幸憶恩，蔡亦紅

安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽醫(yī)科大學(xué)人畜共患病安徽高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，感染全球超過(guò)30%的人口，相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)較高[1-2]。速殖子是弓形蟲的快速增殖階段，可通過(guò)血流播散并感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、骨骼、心肌、胎盤以及肝、腎等組織和器官[3-4]。弓形蟲還可長(zhǎng)期潛伏在腦、心臟和肌肉等人體組織中，以緩殖子的形式存在，當(dāng)機(jī)體免疫力下降或環(huán)境刺激時(shí)會(huì)被再次激活，引發(fā)嚴(yán)重疾病，甚至致死[5]。弓形蟲在全球普遍存在，不同地區(qū)基因型差異明顯[6]，Chinese 1 型（ToxoDB#9）是我國(guó)弓形蟲的優(yōu)勢(shì)基因型蟲株，其中TgCtwh6為成囊株[7]。

微量金屬元素，如銅、鋅、鐵、錳等，是維持細(xì)胞正常功能的重要元素，也是哺乳動(dòng)物發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[8-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠急性感染Chinese 1 型弓形蟲TgCtwh3、TgCtwh6 會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)各組織微量元素含量發(fā)生改變，說(shuō)明蟲體入侵會(huì)打破機(jī)體內(nèi)微量元素穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步誘導(dǎo)宿主新陳代謝紊亂[10-11]。本研究主要通過(guò)構(gòu)建我國(guó)流行的弓形蟲優(yōu)勢(shì)基因型Chinese 1 型弱毒株（TgCtwh6）感染小鼠模型，分別在感染急性期和慢性期測(cè)定小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟中Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+等金屬元素含量，并進(jìn)一步探討不同感染階段金屬元素含量的改變，以及對(duì)宿主功能代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠 6 周齡雌性C57BL/6J 小鼠，體重17～21 g，購(gòu)于杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（生產(chǎn)許可編號(hào)：SCXK2019-0004)。小鼠飼養(yǎng)條件：光照12 h/黑暗12 h 循環(huán)，相對(duì)濕度40%～60%，溫度18～26 ℃，能隨意獲得食物。

1.2 弓形蟲蟲株 TgCtwh6 蟲株（ToxoDB#9）為本實(shí)驗(yàn)室液氮保種，復(fù)蘇后直接于昆明鼠腹腔內(nèi)注射傳代，經(jīng)傳2～3 代后用于正式實(shí)驗(yàn)。TgCtwh6株包囊鼠由本課題組傳代保存，取TgCtwh6蟲株保種小鼠腦組織，用5 mL PBS 通過(guò)200 目無(wú)菌濾網(wǎng)進(jìn)行研磨勻漿，光鏡下對(duì)包囊進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，再以無(wú)菌PBS稀釋勻漿。

1.3 主要試劑與儀器 硝酸（HNO3，優(yōu)級(jí)純，批號(hào)：220712）、30%雙氧水（30%H2O2，分析純，批號(hào)：221023）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；24 種多元素混合外標(biāo)溶液（濃度：100 μg/mL，批號(hào)：220315）和7種多元素混合內(nèi)標(biāo)溶液（濃度：10μg/mL，批號(hào)：220517）購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；鼠源辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase, GAPDH）單抗（批號(hào)：1000292）購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源ZIP 8 單抗（批號(hào)：00045855）購(gòu)于美國(guó)Proteintech 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：202210）購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；渦旋混合器（型號(hào)：XW-80A）購(gòu)自上海馳唐電子有限公司；分析天平購(gòu)自METTLER TOLEDO 有限公司；純水儀（型號(hào)：HK-UV-20）購(gòu)自合肥宏科科技有限公司；36 孔石墨消解儀（型號(hào)：ST36-iTouch）購(gòu)自Digi Block 公司；Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析儀（型號(hào)：Ⅰ型）購(gòu)自北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司。

