華梅，蔣宏，周彬，孔繼君

(1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.國(guó)家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

暖地杓蘭[1-2](Cypripediumsubtropicum)是《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄I物種，被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(物種紅色名錄)列為極危(CR)物種，被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(2021版)》列為一級(jí)保護(hù)植物，被《云南省生物物種紅色名錄(2017版)》列為極危物種，被《中國(guó)生物多樣性紅色名錄:高等植物版(2018版)》列為易危(VU)物種，在《全國(guó)極小種群野生植物拯救保護(hù)工程規(guī)劃(2011—2015年)》中，暖地杓蘭作為120種極小種群植物之一優(yōu)先納入了規(guī)劃，實(shí)施保護(hù)。

暖地杓蘭是杓蘭屬(Cypripedium)在亞洲唯一的亞熱帶種，國(guó)內(nèi)目前有少量分布，活植株僅存不足300株。暖地杓蘭為僅有的常綠葉多花杓蘭，唇瓣獨(dú)特，花色艷麗，具有非常高的觀賞價(jià)值。遭受過度的商業(yè)化采集，加之原生境遭破壞和種群退化等原因，野外活體數(shù)量逐年銳減瀕臨滅絕，對(duì)暖地杓蘭的保育工作迫在眉睫。人工繁育、引種回歸、種群復(fù)壯、重建是蘭科植物保育的有效措施[3-5]。

杓蘭的繁殖主要以種子無菌(非共生)萌發(fā)為主[6-12]，繁殖的關(guān)鍵在于種子的質(zhì)量及成熟度。暖地杓蘭的傳粉昆蟲為食蚜蠅(Scaevapyrastri)，因原生環(huán)境因素傳粉昆蟲較少，自然結(jié)實(shí)率非常低，野外獲取種子比較困難[3]。暖地杓蘭種子像其他蘭科植物一樣，細(xì)小如塵，無胚乳，無法提供種子萌發(fā)所必需的養(yǎng)分。同時(shí)暖地杓蘭種子內(nèi)層種皮被壓縮成薄薄的一層，緊緊地包裹著胚，而外層種皮逐漸拉長(zhǎng)，成熟種子看起來像頭發(fā)一樣。木質(zhì)化的內(nèi)層和外層種皮導(dǎo)致種子休眠，種子萌發(fā)極其困難。采用非共生的萌發(fā)方法，以暖地杓蘭成熟未開裂的果莢為試驗(yàn)材料，篩選適合的萌發(fā)、繼代培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，篩選適合暖地杓蘭幼苗栽培的基質(zhì)及栽培方法，有望解決暖地杓蘭繁殖中的種子萌發(fā)率低、繼代褐化及死苗、無菌苗出瓶成活率低、環(huán)境適應(yīng)性差、幼苗生長(zhǎng)緩慢等問題，獲得的大量種苗，為暖地杓蘭的回歸、保育及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 暖地杓蘭種子繁育材料

暖地杓蘭種子繁育材料采用野外居群人工授粉后所結(jié)的成熟未裂開的果莢。

1.1.2 暖地杓蘭種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)基

暖地杓蘭種子非共生萌發(fā)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 MS、1/2 MS、1/4MS、B5、VW、花寶1號(hào)、改良Norstog培養(yǎng)基。

改良Norstog培養(yǎng)基為在原Norstog1993培養(yǎng)[13]的基礎(chǔ)上，大量元素：KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O濃度減半，其他元素改用1 mg/L蘋果酸、20 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂構(gòu)成，具體的配方見表1。

表1 改良Norstog培養(yǎng)基

表2 3種栽培基質(zhì)對(duì)暖地杓蘭移栽成活率的影響

繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基 改良Norstog培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，再添加20 g/L馬鈴薯勻漿構(gòu)成。萌發(fā)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基pH 值調(diào)節(jié)至5.7，然后經(jīng)過高溫高壓滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 暖地杓蘭人工授粉

