施文靜，張文考，陳麗芝，祁擁華，葉春宇，姜 偉，李楠楠，范瑞良，全為民

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業(yè)農村部漁業(yè)遙感重點實驗室，上海 200090；3.三門縣水產技術推廣站，浙江三門 317100；4.三門縣農業(yè)農村局，浙江三門 317100）

牡蠣是重要的海岸帶“生態(tài)系統(tǒng)工程師（ecosystem engineer）”之一，通過牡蠣聚集生長而形成的牡蠣礁曾經廣布于全球河口、海灣和濱海［1－3］，發(fā)揮著凈化水體［4］、營造生境［2－3，5－6］、防護岸線［1－2］、固碳［7］等生態(tài)功能。但由于過度捕撈、環(huán)境污染、生境破壞和病害等原因，過去100年來，全球約85%的牡蠣礁已經消失，野生牡蠣資源量已經下降了65%［1－2］。

20世紀90年代之前，我國南北沿海的許多河口和海灣都分布有自然牡蠣礁，但隨著人類活動的增加，絕大多數(shù)牡蠣礁已經退化或消失［8－9］。2000年以后，我國逐漸開始關注牡蠣礁的生態(tài)功能［2］，并對天津大神堂［10］、江蘇小廟洪［3－4］、河北曹妃甸［9］等地區(qū)現(xiàn)存的活體牡蠣礁的生態(tài)現(xiàn)狀進行了調查研究，結果顯示，大部分牡蠣礁礁體已經嚴重退化或消失。目前，我國對牡蠣礁的生態(tài)學調查研究還相對不足［9］，無法準確掌握我國自然牡蠣礁的地理分布和生態(tài)現(xiàn)狀，這也制約了我國海岸帶生境的保護與修復。

健跳港是浙江中部三門灣內的一條狹長而彎曲的內港，是典型的海灣型淤泥質潮汐汊道，全長約17 km，總面積16.7 km2［11］。健跳港上游灣區(qū)底部的水質較好、初級生產力較高，潮間帶遍布自然礫石，為牡蠣的附著與生長提供了適宜環(huán)境，形成以近江牡蠣（Crassostreaariakensis）和熊本牡蠣（C.sikamea）為優(yōu)勢種的自然牡蠣礁［12］，當?shù)胤Q之為蠣江灘。但近年來，由于流域開發(fā)和過度捕撈等原因，導致蠣江灘自然牡蠣礁面積減少、牡蠣資源量下降和種質退化［12］。為保護該水域牡蠣種質資源及其形成的自然牡蠣礁生境，本研究系統(tǒng)調查了蠣江灘中牡蠣的種類、資源量和幼體補充量，并分析了牡蠣的遺傳多樣性及資源量和幼體補充量的時空變化特征，以期為蠣江灘牡蠣礁的保護和修復提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點

本文研究地點位于浙江省三門縣健跳港上游灣區(qū)的蠣江灘（121°32′17″～121°32′40″E、29°00′55″～29°01′25″N）（圖1）。健跳港內潮汐為非正規(guī)半日潮，春季平均潮差為4.11 m，夏季平均潮差達4.36 m［11］。海水溫度5.2～30.1℃，鹽度3.5～15.1。蠣江灘牡蠣礁位于潮間帶低潮區(qū)，礁區(qū)上邊界和下邊界高程相差約2 m，由牡蠣聚集附著于自然礫石發(fā)育而成，成斑塊狀分布，礁區(qū)面積約0.33 km2。

圖1 健跳港蠣江灘牡蠣礁位置示意圖Fig.1 Location of Lijiangtan oyster reef in Jiantiao Bay

1.2 牡蠣資源調查

分別于2021年夏初（6月8日）和秋季（10月8日）開展蠣江灘牡蠣礁的生態(tài)現(xiàn)狀調查，兩季調查區(qū)域和站位基本一致。將牡蠣礁區(qū)按高程劃分為低礁區(qū)、中礁區(qū)、高礁區(qū)，夏初和秋季分別在每個礁區(qū)隨機布設9個和6個0.4 m×0.4 m的樣方，同一礁區(qū)不同樣方的間距大于20 m，采集每個樣方內的所有活體牡蠣作為1個樣品，裝入封口袋。另在礁體上定性采集牡蠣樣品。

