶度的增加而升高。蔡敏[8]使用復(fù)合酶對(duì)木薯淀粉進(jìn)行酶解，α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比為1:3時(shí)，淀粉表面具有很多微小孔。從淀粉酶改性后顆粒形貌來(lái)看，結(jié)果差異較大，可能是使用淀粉品種和酶源不同。本文研究不同酶協(xié)同處理木薯淀粉制備酶改性木薯淀粉，通過(guò)掃描電鏡（SEM）、X射線衍射（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、偏光顯微鏡（PLM）研究酶改性木薯淀粉的顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)、酶解過(guò)程、球晶結(jié)構(gòu)、晶型及基團(tuán)等結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為木薯淀粉酶改性機(jī)理研究和木薯淀粉的應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料及試劑

木薯淀粉（食品級(jí)，直鏈含量17.4wt%，含水量13wt%），廣西南寧市明陽(yáng)生化股份有限公司；α-淀粉酶（BR，酶活力3.8×104U/g），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；糖化酶（BR，酶活力1.0×105U/g），上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（食品級(jí)），河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；檸檬酸（分析純），萍鄉(xiāng)市白獅化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；磷酸氫二鈉（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉（分析純），天津市鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及儀器

SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MS-H280-Pro加熱型磁力攪拌器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；59XC-PC偏光顯微鏡，上海光學(xué)儀器一廠；DZF-6050真空干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；TESCAN MIRA掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN公司；D8 Advance X射線衍射儀，德國(guó)Bruker公司；iS10紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；Q20差示掃描量熱儀，美國(guó)TA公司

1.3 試樣的制備

精確稱取20 g的木薯淀粉加入到250 mL三角瓶中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值至5.0，溫度50 ℃，配置成濃度為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的淀粉乳液。在恒溫水浴鍋中預(yù)熱15 min，然后加入一定淀粉干基質(zhì)量x%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的混合酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)12 h后，加入10 mL 4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)。然后離心將沉淀進(jìn)行抽濾，用去離子水洗3～4次，最后放入50 ℃烘箱中干燥12 h，粉碎過(guò)200目篩后即可得到改性木薯淀粉。

1.4 表征及測(cè)試

1.4.1 偏光顯微鏡（PLM）測(cè)試

將淀粉樣品調(diào)配成一定濃度的淀粉乳，用移液槍量取少量于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于偏光顯微鏡下，采用400倍放大倍數(shù)觀察淀粉樣品球晶形貌并拍照。

1.4.2 掃描電子顯微鏡（SEM）測(cè)試

將試樣在真空干燥箱40 ℃干燥4 h后，用雙面導(dǎo)電膠固定在掃描電鏡專(zhuān)用的載物臺(tái)上，取少量淀粉樣品于導(dǎo)電膠上，置于真空條件下噴金處理后，將載物臺(tái)放入樣品室進(jìn)行觀察并拍照，掃描電鏡電壓設(shè)置為5.0 kV。

表1 改性淀粉試樣配方Table 1 Modified starch sample formula

1.4.3 傅氏變換紅外光譜儀（FT-IR）測(cè)試

將淀粉試樣壓片后采用全反射ATR模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，掃描波長(zhǎng)范圍為400～4 000 cm-1，掃描分辨率2 cm-1。

1.4.4 X射線衍射（XRD）測(cè)試

將淀粉試樣在5～40o范圍步寬為0.02o在40 kV電壓和25 mA電流進(jìn)行測(cè)試。XRD數(shù)據(jù)通過(guò)Jade6軟件分峰擬合計(jì)算得到淀粉結(jié)晶度。

1.4.5 差示掃描量熱法（DSC）測(cè)試

稱取3 mg試樣至坩堝鋁盤(pán)中，加入9 μL去離子水加蓋密封。放入溫度為15 ℃，濕度為70%的恒溫恒濕箱中平衡24 h。在氣流量為50 mL/min的氮?dú)鈿夥罩幸?0 ℃/min升溫速率，從40 ℃升溫到100 ℃條件下進(jìn)行測(cè)試。并用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算得到關(guān)于熔融焓和熔融溫度顯著性分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018制圖，SPSS 26方差分析，試驗(yàn)結(jié)果為三次測(cè)量平均值，數(shù)據(jù)使用ˉx±s表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 淀粉顆粒形態(tài)分析

