陳 碩，李宏基，張夢雪，張?zhí)煊?，樊少武，周金華，馬 明，孫 鵬，吳文惠

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 200433；3.中國人民解放軍69235部隊(duì)，新疆奎屯 833200；4.中國人民解放軍69245部隊(duì)，烏魯木齊 830000）

放線菌是臨床抗生素的重要來源，約三分之二的抗生素都是由放線菌產(chǎn)生的［1］。放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有抗菌［2－3］、抗腫瘤［4－5］和抗病毒［6］等多種生物活性。隨著天然藥物化學(xué)研究的迅速發(fā)展，大量抗生素被發(fā)現(xiàn)［7］。然而，抗生素的濫用導(dǎo)致多種病原菌的抗藥性增強(qiáng)，嚴(yán)重威脅人類健康［8］，因此迫切需要開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的新型候選藥物。海洋放線菌是尚未被很好開發(fā)的微生物資源［9］，海洋環(huán)境與陸地環(huán)境在光照、壓力和鹽度等方面存在很大差異［10］，這使海洋放線菌成為新型次級代謝產(chǎn)物的重要來源［11］。目前研究最多的海洋放線菌是鏈霉菌屬（Streptomyces）菌類，海洋鏈霉菌的天然產(chǎn)物中大約有67.3%表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞毒活性和抗瘧、抗寄生蟲等生物活性，具有巨大的開發(fā)前景和研究價值［12］。

在全球范圍內(nèi)，感染侵襲性真菌疾病的人數(shù)呈現(xiàn)遞增趨勢［13］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年發(fā)生75萬例侵襲性念珠菌病，并導(dǎo)致出現(xiàn)超過5萬例死亡病例，白色念珠菌是侵襲性真菌疾病的主要病原菌［14］。目前，臨床用于治療真菌感染的藥物主要有氮唑類、棘白菌素類、兩性霉素類和核苷類，抗真菌藥物相比于其他抗菌類藥物，數(shù)量和種類都十分有限。同時，由于氮唑類抗真菌藥物的長期使用，導(dǎo)致耐藥菌越來越普遍；而兩性霉素類藥物具有明顯肝腎毒性［15］；棘白菌素類藥物的耐藥率也在增加［16］，因此亟需發(fā)掘新的抗真菌藥物。海洋放線菌中很多次級代謝產(chǎn)物具有抗真菌活性，例如ZHANG等［17］從海洋放線菌Streptomycessp.ZZ741中分離得到化合物streptovitacin A，對白色念珠菌有很強(qiáng)的抑制作用。本文對海洋放線菌Streptomycessp.MA12的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分研究，并對單體化合物進(jìn)行抗真菌活性測試，以期為開發(fā)新型抗真菌活性天然化合物提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：菌株MA12分離自中國南海西沙群島海域的海綿樣品，經(jīng)鑒定屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）?？拐婢钚詼y試菌株分別為標(biāo)準(zhǔn)敏感白色念珠菌SC5314、臨床分離耐氟康唑白色念珠菌901、實(shí)驗(yàn)室基因編輯耐氟康唑白色念珠菌816。菌株MA12和白色念珠菌保存于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系。

放線菌培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基（40 g葡萄糖，10 g大豆蛋白胨，21 g麥芽提取物，1 L去離子水，pH 7.0）；發(fā)酵培養(yǎng)基（20 g黃豆粉，40 g葡萄糖，19.5 g MES水合物，1 L去離子水，pH 6.8）。抗菌測試培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)基（支原體肉湯培養(yǎng)基）和SDA培養(yǎng)基（沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）。

色譜填料和試劑：MCI中壓色譜凝膠，Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（Pharmacia Biotech，Sweden），正相硅膠（100～200目和300～400目，煙臺黃務(wù)硅膠開發(fā)實(shí)驗(yàn)廠），高效薄層層析硅膠板（TLC板，煙臺黃務(wù)硅膠開發(fā)實(shí)驗(yàn)廠）。顯色劑為10%硫酸香草醛溶液；HPLC所用甲醇和乙腈為色譜純，上述試劑均購自泰坦科技股份有限公司。

1.2 MA12菌株中化合物分離純化

1.2.1 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

配置10瓶80 mL種子培養(yǎng)基，121℃高溫蒸汽滅菌20 min，培養(yǎng)基冷卻后接入MA12菌株，置于28℃、220 r·min－1條件下的搖床中，培養(yǎng)48 h。將種子液按照每瓶10 mL的方式接種到裝有250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中。置于28℃、220 r·min－1條件下的搖床中，培養(yǎng)7 d，總發(fā)酵量20 L。

