石 穎, 於江泉, 張文娟

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學科, 江蘇 揚州, 225002)

膿毒癥是一種復雜異質(zhì)性疾病,被定義為宿主對感染的反應失調(diào),引起危及生命的急性器官功能障礙[1]。膿毒癥的發(fā)病率高,全球每年約有5 000萬人罹患該病,病死率為5%～40%[2]。膿毒癥治療花費高,且目前的治療手段依然有限,世界衛(wèi)生大會和世界衛(wèi)生組織于2017年將膿毒癥列為全球衛(wèi)生優(yōu)先事項[3]。膿毒癥并發(fā)的多臟器功能障礙(MODS)是造成患者死亡的主要原因,其病理生理過程是復雜和多因素的。目前普遍認為,促炎和抗炎細胞因子失衡在MODS中起著重要作用,而失調(diào)的免疫反應是MODS病理生理學的核心。此外,細胞氧利用率降低或細胞病變性缺氧、線粒體和內(nèi)皮功能障礙以及腸道功能障礙可能是MODS的機制[4]。了解膿毒癥發(fā)病機制所涉及的生物學過程是改善結(jié)果和治療患者的重要步驟。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種重要的細胞內(nèi)細胞器,用于分泌性蛋白和跨膜蛋白的合成和組裝,負責蛋白質(zhì)的易位、蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)翻譯后修飾[5]。此外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為鈣儲存、脂質(zhì)合成和碳水化合物代謝提供了場所。某些病理條件下,如膿毒癥、創(chuàng)傷等折疊蛋白質(zhì)的需求超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力,導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)改變,進而引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERs)。在ERs的情況下,為了保護細胞,重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),細胞內(nèi)信號通路未折疊蛋白反應(UPR)開始活躍。當UPR未能擊敗ERs或ERs嚴重時,細胞功能會受損,導致細胞凋亡[6-7]。ERs與多種疾病(包括自身免疫病、感染、代謝紊亂、神經(jīng)退行性疾病以及多器官功能障礙等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對ERs的研究將有望揭示包括膿毒癥在內(nèi)的炎癥性疾病的新治療靶點。本文對ERs在膿毒癥及其并發(fā)的器官功能障礙中的可能意義,以及其作為預后標志物的潛在用途和新的治療靶點等相關(guān)研究進行了綜述,以期深入了解ERs與膿毒癥之間的關(guān)系。

1 ERs介導UPR信號通路的機制

在哺乳動物UPR中起重要作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白主要有3種,包括需肌醇酶1(IRE1)、雙鏈RNA 依賴蛋白激酶樣ER 激酶(PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6 (ATF6),見圖1。在正常細胞中,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)/免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)與這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白結(jié)合,而在ERs過程中解離,通過信號傳導共同參與炎癥、氧化應激和細胞凋亡。

圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號傳導通路圖

1.1 IRE1-XBP1

IRE1是含有蛋白激酶和細胞質(zhì)核酸內(nèi)切酶活性結(jié)構(gòu)域的雙功能酶,含有IREl α和IREl β共2種亞型,并因細胞不同,分布有所差別。在ERs過程中, BiP與IRE1分離,IRE1磷酸化激活其核糖核酸內(nèi)切酶活性,剪切下游目的基因X盒結(jié)合蛋白(XBP1) mRNA, 進一步促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解(ERAD)相關(guān)基因表達的上調(diào),促進細胞適應性生存[8]。而當ERs持續(xù)存在, IRE1還通過與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2 (TRAF2)結(jié)合,激活凋亡信號激酶-1 (ASK1), 導致c-Jun氨基末端激酶(JNK)下游的激活,促進細胞凋亡[9]。

1.2 PERK

PERK是具備胞質(zhì)蛋白絲氨酸/色氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的Ⅰ型跨膜蛋白。與IRE1一樣,在ERs的情況下, BiP從PERK中釋放,并與未折疊蛋白結(jié)合,然后通過磷酸化激活PERK。被激活的PERK直接磷酸化下游的真核細胞啟動因子2的α亞基(eIF2α), 抑制蛋白的翻譯和轉(zhuǎn)錄過程,從而緩解ERs, 促進細胞適應性生存[10]。當ERs持續(xù)存在, eIF2α的磷酸化誘導了活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)的表達上調(diào),促進C/EBP同源蛋白(CHOP)和DNA損傷誘導蛋白34 (GADD34)的活化,從而誘導細胞凋亡[11]。