采用形態(tài)學和分子生物學方法鑒定牡蠣種類，根據(jù)外殼形態(tài)可以鑒定大部分牡蠣個體，對于部分外殼形態(tài)特征較模糊的牡蠣樣本，采用線粒體16S rDNA基因序列分析確定其種類［12－14］，并據(jù)此分析牡蠣的遺傳多樣性。另從夏初調查獲取的牡蠣樣品中，每種牡蠣選取30個，使用COI通用引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATA AAGATATTGG-3′和HCO2198：5′-TAAACTTCAGGG TGACCAAAAAATCA-3′，對選取的牡蠣進行PCR擴增并送上海生工生物工程有限公司測序。通過ClustalX（Version 1.83）軟件進行多序列比對和分析，采用MEGA 11軟件確定各序列的堿基組成、多態(tài)位點及個體間遺傳距離等。采用DNASP 5.0軟件計算基于16S rDNA和COI基因片段的4種牡蠣的多態(tài)位點數(shù)（S）、變異位點數(shù)（V）、單倍型數(shù)（H）、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）等遺傳多樣性參數(shù)［13］。

在實驗室內計數(shù)每個樣品中活體牡蠣的數(shù)量，牡蠣的密度統(tǒng)計為單位面積內每種牡蠣的數(shù)量（個·m－2）。另從每個樣品中隨機抽取30個牡蠣，用數(shù)字游標卡尺測量其殼高（SH），精確至1 mm，個體數(shù)量不足30個時則全部測量。牡蠣密度數(shù)據(jù)經lg（x＋1）轉換后，采用兩因素方差分析（two-way ANOVA）方法對牡蠣密度的季節(jié)（夏初、秋季）變化和空間（高礁區(qū)、中礁區(qū)和低礁區(qū)）變化進行分析（Tukey檢驗，P＜0.05）。所有數(shù)據(jù)分析均采用Sigmaplot12.5軟件實現(xiàn)。

1.3 牡蠣補充量監(jiān)測

用3根長3.5 m、直徑10 cm的不銹鋼管垂直插入海底（插入深度約1 m），組裝成邊長0.5 m的等邊三角形實驗用附苗架。2021年6月在低礁區(qū)設置5個附苗架，附苗架平行于水邊線布置，盡量使5個附苗架處于相同高程。附苗器為15 cm（長）×15 cm（寬）×1 cm（厚）的瓷磚片。在每個附苗架中，分別在離海底0.6 m和1.6 m處水平安裝1個聚乙烯網(wǎng)片（網(wǎng)目尺寸1 cm），每個網(wǎng)片上放置1個附苗器，附苗器粗糙面朝上。牡蠣補充量于2021年6月8日開始監(jiān)測，2021年10月8日結束監(jiān)測，約15 d設為1個監(jiān)測時段，6月8日放置第1個附苗器，然后分別于6月26日、7月10日、7月27日、8月9日、8月21日、9月6日、9月21日將附苗器取下放入封口袋中帶回實驗室，并換上新的附苗器，10月8日取回最后一個附苗器。實驗室內，用解剖鏡檢驗和計數(shù)每個附苗器粗糙面附著的牡蠣稚貝數(shù)量，并換算為牡蠣補充量（個·cm－2）。每次從每個實驗潮區(qū)牡蠣稚貝樣品中隨機取30個，采用上述分子生物學方法鑒定其種類。牡蠣補充量數(shù)據(jù)經lg（x＋1）轉換后采用兩因素方差分析（two-way ANOVA）方法分析牡蠣補充量的時間變化和空間變化（Tukey檢驗，P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 牡蠣種類和遺傳多樣性