1.2.2 菌株化合物的提取分離

發(fā)酵液中加入等量的乙酸乙酯，手動攪拌均勻，以35 kHz頻率超聲提取30 min，重復(fù)5次，最終粗產(chǎn)物重量為26 g。用MCI中壓柱分離粗產(chǎn)物。采用甲醇-水梯度洗脫（30∶70→100∶0，v∶v），每個梯度洗脫2.5個柱體積，得到M1～M15共15個部分。將M8組分（750 mg）經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離（二氯甲烷∶甲醇為2∶1，v∶v）進(jìn)行洗脫，TLC檢測合并得到主產(chǎn)物組分M8L3（450 mg），用硅膠柱色譜分離M8L3，采用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫（每個梯度洗脫3個柱體積，體積比分別為100∶0、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶100），TLC檢測合并得到S1～S15共15個組分，主產(chǎn)物M8L3S3組分（80.7 mg）經(jīng) HPLC（60% 甲醇，流速 2 mL·min－1）分離得到化合物2（13.4 mg，tR＝32 min）。將M9組分（80 mg）經(jīng)HPLC（68%甲醇，流速2 mL·min－1）分離得到化合物3（19 mg，tR＝34 min）。M10經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離（二氯甲烷∶甲醇為2∶1；v∶v）進(jìn)行洗脫，TLC檢測合并得到主產(chǎn)物組分M10L3（180.5 mg），將M10L3組分用HPLC（62%甲醇，流速2 mL·min－1）純化，得到化合物1（7 mg，tR＝30 min）。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定方法

化合物結(jié)構(gòu)鑒定主要采用波譜學(xué)方法，包括NMR（1H 譜和13C譜）和高分辨質(zhì)譜（ESIHRMS），并結(jié)合微譜網(wǎng)站檢索和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對等方法完成。在300 K溫度條件下采集NMR數(shù)據(jù)，NMR化學(xué)位移通過百萬分率（δ）表示，并以CD3OD信號（δH＝3.31×10－6mg·L－1；δC＝49.0×10－6mg·L－1）或者CDCl3信號（δH＝7.26×10－6mg·L－1；δC＝77.0×10－6mg·L－1）作為內(nèi)標(biāo)。耦合常數(shù)（J）以Hz為單位。高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過質(zhì)荷比（m/z）表示，以碘化鈉異丙醇溶液（2 mg·mL－1）作為參照，分辨率為5 000。

1.4 化合物活性測試

采用微量液基稀釋法測定化合物最低抑菌濃度（MIC）［18］。菌液用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至濃度為（1～5）×103個·mL－1備用。將化合物置于滅菌后的1.5 mL離心管中，用DMSO溶解樣品制成6.4 mg·mL－1的母液（－20℃保存）。實(shí)驗(yàn)前將母液置于常溫融化并用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋10倍（640μg·mL－1），將96孔無菌板每排的1號孔加入20μL化合物溶液和180μL菌液；2～10號孔加入100μL菌液，倍比稀釋配置藥物濃度為64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125μg·mL－1；11號孔加入100μL培養(yǎng)液作為空白對照；12號孔加入不含藥物菌液作為陰性對照。上述實(shí)驗(yàn)在無菌超凈臺內(nèi)進(jìn)行，平行操作3次。藥敏板置于35℃溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，用酶標(biāo)儀在630 nm檢測OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 放線菌MA12的化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過菌株發(fā)酵、代謝產(chǎn)物分離及波譜學(xué)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對［19－21］，從菌株MA12代謝產(chǎn)物中鑒定出3種化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 化合物1～3結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1-3