選取云南馬關(guān)野生居群暖地杓蘭開花植株(七月初盛開)進(jìn)行套袋并人工異花授粉，記錄授粉時(shí)間。

授粉時(shí)間 授粉最佳時(shí)間為母本開花后3～4 d。父本取已充分成熟的花粉塊，以提高坐果率?；ǚ蹓K以松軟膨脹、帽蓋被稍頂起、邊緣微顯花粉為佳。一般選擇在晴天1000—1600時(shí)進(jìn)行，雨天或露水未干時(shí)不宜授粉。

授粉方法 授粉工具一般用尖嘴鑷子，無鑷子可用針或竹針。授粉時(shí)先用鑷子自下往上挑開父本藥帽，將花粉塊移到干凈紙片上，隨手將選定的母本的柱蕊和唇瓣撐開，夾取花粉塊放到柱頭上讓粘液粘住，然后把柱蕊和唇瓣恢復(fù)原狀。

1.2.2 暖地杓蘭果莢及種子采收

采集暖地杓蘭人工異花授粉后105 d的果莢作為種子繁育的材料。

1.2.3 暖地杓蘭果莢無菌處理

采集成熟未裂開的暖地杓蘭果莢，將果莢進(jìn)行清洗，在無菌環(huán)境下用大量無菌水沖洗，果莢表面用75%無水乙醇擦拭，后用10%的次氯酸鈉溶液(內(nèi)加一滴Tween 20)消毒10 min，再用1%升汞消毒5 min。表面滅菌后，將果莢切開，在無菌培養(yǎng)皿中用鑷子取出種子[14]。

1.2.4 暖地杓蘭種子繁育及培養(yǎng)基篩選

配制MS、1/2MS、1/4MS、B5、VW、花寶1號(hào)、改良Norstog培養(yǎng)基，用5 mol/L NaOH溶液來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.7，在121 ℃高壓滅菌20 min。將已消毒的暖地杓蘭種子均勻的播撒到培養(yǎng)基表面，每瓶約100粒種子，將培養(yǎng)瓶在(25±1)℃和恒定黑暗的生長(zhǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，種子膨脹胚突破種皮確認(rèn)為種子萌發(fā)，萌發(fā)率的計(jì)算方法是將萌發(fā)的種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100。根據(jù)種子的萌發(fā)情況及萌發(fā)率篩選出適合暖地杓蘭種子萌發(fā)的培養(yǎng)基。

1.2.5 暖地杓蘭繼代培養(yǎng)

將已萌發(fā)并長(zhǎng)到一定大小的暖地杓蘭根莖苗轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.6 暖地杓蘭種苗移植前處理

將可以出瓶的暖地杓蘭無菌苗進(jìn)行煉苗處理[15](將待出瓶無菌苗組培瓶放置于大棚中的陰涼位置處一周；后將瓶蓋擰松，再放置一周；再將瓶蓋擰開一半，再放置一周；最后將瓶蓋全部拿開，放置一周；煉苗時(shí)將大棚溫度控制在15～25 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，光照強(qiáng)度為800～1 000 Lx)，然后洗凈根部培養(yǎng)基，將幼苗放在自封袋中(保濕)放入4 ℃冰箱進(jìn)行春化，春化期間注意觀察濕度及芽的情況，春天轉(zhuǎn)暖時(shí)即可移栽。

1.2.7 暖地杓蘭種苗移栽及不同栽培基質(zhì)對(duì)移栽的影響

栽培基質(zhì)分別選用森林土、1︰1森林土和樹皮、1︰1泥炭土和蘭石混合基質(zhì)，基質(zhì)用2 000倍的高錳酸鉀溶液進(jìn)行殺菌，篩選最適宜暖地杓蘭栽培的基質(zhì)。將經(jīng)過春化的暖地杓蘭小苗用2 000倍的農(nóng)用硫酸鏈霉素浸泡30 min，然后晾干，進(jìn)行栽培。將經(jīng)過殺菌處理的暖地杓蘭種苗種植于裝有混合基質(zhì)的陶盆中，每種基質(zhì)種植5盆，每盆種10棵，將根埋住，芽點(diǎn)裸露在外面。栽培條件為棚內(nèi)溫度控制在15～25 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，光照強(qiáng)度為800～1 000 Lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 暖地杓蘭人工授粉及果莢

