李 慧，張彥兵，解藝璇，陸 艷，相 笑，劉 珂，魏建超，李宗杰，邵東華，李蓓蓓，馬志永，邱亞峰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

TRIM32（The tripartite motif 32）作為T(mén)RIM家族中的成員之一，與TRIM家族其他成員的結(jié)構(gòu)相似，其N(xiāo)端具有典型的RBBC結(jié)構(gòu)，即一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)B-BOX結(jié)構(gòu)域、一個(gè)Cioned-coin卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，與此相連的為1個(gè)間隔片段和6個(gè)NHL重復(fù)序列[1-2]。作為一種E3泛素連接酶，TRIM分子可催化泛素（Ub）分子從E2傳遞到靶蛋白，從而使靶蛋白發(fā)生泛素化修飾。在此過(guò)程中，其N(xiāo)端的RING結(jié)構(gòu)域是必須的。已有研究表明，TRIM32依賴于RING結(jié)構(gòu)域能夠靶向多種蛋白并通過(guò)蛋白酶體途徑使之泛素化降解[3-6]?；谶@種廣泛的底物特異性，TRIM32參與多種生命活動(dòng)包括發(fā)育和分化[4,7-10]、Micro RNA的調(diào)節(jié)[4,11]、腫瘤發(fā)生過(guò)程[12-13]。

此外，現(xiàn)有的結(jié)果顯示TRIM32在先天性抗病毒過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用：1）TRIM32調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生發(fā)揮先天性抗病毒的作用，具體的機(jī)制為T(mén)RIM32通過(guò)介導(dǎo)STING的泛素化，從而顯著增強(qiáng)STING介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生[6]；2）此外，TRIM32在甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）感染過(guò)程中，能夠直接增加PB1的泛素化，通過(guò)降解PB1抑制IAV的感染[14]。

我們感興趣于豬TRIM32分子在先天性抗病毒中的作用，然而目前，對(duì)于豬源TRIM32分子的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究從豬肺臟中克隆了豬TRIM32基因，利用過(guò)表達(dá)和RNA干擾的方法探討了TRIM32分子在PRRSV感染中的作用。這些研究結(jié)果為揭示豬TRIM32在先天性抗病毒中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 293T細(xì)胞、Marc145細(xì)胞、HP-PRRSV毒株SY0608及真核表達(dá)載體p3xFlag-CMV-14都由本實(shí)驗(yàn)室保存。LATaq?高保真酶，HindⅢ/BamHⅠ限制性內(nèi)切酶，PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa 生物技術(shù)有限公司；DMEM、opti-MEM、胎牛血清、胰酶、PBS、Lipofectamine?RNAiMAX Reagent、Lipofectamine 3000、蛋白Marker均購(gòu)自Thermo公司。

1.2 基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上預(yù)測(cè)的豬TRIM32基因的序列設(shè)計(jì)引物，利用豬肺組織提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，利用LATaq高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，68℃復(fù)性30 s，72℃延伸2 min；共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min；4℃保存。將膠回收目的片段連接至pMD-18T載體，并送公司進(jìn)行測(cè)序分析，選用測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒，命名為pUC-porTRIM32。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequence

1.3 基因的真核載體構(gòu)建 根據(jù)真核表達(dá)載p3xFlag-CMV-14以及豬TRIM32中限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的特征，設(shè)計(jì)引物并在引物兩端添加合適的保護(hù)性堿基和限制性內(nèi)切酶序列（表2），以pUC-porTRIM32質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠分析。將PCR膠回收產(chǎn)物HindⅢ和BamHⅠ雙酶切。膠回收酶切產(chǎn)物后，利用T4 DNA 連接酶將酶切回收的片段與同樣酶切的載體進(jìn)行連接，16℃過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中；將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布含有Amp的LB瓊脂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，分別挑取單菌落于含有Amp的LB中，在恒溫培養(yǎng)箱里搖菌過(guò)夜后，通過(guò)菌液PCR以及質(zhì)粒酶切的方法，進(jìn)行陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定。最后，對(duì)鑒定陽(yáng)性的克隆，進(jìn)行測(cè)序分析。

表2 PCR引物序列Table 2 PCR primers sequence

1.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞或Marc145細(xì)胞鋪于細(xì)胞板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度時(shí)，利用Lipofectamine?3000試劑，將重組質(zhì)粒pFlagporTRIM32或p3xFlag-CMV-14空載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，具體步驟依據(jù)Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 RNA干擾與熒光定量PCR分析 根據(jù)猴TRIM32基因的序列，由吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成干擾RNA，利用Lipofectamine?RNAiMAX將特異的siRNA和NC轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞，具體根據(jù)脂質(zhì)體的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。于轉(zhuǎn)染后48 h后，感染HP-PRRSV（0.5 MOI），約18 h后收取細(xì)胞上清液用于TCID50分析；同時(shí)，提取細(xì)胞總RNA用于熒光定量RT-PCR分析[15]。定量PCR的引物詳見(jiàn)表3。

表3 熒光定量PCR引物Table 3 Primers for real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 豬TRIM32基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建 為了克隆豬TRIM32基因，利用RT-PCR從豬肺組織中擴(kuò)增獲得約2000 bp的基因片段（圖1A）；將PCR膠回收產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，對(duì)陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序并對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得的片段為1956 bp，與GenBank預(yù)測(cè)的序列相同。隨后，通過(guò)酶切、連接將目的片段克隆入p3xFlag-CMV-14的HindⅢ和BamHⅠ位點(diǎn)，陽(yáng)性質(zhì)粒利用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，可以切出兩個(gè)片段，分別為6300 bp和2000 bp（圖1B），陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pFlag-porTRIM32。