1.4 小鼠模型的建立 將18 只雌性C57BL/6J 小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、感染急性期組和感染慢性期組，每組6 只。對(duì)照組小鼠每只經(jīng)口灌胃200 μL無(wú)菌生理鹽水，1個(gè)月后頸椎脫臼處死，收集小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟；TgCtwh6 感染急性期組小鼠每只經(jīng)口灌胃200 μL無(wú)菌生理鹽水懸液（內(nèi)含約20 個(gè)TgCtwh6 包囊），模型建立后每天觀察小鼠狀態(tài)，約1～2 周發(fā)現(xiàn)有豎毛、弓背、行動(dòng)遲緩、畏光等現(xiàn)象時(shí)，頸椎脫臼處死，收集小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟；TgCtwh6感染慢性期組小鼠每只經(jīng)口灌胃200 μL 無(wú)菌生理鹽水懸液（內(nèi)含約20 個(gè)TgCtwh6 包囊），感染1 個(gè)月后，頸椎脫臼處死，收集小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟。收集的所有臟器經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。

1.5 小鼠組織內(nèi)金屬元素測(cè)定 取出-80 ℃保存的小鼠臟器，用超純水清洗3 次，濾紙吸干表面水分，準(zhǔn)確稱取0.1 g 組織，分別轉(zhuǎn)移至玻璃消解管，每個(gè)樣品分3 次加入混酸溶液（HNO3與H2O2的體積比為2∶1），共3 mL。置于36 孔石墨消解儀加熱消解，當(dāng)組織消解完畢且消解管內(nèi)溶液約為0.5 mL時(shí)取出消解管，待冷卻后使用超純水定容。用Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析儀測(cè)定并計(jì)算Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+含量，各元素含量（μg/g）=樣品元素濃度（μg/mL）×樣品定容體積（mL）/樣品質(zhì)量（g）。

1.6 ZIP 8（Zrt-and-Irt-like protein 8）蛋白表達(dá)測(cè)定用組織總蛋白提取試劑盒提取肝臟組織總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。采用Western blot 檢測(cè)ZIP 8 蛋白表達(dá)，將三組小鼠的肝臟蛋白樣本進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3 次（10 min/次）后，使用ZIP 8 單抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，同上洗滌后，將膜轉(zhuǎn)至1∶10 000稀釋的羊抗鼠二抗中室溫孵育1.5 h，最終用凝膠成像儀成像。

1.7 SOD 活性測(cè)定 稱取0.1 g 小鼠肝臟組織，加入0.9 mL的PBS，充分勻漿，1 000×g離心20 min，收集上清。按照超氧化物歧化酶活性試劑盒說(shuō)明書采用分光光度法測(cè)定肝臟SOD活性。

1.8 圖像與數(shù)據(jù)分析 使用Image J 1.8.0 軟件對(duì)Western blot 結(jié)果進(jìn)行分析。使用GraphPad Prism 6.02 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)采用方差分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.9 倫理學(xué)聲明 所有程序嚴(yán)格遵循安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心生物醫(yī)學(xué)研究所機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)（許可證號(hào)：AMU26-081108）。

2 結(jié) 果

2.1 TgCtwh6 感染小鼠模型的構(gòu)建 TgCtwh6 感染小鼠發(fā)病后，將其頸椎脫臼處死，無(wú)菌狀態(tài)下取小鼠腹水，取10 μL 腹水在載玻片上制片，顯微鏡下可觀察到TgCtwh6速殖子，說(shuō)明急性期感染模型構(gòu)建成功（圖1A）；TgCtwh6 感染小鼠1 個(gè)月后，在小鼠腦組織勻漿中可觀察到包囊的形成，說(shuō)明慢性期感染模型構(gòu)建成功（圖1B）。

圖1 TgCtwh6感染小鼠模型的構(gòu)建Figure 1 Construction of TgCtwh6 infected mice model

2.2 TgCtwh6感染小鼠不同組織金屬元素含量

2.2.1 Fe2+含量 三組小鼠肝臟、脾臟和腎臟內(nèi)Fe2+含量組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.420、6.881、5.196，P均＜0.05）。急性期組和慢性期組肝臟內(nèi)Fe2+含量分別為（76.348±11.613）μg/g 和（88.545±10.555）μg/g，高于對(duì)照組的（52.388±6.165）μg/g；急性期組和慢性期組脾臟內(nèi)Fe2+含量分別為（128.519±13.531）μg/g 和（120.309±10.023）μg/g，低于對(duì)照組的（147.720±15.303）μg/g；急性期組腎臟內(nèi)Fe2+含量為（39.918±3.120）μg/g，低于慢性期組的（46.352±4.816）μg/g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.017）。心臟內(nèi)Fe2+含量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.293，P＞0.05）。見圖2A。