1.3 ATF6

ATF6是一種Ⅱ型跨膜蛋白,在ERs過程中, BiP與ATF6分離, ATF6通過囊泡轉(zhuǎn)運從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體。在高爾基體中, ATF6進一步水解活化,產(chǎn)生活性轉(zhuǎn)錄因子ATF6f(ATF6的一個片段)。然后ATF6f遷移到細胞核,與ERs反應元件結(jié)合,并活化GRP78/94及鈣離子-三磷酸腺苷酶等ERs蛋白,有助于ERs的恢復,促進細胞適應性生存[5, 12]。當導致ERs的不良刺激持續(xù)存在, ATF6f還能激活核內(nèi)編碼CHOP的靶基因,進而誘導細胞凋亡[13]。

2 ERs與細胞凋亡、炎癥、氧化應激

如果各種UPR誘導機制不能緩解ERs, UPR可通過不同的信號通路機制誘導細胞凋亡,包括: ① CHOP信號通路。 IRE1、PERK和ATF6對CHOP的轉(zhuǎn)錄激活,在ERs誘導的細胞凋亡中起重要作用[14]。在正常情況下, CHOP低表達,而在ERs條件下, CHOP的表達均可由UPR的3條信號通路誘導,但PERK及ATF6是主要通路。 ② IRE1介導JNK通路的激活, IRE1依賴的JNK激活是激活轉(zhuǎn)錄因子CHOP和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的重要信號機制,誘導細胞凋亡和炎癥反應。③ 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12信號通路可作為ERs誘導的細胞凋亡途徑的標志。NAKAGAWA T等[15]研究表明, Caspase-12缺失的小鼠和細胞對ERs誘導的凋亡有部分抗性,但對其他凋亡刺激沒有抗性。此外, Ca2+信號也能調(diào)控ERs介導的細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)Ca2+的主要存儲場所,細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)機制是連接凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體相互作用的關(guān)鍵信號通路。大量樹突細胞、淋巴細胞凋亡被認為與膿毒癥患者高病死率密切相關(guān)。過度ERs引起的細胞凋亡,在膿毒癥發(fā)生發(fā)展以及炎癥反應惡化過程中起重要作用[5]。

ERs/UPR與炎癥相關(guān)機制密切相關(guān)。一方面, IRE1可被toll樣受體(TLRs)信號磷酸化,誘導XBP1mRNA剪接,刺激巨噬細胞產(chǎn)生促炎癥細胞因子[16]; 另一方面, TLR信號也能抑制巨噬細胞中的ATF6和CHOP[17]。研究[18-20]表明, ERs通過激活XBP1、ATF6和cAMP反應元件結(jié)合蛋白H (CREBH)等UPR因子誘導炎癥反應,而這些UPR因子上調(diào)了白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ干擾素(IFN-γ)等促炎癥因子。據(jù)報道[20], CREBH的氨基末端片段上調(diào)血清淀粉樣蛋白p組分(SAP)和C反應蛋白(CRP)等急性期蛋白,參與炎癥反應的急性期。在膿毒癥病理過程中,不受控制的炎癥和先天免疫系統(tǒng)的激活可能導致組織損傷并最終導致細胞死亡。

氧化應激是指活性氧(ROS)的產(chǎn)生與機體修復損傷能力之間的不平衡。膿毒癥使氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡,趨向于促氧化狀態(tài),其特征是產(chǎn)生過多的活性氧和活性氮,線粒體功能障礙,以及抗氧化系統(tǒng)的破壞[21]。氧化應激改變了內(nèi)皮細胞的多種功能,還誘導糖萼退化、細胞死亡、通透性增加等。氧化應激與ERs相互關(guān)聯(lián)。未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)可誘導ROS的產(chǎn)生。同樣,氧化應激會擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原狀態(tài),進而破壞正常的二硫鍵形成和適當?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊[22-23]。

3 ERs與膿毒癥

膿毒癥和膿毒性休克發(fā)病率、致死率高,可導致組織灌注不足和多器官功能衰竭。在不同的膿毒癥模型中,ERs參與了膿毒癥的進展。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁內(nèi)毒素的主要成分,參與多種炎癥性疾病。HIRAMATSU N等[24]發(fā)現(xiàn),腹腔注射LPS可引起小鼠脾、肺、肝、心等器官GRP78表達上調(diào),提示內(nèi)毒素血癥可誘發(fā)全身性ERs。SCHILDBERG F A等[25]報道, LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡, PERK作為ERs的敏感標記物,在LPS的加入后發(fā)生了顯著激活,并隨著Caspase-12、Caspase-9的裂解,最終通過激活Caspase-3導致細胞凋亡,提示ERs相關(guān)凋亡信號的激活是觸發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡的關(guān)鍵事件。