化合物1：白色粉末，ESI-MSm/z：623.383 3［M＋H］＋，分子式C36H50N2O7，不飽和度為13。其NMR 數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.59（s，1H），7.48（s，1H），6.47（s，1H），6.22（s，1H），6.10（dd，J＝7.1、2.9 Hz，2H），6.03（d，J＝6.8 Hz，2H），5.58（dd，J＝15.3、7.2 Hz，2H），5.18（d，J＝7.2 Hz，1H），4.95～4.90（m，1H），4.63（s，1H），4.40（p，J＝7.0 Hz，1H），4.12（d，J＝9.9 Hz，1H），3.48（s，1H），3.39（s，3H），2.76（dd，J＝13.9、3.6 Hz，1H），2.59（dd，J＝13.8、8.6 Hz，1H），2.51～2.47（m，3H），2.32（dd，J＝14.6、8.9 Hz，1H），2.15～2.07（m，2H），1.86（d，J＝10.1 Hz，3H），1.79（s，3H），1.66（d，J＝11.7 Hz，2H），1.41（t，J＝12.3 Hz，3H），1.35（d，J＝7.1 Hz，3H），1.22（m，6H），0.92（d，J＝6.8 Hz，3H）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：176.8（C-30），173.1（C-27），168.8（C-1），157.4（C-22），144.3（C-18），138.7（C-20），138.5（C-14），134.3（C-5），133.7（C-7），133.5（C-8），130.8（C-4），129.6（C-6），129.5（C-9），125.0（C-15），112.2（C-19），111.1（C-23），106.0（C-21），78.8（C-3），75.6（C-11），68.6（C-13），56.9（C-26），48.7（C-28），45.2（C-31），43.7（C-2），39.7（C-12），36.4（C-17），33.4（C-10），29.7（C-16），29.6（C-32），29.5（C-36），25.8（C-34），25.8（C-33），25.7（C-35），20.5（C-25），17.9（C-29），10.0（C-24）。以上數(shù)據(jù)分析結(jié)合文獻(xiàn)比對［19］，確定該化合物為trienomycin A。化合物1最早是從Streptomycessp.No.83-16中分離得到，對人宮頸癌細(xì)胞有抑制作用，IC50為0.005 μg·mL－1。據(jù)文獻(xiàn)報道，化合物1對胰腺癌細(xì)胞增殖有抑制作用［20］，化合物1通過抑制STAT3轉(zhuǎn)錄影響癌細(xì)胞的增殖、生長、遷移和入侵，以阻滯胰腺癌細(xì)胞發(fā)展，對因STAT3異常導(dǎo)致的早期和晚期胰腺癌有潛在的治療作用。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z：597.351 9［M＋H］＋，分子式C34H48N2O7，不飽和度為12。其NMR 數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.69（s，1H），7.46（s，1H），6.47（s，1H），6.22（s，1H），6.10（dd，J＝10.1、5.0 Hz，2H），6.03（dd，J＝12.1、5.7 Hz，1H），5.63～5.52（m，2H），5.19（t，J＝6.9 Hz，1H），4.93（dd，J＝8.8、5.8 Hz，1H），4.64（d，J＝4.2 Hz，1H），4.42（m，1H），4.13～4.08（m，1H），3.48（d，J＝5.5 Hz，1H），3.37（s，3H），2.76（dd，J＝13.7、3.6 Hz，1H），2.63～2.55（m，1H），2.51（dd，J＝12.4、5.6 Hz，2H），2.47～2.40（m，2H），2.31（ddd，J＝14.8、9.1、2.3 Hz，2H），2.24～2.15（m，2H），2.06（d，J＝2.1 Hz，2H），1.96（s，1H），1.88（dd，J＝9.1、4.3 Hz，1H），1.78（s，3H），1.37（d，J＝7.1 Hz，3H），0.90～0.94（m，9H）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：173.3（C-30），173.0（C-27），168.9（C-1），157.4（C-22），144.2（C-18），138.6（C-20），138.4（C-14），134.3（C-5），133.8（C-7），133.5（C-8），130.8（C-4），129.6（C-6），129.5（C-9），125.0（C-15），112.3（C-19），111.1（C-23），106.1（C-21），78.9（C-3），75.6（C-11），68.6（C-13），56.9（C-26），48.8（C-28），45.7（C-31），43.7（C-2），39.7（C-12），36.4（C-17），33.3（C-10），29.6（C-16），26.3（C-32），22.6（C-33），22.6（C-34），20.5（C-25），17.8（C-29），10.0（C-24）。以上數(shù)據(jù)分析結(jié)合文獻(xiàn)比對［19］，確定該化合物為trienomycin B?；衔?最早從Streptomycessp.No.83-16中分離得到，對人宮頸癌細(xì)胞有抑制作用，IC50為0.2μg·mL－1。

化合物3：白色粉末，ESI-MSm/z：639.368 2［M＋H］＋，分子式C36H50N2O8，不飽和度為13。其NMR 數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.57（d，J＝2.9 Hz，1H），6.48（d，J＝2.9 Hz，1H），6.21（dd，J＝15.0、10.5 Hz，2H），6.12～6.05（m，2H），5.67（ddd，J＝15.6、10.5、5.3 Hz，1H），5.50～5.43（m，1H），5.19～5.15（m，1H），4.70（m，1H），4.33～4.26（m，1H），4.12（ddd，J＝10.4、8.7、4.7 Hz，1H），3.33（s，3H），2.90（dd，J＝12.6、5.2 Hz，1H），2.83（dd，J＝12.7、4.7 Hz，1H），2.60～2.54（m，2H），2.30（t，J＝3.3 Hz，1H），2.29～2.25（m，2H），2.24～2.18（m，2H），1.92（ddd，J＝13.6、6.8、3.3 Hz，2H），1.82（s，1H），1.80（d，J＝5.1 Hz，2H），1.73～1.71（m，3H），1.51～1.45（m，2H），1.41（d，J＝7.3 Hz，3H），1.37～1.35（m，2H），1.34（m，2H），1.32（dd，J＝7.6、4.5 Hz，2H），1.30～1.26（m，2H），0.96～0.88（m，2H），0.81（d，J＝6.9 Hz，3H）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：179.2（C-30），173.9（C-27），171.5（C-1），150.7（C-22），142.0（C-19），139.6（C-14），136.6（C-5），135.7（C-7），134.7（C-8），133.2（C-18），131.1（C-4），130.7（C-9），130.6（C-6），127.3（C-20），124.9（C-15），116.3（C-23），108.4（C-21），81.7（C-3），76.5（C-11），69.6（C-13），56.7（C-26），50.2（C-28），45.9（C-31），43.6（C-2），39.6（C-12），33.8（C-10），32.6（C-17），30.8（C-32），30.7（C-36），27.6（C-16），27.0（C-35），26.9（C-34），26.8（C-33），21.0（C-25），17.2（C-29），9.7（C-24）。以上數(shù)據(jù)分析結(jié)合文獻(xiàn)比對［21］，確定該化合物為ansatrienin B?；衔?最早是從StreptomycesrishiriensisT-23中分離得到。