2.2.2 Cu2+含量 三組小鼠心臟內(nèi)Cu2+含量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.558，P＜0.05），急性期組和慢性期組分別為（5.189±0.255）μg/g和（5.631±0.485）μg/g，低于對(duì)照組的（6.440±0.740）μg/g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.017）。肝臟、脾臟和腎臟組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.805、1.367、1.993，P均＞0.05）。見圖2B。

2.2.3 Mn2+含量 三組小鼠心臟和肝臟內(nèi)Mn2+含量組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.977、23.180，P均＜0.05）。急性期組小鼠心臟內(nèi)Mn2+含量為（0.605±0.052）μg/g，低于對(duì)照組的（0.686±0.051）μg/g；急性期組和慢性期組肝臟內(nèi)Mn2+含量為（1.298±0.065）μg/g 和（1.405±0.066）μg/g，高于對(duì)照組的（1.141±0.110）μg/g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.017）。脾臟和腎臟組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.535、3.332，P均＞0.05）。見圖2C。

2.2.4 Zn2+含量 三組小鼠心臟和肝臟內(nèi)Zn2+含量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.550、8.125，P均＜0.05）。急性期組和慢性期組小鼠心臟內(nèi)Zn2+含量分別為（17.034±0.974）μg/g和（16.858±0.953）μg/g，低于對(duì)照組的（19.258±0.965）μg/g；急性期組和慢性期組小鼠肝臟內(nèi)Zn2+含量分別為（17.506±0.824）μg/g和（17.031±0.907）μg/g，高于對(duì)照組的（15.650±0.305）μg/g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.017）。脾臟和腎臟組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.878、0.013，P均＞0.05）。見圖2D。

2.2.5 Mg2+含量 三組小鼠心臟內(nèi)Mg2+含量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.084，P＜0.05），急性期組為（153.346±3.221）μ g/g，低于對(duì)照組的（163.012±8.204）μg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.017）；肝臟、脾臟和腎臟組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.612、0.247、2.380，P均＞0.05）。見圖2E。

2.3 TgCtwh6 感染小鼠肝臟組織中ZIP 8 蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果表明，對(duì)照組、急性期組和慢性期組小鼠肝臟ZIP 8相對(duì)表達(dá)量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.240，P＜0.05）。急性期組和慢性期組均高于對(duì)照組，且慢性期組高于急性期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.017）。見圖3。

圖3 肝臟中ZIP 8蛋白相對(duì)表達(dá)量差異Figure 3 Difference of ZIP 8 relatively expressed in the liver

2.4 TgCtwh6感染小鼠肝臟組織中SOD 活性 對(duì)照組、急性期組和慢性期組小鼠肝臟SOD 活性分別為（14.041±0.734）U/mL、（16.463±0.616）U/mL和（15.859±0.780）U/mL，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.370，P＜0.05），急性期組和慢性期組均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.017）。

3 討 論

在弓形蟲急性感染期，快速生長(zhǎng)的速殖子通過(guò)血流播散并感染如中樞神經(jīng)、眼睛、骨骼、心臟以及胎盤等多處組織，可引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)并造成組織破壞，從而引發(fā)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。急性發(fā)病期后，蟲體可長(zhǎng)期潛伏在宿主體內(nèi)形成緩殖子，緩殖子被厚厚的包囊壁包圍，在腦、心臟和骨骼肌中持續(xù)存在，并且緩殖子還可從包囊中被釋放出來(lái)，發(fā)育增殖為速殖子，引起眼病、腦病等[12]。本研究通過(guò)構(gòu)建弓形蟲感染急性和慢性期小鼠模型，觀察不同組織中微量金屬元素留存情況，進(jìn)一步探索弓形蟲不同感染狀態(tài)下，宿主代謝功能的改變，為研究弓形蟲病的發(fā)病機(jī)制提供線索。