采用異株異花授粉方式，對(duì)10株暖地杓蘭進(jìn)行人工授粉，每株異株異花授粉5個(gè)花朵，共授粉50朵花，授粉105 d后共采集到45個(gè)果莢，其中有5個(gè)果莢發(fā)育不完全枯死。暖地杓蘭異株異花坐果率達(dá)90%，授粉前進(jìn)行套袋處理，能顯著提高果莢質(zhì)量，果莢在野外被蟲咬食的情況得到控制。

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2.2 暖地杓蘭果莢消毒與播種處理

在無菌工作臺(tái)中，用10%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，播種5 d后污染率為8%；采用1%升汞消毒15 min，播種5 d后污染率為5%；分別用10%的次氯酸鈉溶液(內(nèi)加一滴Tween 20)消毒10 min和1%升汞消毒5 min后，播種5 d后污染率為1%，見圖2。

圖2 暖地杓蘭果莢無菌處理

2.3 暖地杓蘭種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)基確定

暖地杓蘭種子在MS、1/2MS、1/4MS、B5、VW、花寶1號(hào)、改良 Norstog培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)180～210 d，除了在改良 Norstog培養(yǎng)基中種子有萌發(fā)外，其余培養(yǎng)基中種子均沒有萌發(fā)，最終確定暖地杓蘭種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基為改良Norstog 培養(yǎng)基。暖地杓蘭播種在改良Norstog培養(yǎng)基中4 個(gè)月后，種子開始陸續(xù)萌發(fā)，種子的萌發(fā)率為31.21%。在萌發(fā)培養(yǎng)基中添加8 μmol/L 6-(γ，γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)，能提高暖地杓蘭種子的萌發(fā)率(38.74%)且原球莖未褐化，見圖3。

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2.4 暖地杓蘭繼代培養(yǎng)次數(shù)

從播種后第6個(gè)月開始將發(fā)育中的幼苗轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 3個(gè)月后，幼苗體積增大，根系形成明顯。之后再培養(yǎng)3個(gè)月，再進(jìn)行2次繼代培養(yǎng)，當(dāng)根長(zhǎng)到10 cm 左右，長(zhǎng)出芽點(diǎn)時(shí)，即可出瓶移栽。繼代培養(yǎng)過程中，暖地杓蘭幼苗能根長(zhǎng)大長(zhǎng)粗并長(zhǎng)出芽點(diǎn)，見圖4。從圖中可以看出，隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間及次數(shù)的增加，暖地杓蘭幼苗體積增大，根長(zhǎng)長(zhǎng)、長(zhǎng)粗，長(zhǎng)出芽點(diǎn)，兩次繼代培養(yǎng)后根長(zhǎng)到10 cm左右，有2～3條根。

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2.5 不同栽培基質(zhì)對(duì)暖地杓蘭移栽成活率的影響

將根長(zhǎng)10 cm左右，具2～3條根，并具芽點(diǎn)的暖地杓蘭根莖苗進(jìn)行煉苗，然后從培養(yǎng)瓶中拿出，洗凈培養(yǎng)基后晾半干，放入塑料密封袋中放4 ℃冰箱中避光進(jìn)行春化處理3～4個(gè)月(圖5)，春化后的根狀苗拿出進(jìn)行種植。在3種基質(zhì)中，暖地杓蘭幼苗都能成活。在森林土中栽培180 d后種苗平均成活率為50%；在1︰1森林土和樹皮栽培180 d后種苗平均成活率為60%；最適宜暖地杓蘭栽培的基質(zhì)為1︰1泥炭土和蘭石混合基質(zhì)，在該基質(zhì)中移栽180 d后暖地杓蘭小苗平均成活率達(dá)90%。

