林香，任天宇，周梅蘭，高瑞麗，鄒雄，劉忠群，肖曄，謝曦，王蓉，宋彥廷，胡文婷*

（1.海南大學(xué)藥學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?570228）（2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

當(dāng)機(jī)體受到外源性或內(nèi)源性氧化物質(zhì)的刺激時(shí)，自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)遭到破壞，從而引起活性氧（ROS）堆積[1]。過量富集的ROS攻擊細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，造成氧化損傷[2]。外源性補(bǔ)充抗氧化劑可以幫助有效清除多余的自由基，預(yù)防或減緩ROS引起的氧化應(yīng)激造成的傷害。據(jù)報(bào)道，多種合成抗氧化劑具有一定的潛在毒性和致癌作用，因此尋找天然來源的抗氧化劑受到研究者越來越多的關(guān)注[3-6]。海藻中生物活性化合物豐富，是獲得天然抗氧化物質(zhì)的重要來源之一[7]。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）屬于綠藻門中蕨藻屬，是一種高蛋白、高膳食纖維、低脂肪、低熱能，且富含礦物質(zhì)的天然優(yōu)質(zhì)藻類食品[8,9]。目前，在我國的福建、海南等地，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻人工養(yǎng)殖處于逐步推廣階段[10,11]。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在原產(chǎn)地日本民間被稱作“長(zhǎng)壽藻”，成分分析表明其含有豐富的多糖、酚類、不飽和脂肪酸及蕨藻紅素、β-胡蘿卜素等抗衰老和抗氧化物質(zhì)[12,13]?，F(xiàn)代藥理作用研究顯示，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)多種與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的疾病，如炎癥、心血管疾病、糖尿病、肥胖癥，均有潛在的治療作用，能夠提高機(jī)體抗氧化水平，是極具開發(fā)潛力的藥食兼用藻類資源[14,15]。然而，針對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的抗氧化活性及氧化應(yīng)激損傷保護(hù)效應(yīng)的研究仍鮮有報(bào)道，有待對(duì)其深入研究。

肝臟是人體重要的代謝器官，肝細(xì)胞中含有大量的線粒體，受到氧化應(yīng)激容易形成過量的ROS堆積，使細(xì)胞遭到嚴(yán)重的氧化損傷[16,17]。近年來許多研究表明，氧化應(yīng)激可能是多種肝病，包括脂肪肝、肝炎、肝纖維化和肝癌等共同發(fā)病機(jī)制[18]。阻斷氧化應(yīng)激是緩解肝臟疾病發(fā)生的有效途徑之一。H2O2是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，易透過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)鐵離子結(jié)合產(chǎn)生高活性的自由基，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS，而且易于獲得，是氧化應(yīng)激模型中最常用的氧化劑之一[19]。本研究測(cè)定了長(zhǎng)莖葡萄蕨藻水提物（CLE）中總多糖、總?cè)?、總多酚和總黃酮含量[20-22]，考察CLE對(duì)自由基的清除作用，并采用H2O2誘導(dǎo)L02人肝細(xì)胞構(gòu)建氧化損傷模型，從細(xì)胞水平探討CLE緩解氧化應(yīng)激的能力，為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻用于干預(yù)氧化應(yīng)激相關(guān)疾病以及功能性食品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CPY-180二氧化碳培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；AE31AEFL-INV倒置熒光顯微鏡，廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；MultiskanFC酶標(biāo)儀，美國BiotekIntruments；Centrifuge 5430R低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf；MaXterile47高壓滅菌鍋，日本Hirayama；UV1800紫外可見分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司；FJ200-S高速分散勻質(zhì)機(jī)，星源科技有限公司。

RPMI1640培養(yǎng)液，上海碧艾；胎牛血清，上海煊翎；CCK-8試劑盒、0.25%胰蛋白酶消化液、青鏈霉素混合液，武漢賽維爾；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，Biosharp；還原型谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測(cè)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測(cè)試劑盒，南京建成；活性氧ROS檢測(cè)熒光探針DHE，江蘇凱基生物；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣品與細(xì)胞株

正常人肝L02細(xì)胞，海南大學(xué)藥學(xué)院生化藥物實(shí)驗(yàn)室保存。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻，由海南文昌龍樓淇水灣養(yǎng)殖場(chǎng)提供。取新鮮的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻用流水沖洗，除去其他雜質(zhì)，濾干。以1:1（g/mL）的比例加入純水，高速分散勻質(zhì)機(jī)破碎，室溫放置2 h，4 ℃靜置過夜，雙層紗布過濾，6 000 r/min離心20 min，上清通過截留分子量為1 000 u的透析袋，凍干，即得長(zhǎng)莖葡萄蕨藻水提物干粉，放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CLE中總多糖、總?cè)?、總多酚及總黃酮含量測(cè)定