生物金屬元素是幾乎所有細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的輔助因子，在寄生蟲和宿主細(xì)胞的代謝中都扮演著十分重要的角色，生物金屬元素的攝取、流失及轉(zhuǎn)運(yùn)與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[10]。鐵元素與免疫細(xì)胞功能相關(guān)，當(dāng)機(jī)體受感染時(shí)，巨噬細(xì)胞中輸出鐵元素可激發(fā)機(jī)體抗菌潛力[13]。鋅元素參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，具有抗氧化和抗炎作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在弓形蟲感染急性和慢性期，小鼠不同組織中各微量金屬元素均發(fā)生了不同水平的改變。通過(guò)對(duì)急性和慢性期金屬元素含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，感染急性和慢性期小鼠肝臟中錳元素均上調(diào)，且慢性期錳元素上調(diào)更明顯。錳元素是細(xì)胞活動(dòng)的必需微量元素，在物質(zhì)代謝中起著重要作用，錳元素缺乏會(huì)增加細(xì)胞對(duì)氧化損傷的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生SOD 的能力下降，促進(jìn)細(xì)胞損傷[15]。最新研究表明，缺乏錳元素的小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加快，外源性添加錳元素則可有效激活人或小鼠抗原遞呈細(xì)胞的cGAS-STING 通路，增強(qiáng)NK 細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用，促進(jìn)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的浸潤(rùn)和腫瘤特異性殺傷功能[16]。弓形蟲慢性感染后小鼠肝組織內(nèi)錳元素含量上調(diào)是否是機(jī)體在抵抗寄生蟲感染過(guò)程中啟動(dòng)免疫細(xì)胞功能的自我保護(hù)策略，有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞攝取微量金屬元素必須通過(guò)相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行運(yùn)輸，如ZIP 家族[17]。ZIP 8 是ZIP 家族金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員之一，可轉(zhuǎn)運(yùn)鋅、錳和鐵等[18]。ZIP 8 在宿主防御病原體感染中發(fā)揮作用，有研究表明ZIP 8 的缺失會(huì)導(dǎo)致感染肺炎鏈球菌的小鼠炎癥反應(yīng)增加、組織損傷加重[19]。前期研究已證明弓形蟲Chinese 1 型另一蟲株TgCtwh3 感染急性期小鼠肝細(xì)胞膜上的ZIP 8可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅對(duì)肝臟起保護(hù)性作用[11]。本研究中也發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中ZIP 8 的表達(dá)在弓形蟲TgCtwh6感染急性和慢性期均上調(diào)，且慢性感染期上調(diào)更為顯著。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在弓形蟲感染后小鼠肝臟中通過(guò)ZIP 8 轉(zhuǎn)運(yùn)的鋅、鐵等其他元素含量也有所上調(diào)，這與ZIP 8 表達(dá)上調(diào)的結(jié)果一致。

SOD 是有氧代謝系統(tǒng)中的抗氧化物酶之一，根據(jù)活性中心所含金屬離子的不同，分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD 三種，前兩者可存在于真核細(xì)胞生物，后者存在于原核生物中[20]。本研究發(fā)現(xiàn)急性和慢性感染期小鼠肝臟SOD 活性均上調(diào)，可能由于感染小鼠肝臟內(nèi)ZIP 8 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致多種金屬含量增加，使得Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性被激活。雖然錳元素的含量在感染慢性期上調(diào)更為明顯，但是急性期和慢性期SOD 活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能由于Cu/Zn-SOD 主要存在于胞漿內(nèi)，而Mn-SOD 則存在于線粒體中。有待進(jìn)一步檢測(cè)急性和慢性感染期線粒體中Mn-SOD 的活性差異，從而探索不同感染狀態(tài)下的致病機(jī)制。

綜上，我國(guó)弓形蟲優(yōu)勢(shì)基因型Chinese 1 弱毒株（TgCtwh6）感染小鼠在急性和慢性感染期肝組織內(nèi)ZIP 8 表達(dá)上調(diào)，多種金屬元素含量受調(diào)節(jié)，SOD 活性被激活。本研究從體內(nèi)微量元素代謝的角度，初步探索了蟲體與宿主之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步研究弓形蟲的致病機(jī)制提供了新的方向。

利益沖突聲明全部作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明幸憶恩負(fù)責(zé)研究實(shí)施及論文撰寫；蔡亦紅負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)和論文撰寫指導(dǎo)