KOZLOV A V等[26]發(fā)現(xiàn), LPS可通過線粒體依賴途徑導致大鼠肝臟的功能性ER衰竭,而組織學檢查未發(fā)現(xiàn)以壞死形式對肝臟造成顯著損害。XBP1剪接的mRNA變體和GRP78 mRNA表達上調(diào),但不伴隨凋亡誘導因子(AIF)向細胞核的轉(zhuǎn)位,提示細胞進入凋亡前狀態(tài),但未發(fā)生凋亡。這說明ERs反應后,細胞可能存活,但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能可能失效。細胞凋亡和基本細胞功能障礙是膿毒癥引起多器官功能衰竭的細胞學基礎(chǔ)。因此, ERs反應可能是膿毒癥治療的重要靶點。

CHOP是ERs介導細胞凋亡的重要因子,有證據(jù)表明, CHOP在膿毒癥中作為炎癥反應的中介物。FERLITO M等[27]發(fā)現(xiàn),膿毒癥小鼠表現(xiàn)出CHOP表達增加, H2S治療通過抑制CHOP表達提高膿毒癥實驗動物模型的存活率; CHOP可能在膿毒癥的發(fā)病機制中起到炎癥反應的放大作用, H2S至少部分通過涉及Nrf2激活的機制抑制CHOP的表達。此外,包括CHOP在內(nèi)的ERs通路在LPS誘導的小鼠肺損傷中被激活,并且在CHOP基因敲除的小鼠中,經(jīng)LPS處理后的肺損傷被削弱[28]。這些結(jié)果進一步證明, CHOP介導的ERs在小鼠感染性損傷的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。KIM H J等[29]發(fā)現(xiàn),使用特定的ERs抑制劑四苯基丁酸(4-PBA)減少了LPS誘導的各種ERs標志物的增加,并減輕了小鼠的肺損傷。上述結(jié)果加深了人們對膿毒癥發(fā)病機制的認識,針對ERs的治療方案可能改善膿毒癥患者的預后。

4 ERs參與膿毒癥引起的多器官損傷過程

膿毒癥是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)常見的病因之一。在病理條件下, ERs誘導炎癥反應,炎癥反應進一步激活ERs。這種正反饋最終破壞肺組織中的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài),加劇肺組織中的炎癥應激,導致肺組織中各種免疫細胞的代謝惡化[20, 30]。KIM H J等[29]采用氣管灌注LPS建立小鼠急性肺損傷模型,經(jīng)LPS處理的小鼠GRP78、CHOP等應激相關(guān)標志物表達顯著升高,表明ERs是ARDS誘導和維持炎癥性肺損傷的重要因素。研究[31]表明, PERK信號通路可誘導肺泡上皮細胞和肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡,導致肺組織結(jié)構(gòu)損傷和功能退化。此外,在盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)誘導的ARDS大鼠肺組織中檢測到IRE1信號通路蛋白和凋亡標志物的表達增加,同時肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡率增加[32]。

缺血、再灌注(I/R)損傷是創(chuàng)傷、休克等危重疾病中常見的病理生理變化,可導致缺氧、酸中毒、自由基積累和細胞能量消耗,從而引起ERs, 影響多種蛋白質(zhì)的合成和折疊。MIYAZAKI Y等[33]報道, ERs誘導的CHOP介導通路參與心肌I/R損傷過程, CHOP缺失可減弱小鼠心肌I/R損傷中的心肌凋亡。GROOTJANS J等[34]發(fā)現(xiàn),在人類和大鼠的空腸樣本中, I/R激活了UPR并導致潘氏細胞凋亡。缺血空腸再灌注時,潘氏細胞特異性BiP染色增加。上述結(jié)果表明, ERs參與了I/R損傷相關(guān)細胞凋亡。因此,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細胞凋亡途徑的干預可能幫助減少I/R損傷。