本文從海洋放線菌Streptomycessp.MA12分離得到3種已知安莎三烯類化合物。安莎三烯（trienomycins）屬于安莎霉素類抗生素，因其結(jié)構(gòu)中含有共軛三烯而得名。已經(jīng)報道的該類抗生素約有200種，其結(jié)構(gòu)特征是以3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）作為起始單元形成大環(huán)內(nèi)酰胺［22］，代表性化合物有利福霉素（rifamycin）［23］、格爾登霉 素 （geldanamycin）［24］和 美 登 木 素（maytansinoids）［25］等。安莎霉素類化合物是藥物研發(fā)中的一個重要家族，具有抗結(jié)核、抗菌、抗腫瘤等生物活性。安莎霉素化合物按結(jié)構(gòu)可分為萘安莎霉素類和苯安莎霉素類，萘安莎類化合物抗菌活性較好，苯安莎類化合物在抗腫瘤活性方面表現(xiàn)突出［26］。苯安莎類化合物的代表格爾登霉素能夠與熱休克蛋白Hsp90上的ATP位點(diǎn)結(jié)合，使Hsp90蛋白的ATPase失活而產(chǎn)生抗腫瘤作用［27］；萘安莎化合物利福霉素對細(xì)菌RNA聚合酶具有特異性抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)抗結(jié)核效果［28］。根據(jù)碳骨架的長短，苯安莎類化合物還可以分為C-15安莎霉素和C-17安莎霉素，它們在體外對肝癌細(xì)胞和小鼠白細(xì)胞等都有良好的細(xì)胞毒活性［29－30］。

2.2 化合物活性測試

選取3株白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)敏感白色念珠菌SC5314、臨床分離耐氟康唑白色念珠菌901和實(shí)驗(yàn)室基因編輯耐氟康唑白色念珠菌816進(jìn)行抗真菌活性測試，氟康唑（FCZ）用作陽性對照，活性測試結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，化合物3對標(biāo)準(zhǔn)敏感白色念珠菌SC5314、耐氟康唑白色念珠菌816、耐氟康唑白色念珠菌901均有明顯抑制作用，MIC值分別為4、4、8μg·mL－1?；衔?和化合物2對3株白色念珠菌無抑制作用，MIC值均大于64μg·mL－1。本文首次報道了安莎三烯對白色念珠菌特別是氟康唑耐藥菌株的抗菌活性，不僅展現(xiàn)了化合物3的新穎抑菌效果，還提示化合物3中的C19位羥基和環(huán)己烷側(cè)鏈可能對抗真菌效果具有重要作用，后期將進(jìn)一步開展構(gòu)效關(guān)系和抗菌機(jī)制研究。

表1 MA12代謝產(chǎn)物的抗真菌活性Tab.1 Antifungal activities（M IC）ofm etabolites from MA12（μg·m L-1）

安莎三烯類化合物抗真菌活性測試結(jié)果為抗真菌新藥研發(fā)提供了新的科學(xué)依據(jù)。本文從菌株MA12次級代謝產(chǎn)物中分離得到3種安莎三烯類化合物，后期可以通過改變培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)組成（碳氮源配比、微量元素、特殊代謝物添加等）、發(fā)酵條件（溫度、pH、光照、時間等）以及擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模等方式獲得更多類似物。通過基因組測序可以獲得菌株中與次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的基因簇信息，對處于沉默狀態(tài)、低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)的生物合成基因簇，可以利用同源重組技術(shù)替換啟動子、刪除抑制子，進(jìn)而更高效地激活沉默基因簇，提高獲得新穎活性次級代謝產(chǎn)物的機(jī)會。