圖1 豬TRIM32的基因克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 The segmental amplification of porcine TRIM32 gene and construction of eukaryotic expression vector of porcine TRIM32

2.2 重組質(zhì)粒pFlag-porTRIM32的表達(dá)分析 為了驗(yàn)證重組質(zhì)粒pFlag-porTRIM32的表達(dá)，通過(guò)脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒和空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染后24 h，收獲細(xì)胞并制備蛋白樣品。利用Western blot對(duì)重組質(zhì)粒的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的樣品相比，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中，抗Flag的抗體檢測(cè)到約72 kDa的特異條帶（圖2）。

圖2 Western blot鑒定重組質(zhì)粒pFlag-porTRIM32的表達(dá)Fig.2 Analysis of expression of recombinant plasmid pFlag-porTRIM32 by Western blot

圖3 過(guò)表達(dá)豬TRIM32對(duì)HP-PRRSV感染的影響分析Fig.3 Effect of overexpression of porcine Flag-TRIM32 on HP-PRRSV infected cells

2.3 過(guò)表達(dá)豬TRIM32分子對(duì)HP-PRRSV感染的影響 實(shí)驗(yàn)室前期數(shù)據(jù)顯示PRRSV感染抑制TRIM32的表達(dá)（mRNA水平，結(jié)果未顯示），然而，TRIM32在PRRSV感染中的作用不清楚。鑒于TRIM32介導(dǎo)先天性抗病毒的作用，本研究利用PRRSV為模型，探究豬TRIM32在HP-PRRSV感染中的作用。我們利用過(guò)表達(dá)豬TRIM32分子驗(yàn)證其在PRRSV感染中的作用。Western blot的結(jié)果顯示，F(xiàn)lag-porTRIM32在Marc145細(xì)胞成功過(guò)表達(dá)，而且與Flag-vector 組相比，過(guò)表Flag-porTRIM32組，病毒結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白的表達(dá)量明顯受到抑制（圖4A）；進(jìn)一步，利用TCID50對(duì)上清液中的病毒量進(jìn)行了分析，結(jié)果同Western blot相符，與vector組相比，過(guò)表達(dá)豬Flag-TRIM32組能有效抑制HP-PRRSV的感染（圖4B）。

圖4 沉默TRIM32對(duì)HP-PRRSV感染的影響分析Fig.4 Effect of silencing of TRIM32 on HP-PRRSV infected cells

2.4 沉默TRIM32的表達(dá)對(duì)HP-PRRSV感染的影響 為了進(jìn)一步探究TRIM32在HP-PRRSV感染中的作用，我們利用Lipofectamine?RNAiMAX將猴TRIM32特異的siRNA轉(zhuǎn)染到Marc145細(xì)胞中，通過(guò)qPCR的檢測(cè)結(jié)果顯示：RNA干擾能夠有效限制TRIM32的表達(dá)（圖4A）；同時(shí)，相對(duì)于NC組，RNA干擾組的PRRSVORF7基因表達(dá)有明顯上升趨勢(shì)（圖4B）。進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行TCID50分析，結(jié)果顯示沉默內(nèi)源TRIM32的表達(dá)顯著促進(jìn)病毒的感染（圖4C），這一結(jié)果與qPCR的結(jié)果一致。

3 討論

鑒于豬TRIM32的分子還沒(méi)有克隆，本研究首先克隆了豬TRIM32分子，并將其克隆入真核表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果顯示豬TRIM32的分子量約為72 kDa，與預(yù)期的大小一致。盡管可以利用商業(yè)化的抗體（針對(duì)人TRIM32分子的抗體）進(jìn)行豬TRIM32分子的表達(dá)鑒定，但目前還沒(méi)有篩選到合適的抗體應(yīng)用豬TRIM32的表達(dá)檢測(cè)。下一步我們將根據(jù)克隆的基因序列，進(jìn)行針對(duì)豬TRIM32分子特異抗體的制備。

盡管我們?cè)谇捌诘难芯恐薪沂玖薖RRSV感染影響TRIM32在豬肺泡巨噬細(xì)胞上的表達(dá)（結(jié)果未顯示），然而，對(duì)TRIM32在PRRSV感染中的作用不清楚。我們利用過(guò)表達(dá)豬TRIM32分子揭示了TRIM32具有抑制PRRSV感染的作用。進(jìn)一步利用RNA干擾方法，沉默Marc145細(xì)胞中內(nèi)源性的TRIM32，可以顯著地增加PRRSV的感染這一研究結(jié)果揭示了TRIM32具有抗PRRSV感染的作用。已有的結(jié)果顯示TRIM32分子對(duì)多種病毒的感染具有抑制作用，包括水泡性口炎病毒（VSV）、新城疫病毒（NDV）、流感病毒（AIV）等。其中，TRIM32介導(dǎo)的抗病毒的機(jī)制包括：1）TRIM32通過(guò)STING的泛素化調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，繼而發(fā)揮抗病毒的作用；2）TRIM32直接靶向于病毒蛋白，介導(dǎo)病毒蛋白的降解。目前這個(gè)階段，豬TRIM32是如何發(fā)揮抗體PRRSV感染的作用機(jī)制，還不清楚。我們接下來(lái)的工作，將聚集于TRIM32的這些作用進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的解析。

總之，本研究成功克隆了豬TRIM32基因，并鑒定了豬TRIM32的表達(dá)，揭示了TRIM32具有抗PRRSV感染的作用。下一步，我們將聚焦于豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）上TRIM32抗PRRSV感染的機(jī)制的研究。本研究結(jié)果不僅為揭示豬TRIM32抗PRRSV感染的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，而且為進(jìn)一步理解豬TRIM32的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。