圖1為天然木薯淀粉和不同酶用量水解淀粉顆粒的SEM照片。從圖1（a～e）發(fā)現(xiàn)天然淀粉顆粒表面光滑，顆粒飽滿。從圖1（b、c、d，f、g、h）可以看出，酶處理過(guò)的淀粉顆粒減小，表面被大面積侵蝕，有大量凹坑。酶用量為1%時(shí)，淀粉顆粒表面出現(xiàn)大量的小而淺凹坑。酶用量增加到2%，顆粒表面進(jìn)一步被水解，侵蝕面積增大。酶用量達(dá)到4%時(shí)，淀粉顆粒表面被腐蝕更加嚴(yán)重，凹坑變深。α-淀粉酶和糖化酶水解木薯淀粉，酶侵蝕主要發(fā)生在淀粉顆粒表面[9]。

圖1 不同酶用量作用下淀粉的SEM圖Fig.1 SEM of starch by different enzymes content

圖2顯示天然和不同酶配比水解淀粉顆粒的SEM照片。天然淀粉顆粒圓形或半截球形，表面光滑，而水解淀粉顆粒表面被大面積侵蝕，出現(xiàn)凹陷。隨糖化酶用量的增加，淀粉顆粒被腐蝕而破碎的程度越高，原因在于糖化酶不僅能作用于α-1,4-糖苷鍵，也能緩慢水解支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵。但沒(méi)有出現(xiàn)較深的孔隙，可能是木薯淀粉存在光滑表面以及顆粒之間和顆粒內(nèi)的適合酶催化作用的位點(diǎn)較少，酶無(wú)法進(jìn)入內(nèi)部進(jìn)行水解，從而產(chǎn)生較少的深孔[10]。

圖2 不同酶比例作用下淀粉的SEM圖Fig.2 SEM of starch bydifferent enzymes proportions

圖3為天然木薯淀粉和不同酶種類(lèi)水解淀粉顆粒的SEM照片。SEM顯微照片顯示，天然淀粉顆粒圓形或半截球形，表面光滑，酶水解的淀粉顆粒都有不同程度的破碎，顆粒表面及內(nèi)部被嚴(yán)重侵蝕，淀粉顆粒內(nèi)部已經(jīng)形成中空結(jié)構(gòu)。α-淀粉酶主要水解淀粉的無(wú)定形區(qū)域，糖化酶主要水解淀粉的結(jié)晶區(qū)域[11]。隨著酶用量的增加及改變酶配比，淀粉的結(jié)晶區(qū)域也受到酶水解形成中空結(jié)構(gòu)。淀粉顆粒外殼還保持著較好的形態(tài)。塊根淀粉外層結(jié)構(gòu)排列緊密，酶無(wú)法直接進(jìn)入淀粉內(nèi)部進(jìn)行水解[12]。淀粉顆粒的表面與內(nèi)部具有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，是淀粉顆粒酶改性過(guò)程的第一道屏障[13]。蛋白酶對(duì)淀粉表面蛋白去除有明顯效果[14]，可增加酶和淀粉的結(jié)合位點(diǎn)，更利于酶的水解，因此增加酶用量以及改變酶配比對(duì)水解淀粉起到明顯作用。

圖3 不同酶種類(lèi)作用下淀粉的SEM圖Fig.3 SEM of starch bydifferent types of enzymes

2.2 晶體形態(tài)分析

圖4顯示天然和不同酶用量水解淀粉的偏光照片。圖4a～e可看出，天然淀粉顆粒形態(tài)完整，呈圓形。在正交偏光下觀察到天然淀粉球晶雙折射現(xiàn)象十分明顯，出現(xiàn)大量十字消光現(xiàn)象。圖4（b～f、c～g、d～h）可以看到，在不同酶量的作用下，淀粉顆粒在透射偏光下，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)受到破壞，在正交偏光觀察下發(fā)現(xiàn)，這些顆粒十字消光現(xiàn)象減弱或消失。隨著酶用量的增加，淀粉結(jié)晶區(qū)也受到酶作用而被破壞。