牡蠣樣品的16S rDNA基因測序結果表明，蠣江灘牡蠣礁中分布有6種牡蠣，分別是近江牡蠣、熊本牡蠣、福建牡蠣（C.angulata）、香港牡蠣（C. hongkongensis）、貓爪牡蠣（Talonostrea talonata）和長牡蠣（C.gigas）。

前4種常見牡蠣的16S rDNA和COI基因片段的堿基組成結構均呈現(xiàn)出A＋T明顯高于C＋G、C的比例最低的特點（表1）。2種基因片段不同之處在于堿基A和T占比不同，在16S rDNA基因片段中，A與T的占比相差不大，而在COI基因片段中，T的占比明顯高于A的占比（表1）。4種牡蠣的遺傳多樣性見表2。

表1 4種牡蠣16S rDNA和COI基因片段堿基組成Tab.1 Base com position of 16S rDNA and COI gene fragments of 4 oyster species（%）

表2 基于16S rDNA和COI基因片段的4種牡蠣遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity of 4 oyster species based on 16S rDNA and COI gene fragments

2.2 牡蠣資源量及其時空變化

定量生態(tài)調查僅采集到3種牡蠣（表3）。在數(shù)量上，熊本牡蠣占絕對優(yōu)勢，香港牡蠣和近江牡蠣的占比均較低（表3）。由高礁區(qū)至低礁區(qū)，熊本牡蠣的占比和出現(xiàn)頻率總體上逐步下降，而近江牡蠣和香港牡蠣的占比和出現(xiàn)頻率總體上逐步上升（表3）。

表3 蠣江灘定量調查中3種牡蠣的數(shù)量、占比和出現(xiàn)頻率Tab.3 Number，percentage and frequency of 3 oyster species in quantitative sam pling at Lijiangtan oyster reef

蠣江灘中3種牡蠣的密度均呈現(xiàn)顯著的季節(jié)變化（熊本牡蠣：F＝90.817，P＜0.001；近江牡蠣：F＝13.622，P＜0.001；香港牡蠣：F＝26.474，P＜0.001）和空間變化（熊本牡蠣：F＝4.378，P＝0.019；近江牡蠣：F＝16.956，P＜0.001；香港牡蠣：F＝19.333，P＜0.001）。

熊本牡蠣的密度夏初高礁區(qū)顯著高于低礁區(qū)，秋季3個礁區(qū)間無顯著差異；在同一礁區(qū)，秋季熊本牡蠣密度均顯著高于夏初（圖2-A）。近江牡蠣密度在中礁區(qū)和低礁區(qū)均為秋季顯著高于夏初（圖2-B）。香港牡蠣密度夏初低礁區(qū)顯著高于高礁區(qū)，秋季3個礁區(qū)的高低排序為：高礁區(qū)＜中礁區(qū)＜低礁區(qū)；在中礁區(qū)和低礁區(qū)，香港牡蠣密度秋季顯著高于夏初（圖2-C）。

圖2 夏初和秋季蠣江灘熊本牡蠣（A）、近江牡蠣（B）、香港牡蠣（C）和總體（D）密度的時空變化Fig.2 Spatial-temporal changes in densities of Crassostrea sikamea（A），C.ariakensis（B），C.hongkongensis（C）and total（D）oysters at Lijiangtan oyster reef in early summer and autumn

夏初蠣江灘牡蠣平均總密度為（97±40）個·m－2，秋季牡蠣平均總密度為（1 770±467）個·m－2。牡蠣總密度具有顯著的季節(jié)變化（F＝69.566，P＜0.001），但空間變化不顯著（F＝0.508，P＝0.606），礁區(qū)和季節(jié)之間沒有互作效應（F＝0.660，P＝0.522）。在同一礁區(qū)，牡蠣總密度秋季均顯著高于夏初（圖2-D）。