1.3.1 總多糖含量測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用蒽酮-硫酸法[23]測(cè)定CLE中總多糖含量，在0.01～0.06 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=9.205 7X+0.133 5（R2=0.991）。結(jié)果換算為每克干基中所含的多糖相當(dāng)于葡萄糖的毫克數(shù)。

1.3.2 總?cè)坪繙y(cè)定

以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-濃硫酸法[24]測(cè)定CLE中總?cè)坪?，?.004 6～0.092 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=4.759 9X+0.220 1（R2=0.992 1）。結(jié)果換算為每克干基中所含的三萜相當(dāng)于齊墩果酸的毫克數(shù)。

1.3.3 總多酚含量測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林-酚法[25]測(cè)定CLE中總多酚含量，在0.012～0.192 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=4.77 6X+0.066 7（R2=0.999 8）。其中Y為吸光度，X為濃度，結(jié)果換算為每克干基中所含的多酚相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)。

1.3.4 總黃酮含量測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[26]測(cè)定CLE中總黃酮含量，在0.08～0.48 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.338 5X+0.001 9（R2=0.999 3）。結(jié)果換算為每克干基中所含的黃酮相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)。

1.4 抗氧化活性檢測(cè)

1.4.1 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

在Chen等[27]的方法基礎(chǔ)上略作修改。在3 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH值8.4）中加入0.2 mL樣品，25 ℃反應(yīng)10 min，在相同溫度下，加入12 μL預(yù)熱的30 mmol/L鄰苯三酚溶液反應(yīng)4 min，然后快速在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度記為A1；以蒸餾水代替樣品，測(cè)定吸光度記為A2；Tris-HCl緩沖液記為A0。以同濃度抗壞血酸（Vc）溶液作為陽性對(duì)照。清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：

C1——超氧陰離子清除率，%；

A0——Tris-HCl緩沖液在320 nm波長(zhǎng)處的吸光度；

A1——樣品在320 nm波長(zhǎng)處的吸光度；

A2——以蒸餾水代替樣品在320 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.4.2 羥自由基清除能力測(cè)定

羥自由基清除的測(cè)定參考Li等[28]和朱月等[29]的方法并稍作改進(jìn)。取不同濃度的樣品溶液1 mL，分別加入1 mL硫酸亞鐵（6 mmol/L），1 mL水楊酸-無水乙醇（6 mmol/L），1 mL H2O2（6 mmol/L），渦旋混勻，37 ℃恒溫水浴15 min，測(cè)定510 nm吸光度，記為A1；以蒸餾水代替樣品，測(cè)定吸光度記為A0；以蒸餾水代替水楊酸-無水乙醇，測(cè)定吸光度記為A2。以Vc作為陽性對(duì)照，對(duì)羥自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

式中：

C2——羥自由基清除率，%；

A3——以蒸餾水代替樣品在510 nm處測(cè)定的吸光度；

A4——樣品在510 nm處測(cè)定的吸光度；

A5——以蒸餾水代替水楊酸-無水乙醇在510 nm處測(cè)定的吸光度。

1.5 CLE對(duì)氧化損傷細(xì)胞增殖的影響

1.5.1 不同濃度CLE對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞，用胰酶消化后加入1640培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞個(gè)數(shù)為每孔5×103個(gè)接種于96孔板，在含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含有5%血清1640培養(yǎng)基配制的不同濃度的CLE（0.0、22.5、45.0、90.0、180.0 μg/mL），培養(yǎng)8 h后去掉上清液，

采用CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.5.2 H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞，胰酶消化后以每孔5×103個(gè)的濃度，接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入用含有5%血清的1640培養(yǎng)基配置的H2O2溶液，終濃度分別為 0（空白組）、200、400、600、800、1 000 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)8 h，采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，確定H2O2的最適濃度。

1.5.3 CLE對(duì)氧化損傷L02細(xì)胞的保護(hù)作用

取對(duì)數(shù)期L02細(xì)胞調(diào)整濃度至每孔5×103個(gè)，每孔100 μL接種于96孔板。隨機(jī)分為5組，包括對(duì)照組、H2O2組（400 μmol/L）、H2O2+22.5 μg/mL CLE組、H2O2+45.0 μg/mL CLE組和H2O2+90.0 μg/mL CLE組。待細(xì)胞貼壁后，用5%血清的1640培養(yǎng)基配制不同濃度的藥物。對(duì)照組添加含有5%血清的1640培養(yǎng)基，H2O2培養(yǎng)組加入含有400 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基，H2O2+CLE組用400 μmol/L H2O2與不同質(zhì)量濃度的CLE（22.5、45.0、90.0 μg/mL）同時(shí)處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