圖4 不同酶用量作用下淀粉的偏光圖(400×)Fig.4 Polarizing micrographs of starch by different enzymes content (400×)

圖5為不同酶配比水解淀粉晶體的照片。圖5（a～e）天然淀粉顆粒形態(tài)完整，呈球形。在正交偏光觀察下天然淀粉球晶雙折射現(xiàn)象明顯，偏光十字完整。從圖5（b～f、c～g、d～h）可以看到在不同酶配比的作用下，隨著糖化酶配比的增加，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)受到破壞，顆粒凹陷。在正交偏光觀察下發(fā)現(xiàn)，這些顆粒十字消光現(xiàn)象減弱或消失。隨著糖化酶配比的增加，凹陷顆粒數(shù)量增多。

圖5 不同酶比例作用下淀粉的偏光圖(400×)Fig.5 Polarizing micrographs of starch by different enzymes proportions (400×)

圖6顯示了天然和不同酶種類(lèi)水解淀粉顆粒的偏光照片。圖6（a～d）天然淀粉顆粒形態(tài)完整，在正交偏光下淀粉球晶雙折射現(xiàn)象十分明顯。從圖6（b～e、c～f）可以看出在不同酶種類(lèi)的作用下，淀粉顆粒在偏光下觀察到淀粉顆粒結(jié)構(gòu)受到破壞，圖3（b～e、c～f）的掃描電鏡圖也顯示了淀粉顆粒中心被酶解，剩下外部結(jié)構(gòu)的殼而形成的空腔。在正交偏光觀察下發(fā)現(xiàn)，淀粉顆粒偏光十字現(xiàn)象減弱甚至消失。

圖6 不同酶種類(lèi)作用下淀粉的偏光圖(400×)Fig.6 Polarizing micrographs of starch by with different types of enzymes

2.3 基團(tuán)分析

如圖7所示為不同酶用量作用下木薯淀粉的紅外光譜圖。酶改性后的木薯淀粉在3 397 cm-1的峰屬于-OH的伸縮振動(dòng)；在2 932 cm-1出現(xiàn)一個(gè)中等強(qiáng)度的峰是-CH2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；1 648 cm-1附近的吸收峰為無(wú)定形區(qū)域H2O的彎曲振動(dòng)；在1 455 cm-1附近的吸收峰是-CH2彎曲振動(dòng)；1 417 cm-1和1 370 cm-1附近吸收峰分別歸屬為-CH2彎曲振動(dòng)和-CH彎曲振動(dòng)。1 340 cm-1附近的吸收峰是-CH2彎曲振動(dòng)以及C-O-H彎曲振動(dòng)；1 157 cm-1附近的吸收峰歸屬于C-O和C-C鍵的伸縮振動(dòng)；1 080 cm-1附近的吸收峰是C-H的彎曲振動(dòng)；1 019 cm-1附近的吸收峰歸屬于C-O伸縮振動(dòng)以及C-OH彎曲振動(dòng)；931 cm-1附近的吸收峰是α-1,4糖苷鍵(C-O-C)的骨架振動(dòng)[15]。在4 000～400 cm-1的整個(gè)光譜范圍內(nèi)，Kumar等[16]紅外峰進(jìn)行的歸屬相類(lèi)似，沒(méi)有新的吸收峰出現(xiàn)，說(shuō)明酶改性的淀粉仍具有原來(lái)的基本官能團(tuán)。

圖7 不同酶用量作用下木薯淀粉的紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectra of the treated cassava starch with different enzymes content