圖3顯示了夏初和秋季蠣江灘牡蠣礁牡蠣（整體）殼高-頻率分布。夏初牡蠣殼高范圍為6～87 mm，平均為35 mm，稚貝（殼高＜20 mm）比例為19.42%；秋季牡蠣殼高范圍為2～77 mm，平均為21 mm，稚貝（殼高＜20 mm）的比例為51.95%。

圖3 夏初（A）和秋季（B）蠣江灘牡蠣的殼高-頻率分布Fig.3 Distribution of shell height-frequency of oysters at Lijiangtan oyster reef in early summer and autumn

2.3 牡蠣幼體補充量

幼體補充量分析中，運用分子生物學方法共鑒定8批次644個牡蠣樣品（表4）。其中，熊本牡蠣590個、占比91.61%，近江牡蠣42個、占比6.52%，福建牡蠣、香港牡蠣和貓爪牡蠣數(shù)量占比分別為0.78%、0.47%和0.62%。近江牡蠣、香港牡蠣、福建牡蠣和貓爪牡蠣更多附著于0.6 m潮區(qū)，而熊本牡蠣在1.6 m潮區(qū)附著量略高于0.6 m潮區(qū)（表4）。除了第1個監(jiān)測時段0.6 m潮區(qū)的補充群體中近江牡蠣占比高于熊本牡蠣，其余各時段和潮區(qū)熊本牡蠣均占絕對優(yōu)勢。

表4 蠣江灘牡蠣補充群體的種類組成Tab.4 Species com position of oyster recruitment communities at Lijiangtan oyster reef

圖4顯示了蠣江灘牡蠣礁牡蠣補充量的時空變化情況。0.6 m潮區(qū)牡蠣補充量峰值出現(xiàn)于8月9日附苗器采樣和9月21日附苗器采樣時段；1.6 m潮區(qū)牡蠣補充量變化趨勢與0.6 m潮區(qū)基本相似，但第1個補充高峰出現(xiàn)時間比0.6 m潮區(qū)約早半個月。牡蠣補充量具有顯著的時間變化（F＝52.651，P＜0.001）和空間變化（F＝12.448，P＜0.001），兩因子之間有互作效應（F＝3.254，P＝0.005）。除初始2個監(jiān)測時段和最后1個監(jiān)測時段外，牡蠣補充量在2個潮區(qū)間均具有顯著性差異（圖4）。

圖4 蠣江灘牡蠣補充量的時空變化Fig.4 Spatial-tem poral changes in oyster recruits at Lijiangtan oyster reef

3 討論

3.1 蠣江灘牡蠣種類及遺傳多樣性

中國沿海牡蠣種類繁多，由于牡蠣表型變化大，很難運用形態(tài)學方法準確鑒定牡蠣種類［15－16］。本研究采用分子生物學方法，發(fā)現(xiàn)2021年蠣江灘中分布有6種牡蠣，相比2020年調查時發(fā)現(xiàn)的4種牡蠣［12，17］，又增加了貓爪牡蠣和長牡蠣。與其他鄰近海域相比［4，18－20］，蠣江灘具有較高的牡蠣物種多樣性，應該是浙江沿海牡蠣物種分布的“熱點”區(qū)域之一，具有較高的保護價值。貓爪牡蠣零星分布于我國渤海、黃海、東海和南海沿岸，是潮間帶偶見種［21］。長牡蠣自然分布于我國江蘇連云港以北沿海，本研究為首次報道長牡蠣自然分布于浙江沿海，同時期，作者也在江蘇海門蠣岈山檢測到長牡蠣群體，以上結果顯示，該種有向黃海南部和東海北部擴散的趨勢，其原因有待進一步研究。與江蘇海門、上海蘆潮港、浙江象山港牡蠣群體的16S rDNA遺傳多樣性對比［5］，蠣江灘中熊本牡蠣的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均是最低的，近江牡蠣的單倍型多樣性指數(shù)也低于鄰近的3個自然群體［4］，表明蠣江灘熊本牡蠣和近江牡蠣遺傳多樣性均較低，這可能是因為該牡蠣礁位于健跳港上游灣區(qū)，狹長的海灣限制了灣內牡蠣群體與外部群體的基因交流。