膿毒癥?？梢鹦募∈軗p導致心力衰竭,膿毒癥性心肌病常常給治療帶來巨大困難。相關(guān)研究[35-37]表明,ERs通過PERK/CHOP、IRE1/ASK和caspase-12等信號通路促進細胞凋亡?；罨哪I素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感腎上腺素系統(tǒng)和循環(huán)中B型腦鈉肽濃度可影響這些通路,導致細胞凋亡甚至心力衰竭。同時,由于CHOP途徑釋放成纖維因子,誘導炎癥反應,心肌也可發(fā)生重塑纖維化。因此,抑制上述蛋白的表達可以通過減少細胞凋亡來治療心力衰竭。

膿毒癥引起的急性腎損傷,作為危重患者的常見病,經(jīng)常受到ICU醫(yī)生的關(guān)注。一項回顧性研究[38]在AKI患者的腎活檢中發(fā)現(xiàn)了多種ERs標記物的表達增加。RTN1A是ERs和AKI的關(guān)鍵介質(zhì),與腎損傷的嚴重程度呈正相關(guān)。此外, ERS還與肝衰竭、急性胰腺炎等多種疾病相關(guān),廣泛參與膿毒癥引起多臟器損傷的病理過程。對ERs與人類疾病,特別是危重疾病關(guān)系的研究,不僅完善了對疾病發(fā)病機制的研究,也為靶向治療提供了新的思路和方法。

5 干預ERs在膿毒癥治療中的潛在價值

ERs與許多疾病的發(fā)病機制有關(guān),因此, UPR通路可能是調(diào)節(jié)ERs及其相關(guān)疾病的重要治療靶點。一項研究[39]表明, Mdivi-1(一種喹唑啉酮衍生物)通過重建線粒體融合-裂變平衡,防止膿毒癥中的ERs的誘導,改善CD4+T細胞的凋亡。ROSEN D A等[40]發(fā)現(xiàn)Sigma-1受體(S1R)限制ERs跨膜蛋白IRE1內(nèi)切酶活性和細胞因子表達,其進一步發(fā)現(xiàn)氟伏沙明(一種對S1R具有高親和力的抗抑郁藥物)可保護小鼠免受致命膿毒性休克的影響,并抑制人血白細胞的炎癥反應,使S1R成為治療膿毒癥的可能治療靶點。CHEN X Z等[41]指出,血紅素氧合酶(HO)-1通過抑制ERS中的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP促凋亡通路,保護膿毒癥誘導的急性肺損傷,減輕肺內(nèi)細胞凋亡。HOU Y等[42]研究表明,外源性脂聯(lián)素在120 mg/kg劑量下可減弱膿毒癥大鼠內(nèi)皮細胞凋亡,證實脂聯(lián)素可通過抑制ERs IRE1α通路來緩解內(nèi)皮細胞凋亡。HONG Y P等[43]研究表明, 4-苯基丁酸(4-PBA)可降低急性胰腺炎(AP)大鼠重要器官中ERs標志物(BiP、CHOP、PREK、ATF6、IRE1)的表達,并通過調(diào)節(jié)ERs和減輕炎癥反應抑制細胞死亡,保護AP大鼠胰腺、肺、肝、腎免受損傷。因此,了解UPR各組成部分之間的相互作用,以及這些信號通路如何與炎癥和細胞凋亡相互交織,將為包括膿毒癥在內(nèi)的多種疾病提供新的治療選擇[44]。

6 小結(jié)與展望

各種原因引起未折疊蛋白堆積或Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡,可導致ERs的發(fā)生,激活保護信號通路,促進細胞功能恢復。然而,不良刺激持續(xù)存在會誘導凋亡啟動子的表達,導致凋亡的發(fā)生。因此,何時進行ERs干預和調(diào)控便成了研究的重要方面。有研究[45]發(fā)現(xiàn),經(jīng)LPS刺激的巨噬細胞,早期(5 h)可產(chǎn)生明顯的ERs, 且由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的保護機制, ERs誘導劑引起的細胞凋亡被阻止。這也正提示了適度的ERs可減輕細胞損傷,促進細胞功能恢復。因此,在膿毒癥早期,適當調(diào)控ERs, 而在后期對其引起的細胞凋亡進行適當干預,可能是將來膿毒癥治療的新方向。ERs的雙向作用及其協(xié)同炎癥反應在膿毒癥及其他相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著復雜而關(guān)鍵的作用。對ERs的發(fā)生機制和自我調(diào)節(jié)機制進行深入研究,從精準醫(yī)療的角度出發(fā),可探索疾病治療的新靶點,并采取一些有效的防治措施。