2.4 晶型分析

天然木薯淀粉和酶改性后木薯淀粉的XRD如圖8所示。不同晶型的淀粉產(chǎn)生衍射峰的衍射角角度不同，A型淀粉晶型在15 °、17 °、18 °、20 °和23 °會(huì)出現(xiàn)衍射峰，一般在5.6 °、15 °、17 °、20 °和24 °為B型淀粉晶型[17]。在30 °～35 °出現(xiàn)的峰與淀粉酶結(jié)晶有關(guān)，C型淀粉由A型和B型轉(zhuǎn)化[18]，其衍射峰包含A型和B型的衍射峰[19]。圖8為天然淀粉和酶改性后的XRD圖，由圖可知，天然淀粉的衍射角2θ在5.6 °、15 °、17.2 °、22 °和24 °處有衍射峰，因此天然淀粉的晶型為B型。酶改性后的淀粉的衍射角2θ在5.6 °衍射峰消失，15 °、17.1 °、18 °和23 °處有衍射峰，晶型顯示為A型。晶型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型。在木薯淀粉酶解過(guò)程中，先水解淀粉顆粒中結(jié)構(gòu)松散的無(wú)定形區(qū)域[20]，增加酶用量到4%，淀粉相對(duì)結(jié)晶度達(dá)到了40.03%。其次同時(shí)增加酶用量及糖化酶比例（8%，1:7）淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)域也會(huì)受到水解[21]，淀粉結(jié)晶度增加至41.41%，可能是酶用量及糖化酶比例增加，使淀粉的無(wú)定形區(qū)域水解程度遠(yuǎn)大于結(jié)晶區(qū)域的水解程度。添加蛋白酶后，可增加酶和淀粉的結(jié)合位點(diǎn)，更利于酶的水解，結(jié)晶度從41.41%下降到37.17%。天然木薯淀粉的相對(duì)結(jié)晶度為33.38%，通過(guò)酶處理后，相對(duì)結(jié)晶度都有所提高，最高為41.41%。

圖8 天然木薯淀粉和酶改性木薯淀粉的XRD圖Fig.8 X-ray diffraction pattern of nativecassava starch and enzyme modified cassava starch

2.5 熔融焓和熔融溫度分析

用差示掃描量熱法（DSC）測(cè)定木薯淀粉經(jīng)酶處理前后的熱性能。天然木薯淀粉和酶改性后木薯淀粉的糊化曲線如圖9所示。天然木薯淀粉和酶改性木薯淀粉有明顯的熱轉(zhuǎn)變，這是因?yàn)槎及l(fā)生了糊化。天然木薯淀粉熔融峰峰形較寬，酶改性后木薯淀粉熔融峰較窄。天然木薯淀粉和酶改性后木薯淀粉酶解淀粉的DSC數(shù)據(jù)如表2所示。

圖9 天然木薯淀粉和酶改性木薯淀粉的糊化曲線Fig.9 Gelatinization curves of nativecassava starch and enzyme modified cassava starch

表2 天然木薯淀粉和酶改性木薯淀粉的DSC數(shù)據(jù)Table 2 DSC data of nativecassava starch and enzyme modified cassava starch

在酶比例（1:4）相同，酶用量（1%、2%、4%）不同條件下水解淀粉。改性前CS的Tp和ΔH分別為66.07 ℃和4.04 J/g。酶改性后CS2、CS3、CS4的Tp和ΔH分別68.94 ℃、69.14 ℃、68.58 ℃和3.74 J/g、3.74 J/g、3.76 J/g。結(jié)果顯示酶水解延緩了糊化過(guò)程，酶處理提高了熱轉(zhuǎn)變溫度。天然淀粉結(jié)晶度為33.38%，酶處理后結(jié)晶度為40.03%，表明酶水解主要發(fā)生在無(wú)定形區(qū)[20]，進(jìn)一步提高了淀粉的結(jié)晶度[22]。在酶比例（1:4），酶用量（1%、2%、4%）條件下水解，CS2、CS3、CS4的Tp和ΔH沒(méi)有顯著差異。糊化焓（ΔH）定義為破壞淀粉結(jié)晶區(qū)域中的雙螺旋結(jié)構(gòu)所需的能量。相比于天然淀粉，CS2、CS3、CS4的ΔH無(wú)顯著差異，CS2、CS3、CS4的Tp顯著差異。隨著酶用量的增加，結(jié)晶區(qū)/無(wú)定型區(qū)被破壞，結(jié)晶度增加，理論上糊化焓值增大，但DSC結(jié)果顯示糊化焓值無(wú)顯著差異。這可能跟晶體的完善程度有關(guān)，可能是無(wú)定形區(qū)的深度水解，以及結(jié)晶區(qū)被酶水解后，其雙螺旋結(jié)構(gòu)有序度降低，晶體完善程度低但結(jié)晶度增大。淀粉酶解后結(jié)晶度增加，但雙螺旋結(jié)構(gòu)有序度降低，晶體完善程度低，導(dǎo)致糊化焓值無(wú)顯著差異。