3.2 蠣江灘牡蠣資源量和補充潛力

本研究顯示，蠣江灘熊本牡蠣、近江牡蠣和香港牡蠣的密度均呈現(xiàn)顯著的季節(jié)變化和空間變化，秋季牡蠣密度顯著高于夏初，表明該牡蠣礁在夏季發(fā)生了顯著的資源補充。但3種牡蠣補充的空間格局不同，熊本牡蠣在3個礁區(qū)中均有顯著補充，而近江牡蠣和香港牡蠣僅在中、低礁區(qū)有顯著補充，表明這3種牡蠣在自然分布上呈現(xiàn)明顯的空間生態(tài)位分區(qū)（zonation）格局，這種分區(qū)格局與健跳港上游灣區(qū)基巖海岸［12］、長江口［7］、江蘇海門［22］和上海蘆潮港［23］的研究結果一致。例如，陳麗芝等［12］調查了相同研究地點的基巖潮間帶中這3種牡蠣的自然分布，發(fā)現(xiàn)近江牡蠣和香港牡蠣的空間生態(tài)位一致，僅分布于最底層的潮區(qū)，且隨著高程降低這2種牡蠣的密度逐步升高；熊本牡蠣最高密度出現(xiàn)于中潮區(qū)，且隨著高程降低其密度逐步降低。WANG等［23］研究表明，熊本牡蠣比近江牡蠣具有更強的耐干露能力和更輕的軟組織干重，且兩種牡蠣浮游幼體的分布水層存在明顯差異。本研究綜合分析認為，附著潮區(qū)差異和附著后的物理條件（空氣暴露、溫度、失水等）與生物條件（競爭和捕食）差異可能是造成3種牡蠣的分布呈現(xiàn)潮間帶分區(qū)格局的原因。

牡蠣密度是表征牡蠣礁生態(tài)現(xiàn)狀的常用指標之一［24］。夏初和秋季蠣江灘牡蠣礁中牡蠣平均總密度分別為（97±40）個·m－2和（1 770±467）個·m－2，夏初牡蠣密度較低的原因可能是2020年冬季的持續(xù)過度采捕；秋季牡蠣的密度較高表明夏季發(fā)生了顯著的資源補充，該牡蠣密度高于許多自然或人工修復牡蠣礁中的牡蠣密度［7，20，24－26］。

闡明牡蠣幼體附著與補充的時空格局對于制定有效的牡蠣礁修復策略至關重要［27］。與2020年監(jiān)測結果相比［17］，2021年蠣江灘牡蠣礁牡蠣補充期相對較短（6月初至10月初左右），繁殖期間牡蠣補充量變化趨勢由2020年正態(tài)“單峰”曲線變化轉變?yōu)?021年“雙峰”曲線變化，表明牡蠣補充格局的年際變化較大。從2個實驗潮區(qū)的監(jiān)測結果來看，總體上0.6 m潮區(qū)補充量高于1.6 m潮區(qū)，即中間潮區(qū)更適宜于牡蠣幼體的附著和補充，主要原因可能是0.6 m潮區(qū)既可避免底層環(huán)境高懸沙沉積的影響，也可有效降低空氣暴露對牡蠣附著、生長與存活的物理脅迫［27］。本研究表明，蠣江灘牡蠣礁分布著一個有較高物種多樣性的牡蠣群落，應加強保護和管理。下一步需研究泥沙淤積和香港牡蠣入侵對蠣江灘生境和牡蠣種質資源的影響。