在相同條件處理下設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，將96孔板中各組培養(yǎng)的細(xì)胞上清液去掉?？瞻捉M、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加入用含有5%血清的1640培養(yǎng)基100 μL（含有10%的CCK8溶液），在含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置2 h，在450 nm處測(cè)量各組吸光度，其中空白組的吸光度值記為OD0，實(shí)驗(yàn)組記為OD1，對(duì)照組記為OD2，細(xì)胞存活率按公式（3）計(jì)算。

式中：

L——細(xì)胞存活率，%；

OD0——空白組在450 nm處的吸光度值；

OD1——實(shí)驗(yàn)組在450 nm處的吸光度值；

OD2——對(duì)照組在450 nm處的吸光度值。

1.7 細(xì)胞上清液中LDH、AST、ALT水平檢測(cè)

采用試劑盒對(duì)細(xì)胞泄露的LDH、AST、ALT進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置對(duì)照組、H2O2培養(yǎng)組（400 μmol/L）、H2O2+低濃度CLE組（22.5 μg/mL）、H2O2+高濃度CLE組（45.0 μg/mL）和CLE（45.0 μg/mL）組，將L02細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁之后給藥處理細(xì)胞后培養(yǎng)8 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按照試劑盒的說明檢測(cè)。

1.8 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

將L02細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁之后按照1.7節(jié)分組給藥處理細(xì)胞后，去除培養(yǎng)液，用PBS清洗L02細(xì)胞，按照試劑盒說明，加入用無血清的1640培養(yǎng)液稀釋的DHE熒光探針，37 ℃孵育30 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察拍照，用ImageJ軟件分析各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，以對(duì)照組計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.9 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH水平檢測(cè)

將L02細(xì)胞接種于6孔板中，按1.7節(jié)給細(xì)胞分組和給藥后收集細(xì)胞，按照試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)，BCA法蛋白定量。

1.10 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Prism 9.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD），多樣本間采用one way-ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 CLE中總多糖、總?cè)啤⒖偠喾蛹翱傸S酮含量

由表1可知，CLE中總多糖的含量最高，為205.01 mg/g，其次是總?cè)坪涂偠喾?，并且含有一定的總黃酮成分。已有較多研究表明，海藻中富含多糖、萜類和酚類等活性物質(zhì)，是其作為自由基清除劑發(fā)揮作用以及預(yù)防生物體氧化損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)[30]。Jesumani等[31]從馬尾藻中提取得到的多糖和多酚，均具清除羥自由基作用。梁惠等[32]研究表明凹頂藻萜提取物表明具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可有效阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力。李靜等[33]從大葉藻提取得到的大葉藻黃酮可有效清除羥自由基。另外，有研究表明，以乙醇為溶劑對(duì)冷凍干燥后的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻進(jìn)行提取，獲得的醇提物總酚含量為2.04 mg/g[34]，黃酮類化合物的含量為4.93 mg/g[35]。本研究以水為溶劑獲得的提取物中含有豐富的水溶性多糖成分和一定的萜類物質(zhì)，而且總多酚（27.02 mg/g）和總黃酮（15.72 mg/g）的含量均高于醇提物。

表1 CLE中總多糖、總?cè)?、總多酚及總黃酮含量Table 1 Contents of total polysaccharides, total triterpenes,total phenols and total flavonoids of CLE

2.2 CLE的抗氧化活性

生物體內(nèi)的氧自由基是含有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)，其中最主要、最具破壞性的是羥自由基和超氧陰離子自由基。在生物系統(tǒng)中，酶的正常催化過程或氧化壓力下產(chǎn)生的超氧陰離子自由基是自由基連鎖反應(yīng)的啟動(dòng)者，促使其他類型自由基的形成，引發(fā)各種生理和病理過程，如衰老、癌變等[36]。羥自由基是氧自由基中最活潑的自由基，去除羥自由基對(duì)于防止機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA和核酸等化合物的損傷至關(guān)重要。自由基清除劑可以保護(hù)細(xì)胞免受或減緩自由基引發(fā)的氧化損傷。由圖1可知，CLE具有清除超氧陰離子和羥自由基的能力，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)的清除能力均強(qiáng)于相同濃度的Vc。在0.5～3.0 mg/mL的范圍內(nèi)，CLE對(duì)超氧陰離子和羥自由基的清除能力隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)，在1.0～3.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除能力低于Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，CLE對(duì)超氧陰離子和羥自由基清除率分別達(dá)到69.30%和77.05%。通過曲線擬合得到CLE對(duì)超氧陰離子和羥自由基的IC50值分別為0.94、2.20 mg/mL。陳琳琳等[37]以不同方法從長(zhǎng)松藻、鐵釘菜和鼠尾藻獲得的提取物對(duì)羥自由基具有明顯的清除作用。邵海艷等[38]研究了總狀蕨藻水溶性成分的抗氧化活性，當(dāng)質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基的清除率為70.86%。Fauziee等[39]從喇叭藻提取得到褐藻糖膠，質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子和羥自由清除率分別是8.9%和53.4%。本研究以長(zhǎng)莖葡萄蕨藻水提物為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其在低濃度下即對(duì)羥自由基和超氧陰離子均表現(xiàn)出良好的清除能力。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻有較強(qiáng)的抗氧化活性，具有開發(fā)成天然抗氧化產(chǎn)品的潛力。