在酶量（2%）相同，酶比例（1:3、1:4、1:5.5）不同條件下水解淀粉。酶改性后CS1、CS3、CS5的Tp和ΔH分別69.05 ℃、69.14 ℃、69.23 ℃和4.05 J/g、3.74 J/g、4.14 J/g。隨著酶比例的增大，酶改性淀粉的Tp升高，Tp從改性前的66.07 ℃升高到69.23 ℃。結(jié)果表明糖化酶比例增加，酶改性淀粉結(jié)晶度從37.58%提高到39.84%。淀粉的水解程度也會(huì)增大，這與王偉健等[23]研究結(jié)果一致。在酶量（2%）相同，酶比例（1:3、1:4、1:5.5）不同條件下水解淀粉，CS5的Tp與CS1、CS3有顯著差異。CS1、CS3、CS5的ΔH與天然淀粉相比無(wú)顯著差異。隨著糖化酶用量的增加，結(jié)晶區(qū)/無(wú)定型區(qū)被破壞，結(jié)晶度增加，糊化焓值理論上會(huì)增大，但DSC結(jié)果顯示糊化焓值無(wú)顯著差異。淀粉酶解后結(jié)晶度增加，但雙螺旋結(jié)構(gòu)有序度降低，晶體完善程度低，導(dǎo)致糊化焓值無(wú)顯著差異，這與前文得到結(jié)論一致。

在酶量（8%）和酶比例（1:7）相同，酶種類(lèi)不同（蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶和α-淀粉酶、糖化酶）條件下水解淀粉。酶改性后CS6、CS7的Tp和ΔH分別68.29、68.73 ℃和4.06、3.69 J/g。結(jié)果顯示增大酶用量以及改變酶配比，改性淀粉的Tp和ΔH都增大。添加蛋白酶后Tp增大，ΔH無(wú)顯著差異。CS6的ΔH較天然淀粉無(wú)顯著變化，酶處理后影響到結(jié)晶區(qū)域雙螺旋結(jié)構(gòu)，可能是雙螺旋結(jié)構(gòu)的降低，但雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)展有序程度較高，形成高度有序的晶體結(jié)構(gòu)[24]，結(jié)晶度也有所提高。添加蛋白酶后，結(jié)晶度較CS6有所下降。蛋白酶對(duì)淀粉表面蛋白去除有明顯效果[14]，可增加酶和淀粉的結(jié)合位點(diǎn)，有利于酶水解，無(wú)定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)水解程度增加，相對(duì)結(jié)晶度減少。

3 結(jié)論

通過(guò)酶對(duì)木薯淀粉進(jìn)行改性研究，發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶和糖化酶用量及糖化酶配比較低時(shí)，對(duì)木薯淀粉顆粒表面進(jìn)行水解。隨著α-淀粉酶和糖化酶用量的增加、糖化酶配比增大和添加蛋白酶后，木薯淀粉表面及內(nèi)部都受到水解，形成中空結(jié)構(gòu)，淀粉顆粒的十字消光現(xiàn)象減弱甚至消失。α-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶處理并未使淀粉分子形成新的官能團(tuán)，而是影響淀粉分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)以及分子鏈的排列，使其結(jié)晶度增加，晶型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型。酶改性延緩了淀粉糊化過(guò)程，提高了糊化溫度。研究結(jié)果表明不同酶用量、酶配比和酶種類(lèi)會(huì)對(duì)木薯淀粉顆粒表面和內(nèi)部進(jìn)行酶解，并造成不同結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)有助于揭示酶對(duì)木薯淀粉的改性作用機(jī)理，并為深入研究木薯淀粉的應(yīng)用提供理論依據(jù)。