圖1 CLE對(duì)超氧陰離子（a）和羥自由基（b）的清除能力Fig.1 The scavenging capacity of CLE for superoxide anion (a)and hydroxyl radical (b)

2.3 不同濃度的CLE對(duì)L02細(xì)胞存活率影響

采用CCK8法研究CLE對(duì)L02細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果見圖2。在CLE質(zhì)量濃度為0.0～180.0 μg/mL范圍內(nèi)，其細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明當(dāng)CLE的質(zhì)量濃度低于180.0 μg/mL時(shí)不影響L02細(xì)胞的增殖，對(duì)細(xì)胞無毒性。

圖2 CLE對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of CLE on the survival rate of L02 cells

2.4 CLE對(duì)H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷的影響

以0～1 000 μmol/L不同濃度的H2O2處理L02細(xì)胞8 h，結(jié)果如圖3所示，隨著H2O2濃度的升高，細(xì)胞活力逐漸下降。當(dāng)H2O2濃度為400 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞存活率為51.67%（P＜0.01）。當(dāng)濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，L02細(xì)胞的存活率僅為26.33%（P＜0.01）。H2O2濃度過高時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，不利于藥物干預(yù)對(duì)其進(jìn)行修復(fù)。因此，選擇濃度400 μmol/L為H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷的最佳濃度。

圖3 H2O2處理對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響Fig.3 The effect of H2O2 treatment on the survival rate of L02 cells

CLE對(duì)L02細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用如圖4。與對(duì)照組相比，H2O2培養(yǎng)組的存活率顯著降低，其存活率為49.81%（P＜0.01）；在經(jīng)過22.5 μg/mL、45.0 μg/mL和90.0 μg/mL的CLE干預(yù)之后，L02細(xì)胞存活率均有不同程度地回升，分別為60.87%、69.90%和62.50%，質(zhì)量濃度為45.0 μg/mL的CLE對(duì)L02細(xì)胞氧化損傷保護(hù)能力最強(qiáng)，細(xì)胞存活率與模型組相比顯著提升。當(dāng)再繼續(xù)加大CLE的質(zhì)量濃度至90 μg/mL時(shí)，對(duì)氧化損傷的L02細(xì)胞保護(hù)作用略有降低。可能是由于造模后致細(xì)胞受損，此時(shí)過多的外源物質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成較大負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致存活率出現(xiàn)下降[40]。吳偉等[41]采用H2O2致細(xì)胞氧化損傷后，低濃度枸杞多糖的保護(hù)效果優(yōu)于高濃度的枸杞多糖。梁曾恩妮等[42]研究表明圣草次苷對(duì)H2O2致HUVEC細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用未表現(xiàn)出劑量關(guān)系，隨著圣草次苷濃度的增大，保護(hù)作用有所降低。故而采用22.5 μg/mL和45.0 μg/mL的CLE作為干預(yù)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 CLE對(duì)H2O2損傷L02細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of CLE on the survival rate of H2O2-injured L02 cells

2.5 CLE對(duì)氧化損傷L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH、AST、ALT活性的影響

當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、炎癥等因素影響時(shí)，細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì)大量釋放到體液中，使細(xì)胞外LDH、AST、ALT水平急劇升高[43]。由圖5可見，與對(duì)照組相比，經(jīng)H2O2處理后，LDH活力升高至158.77%，AST和ALT活力分別升高至197.54%和328.34%（P＜0.01）。使用22.5 μg/mL和45.0 μg/mL CLE干預(yù)后，L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH活力降低到81.14%（P＜0.05）和51.16%（P＜0.01）；AST活力降到53.94%和45.64%（P＜0.01），ALT活力降到43.95%和34.41%（P＜0.01）。細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH、AST、ALT釋放量可反映出細(xì)胞氧化損傷程度。鄭峰等[44]建立H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷模型，H2O2組細(xì)胞上清液中LDH、AST、AST顯著升高，大豆異黃酮處理后，活性水平顯著降低。在王倩等[45]的研究中發(fā)現(xiàn)番茄紅素能顯著降低H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH、AST、AST酶活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究類似，H2O2誘導(dǎo)的模型組LDH、AST、ALT漏出明顯增多，CLE干預(yù)后均出現(xiàn)顯著降低，說明CLE可以緩解H2O2引起的肝細(xì)胞氧化損傷。

圖5 CLE對(duì)H2O2培養(yǎng)條件下L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH（a）、AST（b）、ALT（c）水平的影響Fig.5 Effects of CLE on LDH (a), AST (b) and ALT (c) levels in the supernatant of L02 cells cultured with H2O2

2.6 CLE對(duì)H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和GSH含量的影響

ROS是生物有氧代謝過程中產(chǎn)生的一種中間產(chǎn)物，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)通過清除氧自由基或抑制細(xì)胞氧化過程，從而保持ROS的平衡[46]。ROS作為一種常見的細(xì)胞氧化損傷標(biāo)志性因子，常用來判斷外源性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的影響情況[47]。由圖6可見，加入H2O2刺激的細(xì)胞熒光明顯增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度是正常組的2.50倍。經(jīng)CLE孵育后的細(xì)胞，分別降為模型組的68.97%、63.23%（P＜0.01），說明CLE可以抑制H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。

圖6 CLE對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響Fig.6 Effects of CLE on intracellular ROS content in L02 cells

CLE對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量的影響如圖7。H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組的細(xì)胞內(nèi)GSH水平明顯降低，MDA含量明顯升高，與對(duì)照組相比均有顯著性差異（P＜0.01）。與H2O2的誘導(dǎo)氧化損傷組相比，22.5 μg/mL和45.0 μg/mL CLE組的MDA分別降至84.71%（P＞0.05）和63.20%（P＜0.01）；細(xì)胞內(nèi)的GSH含量顯著增加，分別是模型組GSH含量的1.45和1.64倍（P＜0.01）。MDA作為體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，其含量的高低反應(yīng)出機(jī)體受到氧化損傷程度[48]。GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的非酶類抗氧化物質(zhì)，具有清除自由基、降低ROS水平和阻斷組織氧化損傷等多種生理功能[49]。細(xì)胞內(nèi)MDA和GSH的水平可以反應(yīng)細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)。杜毅超等[50]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素顯著降低L02細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量。在Ou等[51]的研究中，C-藻藍(lán)蛋白干預(yù)能夠降低四氯化碳誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)生的ROS以及MDA水平，提高GSH含量，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。本研究中，CLE干預(yù)顯著提高L02細(xì)胞內(nèi)具有還原能力的GSH含量，有效清除過多的ROS，并阻止細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，從而緩解氧化應(yīng)激、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

圖7 CLE對(duì)H2O2培養(yǎng)條件下L02細(xì)胞MDA（a）、GSH（b）含量的影響Fig.7 Effects of CLE on MDA (a) and GSH (b) content of L02 cells under H2O2 culture

3 結(jié)論

CLE中含有豐富的多糖、萜類、多酚和黃酮類活性成分，在體外對(duì)超氧陰離子和羥自由基均有一定的清除作用。CLE在質(zhì)量濃度為0.0～180.0 μg/mL的范圍內(nèi)，對(duì)正常的L02細(xì)胞活力無影響。對(duì)受到H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷的L02細(xì)胞，CLE能夠顯著提高細(xì)胞生存率。CLE使H2O2培養(yǎng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH、AST、ALT活性顯著降低，提示CLE處理能夠改善氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞膜通透性改變、減少酶類漏出。同時(shí)，CLE處理組細(xì)胞內(nèi)的ROS顯著減少，GSH含量顯著增加，MDA含量顯著降低，表明CLE能夠增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防御能力、降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，減輕ROS生成增多引起的L02細(xì)胞損傷。

綜合以上結(jié)果，CLE有較好的抗氧化能力，可增加L02細(xì)胞內(nèi)非酶類抗氧化物質(zhì)水平并抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致的膜系統(tǒng)損傷，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受能力。本研究結(jié)果展現(xiàn)了以水為溶劑獲得的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻提取物具有良好的抗氧化效果，為進(jìn)一步探索其抑制氧化應(yīng)激的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，為后續(xù)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻抗氧化功能產(chǎn)品的開發(fā)提供參考依據(jù)。