圖5 暖地杓蘭根莖苗春化處理

2.6 暖地杓蘭幼苗栽培

暖地杓蘭幼苗移栽成活后，進(jìn)行栽培管理。施肥：每盆施撒15 g緩釋肥，每年春季、秋季各施撒一次。

(1)澆水 基質(zhì)發(fā)白噴灑水，澆濕即可。

(2)病蟲害 暖地杓蘭幼苗常見的病害有蝸牛和地老虎，用四聚乙醛和氯氰菊酯進(jìn)行殺蟲。暖地杓蘭移栽后的生長(zhǎng)情況見圖6。由圖6可知，暖地杓蘭幼苗移栽栽培120 d后，芽點(diǎn)進(jìn)一步長(zhǎng)大，并舒展長(zhǎng)出葉片。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

杓蘭的繁殖主要以種子無菌(非共生)萌發(fā)繁殖為主[6-12]，影響蘭科植物種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)的主要因素包括種子成熟度，溫度，光照，基本培養(yǎng)基的種類，植物激素(生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素及其濃度配比)，氮源，碳源(蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖等)，活性炭是否添加及其濃度，天然有機(jī)物提取物(土豆汁、香蕉汁、椰汁等)等。通過控制這些影響因素可以調(diào)節(jié)蘭科植物種子的非共生萌發(fā)，使得蘭科種子的萌發(fā)可能性更大、萌發(fā)速度更快、萌發(fā)率更高。同屬不同種蘭花，因生態(tài)分布不同、海拔、氣候及土壤環(huán)境不同，會(huì)導(dǎo)致蘭花的生存模式、植株及種子營(yíng)養(yǎng)利用模式的不同，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)營(yíng)養(yǎng)貧富利用的各異。蔣宏等[8]在改良1/4MS培養(yǎng)基中對(duì)長(zhǎng)瓣杓蘭(Cypripediumlentiginosum)進(jìn)行體外萌發(fā)繁育，最佳萌發(fā)率為54.1%。黃家林等[12]以授粉15周后的黃花杓蘭(C.flavum)種子經(jīng)0.5%NaClO溶液處理后在改良型Harvais培養(yǎng)基中培養(yǎng)20周后種子最高萌發(fā)率達(dá)到90%。同時(shí)以Harvais(Ha)為基本培養(yǎng)基對(duì)紫點(diǎn)杓蘭(C.guttatum)成熟蒴果中的種子進(jìn)行離體繁殖，成功地繁育出紫點(diǎn)杓蘭植株[16]。鄧蓮等[17]以大花杓蘭(C.macranthum)蒴果為研究材料，對(duì)大花杓蘭種子進(jìn)行非共生萌發(fā)研究，在VWD改良培養(yǎng)基上種子萌發(fā)最好，萌發(fā)率可達(dá)68.06%。培養(yǎng)基中加入1.2 mg/L的KT可以促進(jìn)種子萌發(fā)并維持低褐化率。

暖地杓蘭種子木質(zhì)化的內(nèi)層和外層種皮導(dǎo)致種子休眠，種子萌發(fā)極其困難，暖地杓蘭的繁育研究鮮有報(bào)道。本研究采用非共生的萌發(fā)方法，以暖地杓蘭成熟未開裂的果莢為試驗(yàn)材料，分別在MS、1/2MS、1/4MS、B5、VW、花寶1號(hào)、改良 Norstog培養(yǎng)基中進(jìn)行非共生萌發(fā)暗培養(yǎng)180～210 d，結(jié)果顯示：除了在改良Norstog培養(yǎng)基中種子有萌發(fā)外，其余培養(yǎng)基中種子均沒有萌發(fā)，最終確定暖地杓蘭種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基為改良Norstog培養(yǎng)基。雖然研究中暖地杓蘭種子在篩選出的改良Norstog培養(yǎng)基中可以萌發(fā)成苗，但種子萌發(fā)率僅有30%，今后深入研究以提高改善暖地杓蘭的種子萌發(fā)率，以期獲得更多的種苗。

3.2 結(jié)論

暖地杓蘭播種在改良Norstog 培養(yǎng)基中4 個(gè)月后，種子開始陸續(xù)萌發(fā)，種子的萌發(fā)率為31.21%。在萌發(fā)培養(yǎng)基中添加8 μmol/L 6-(γ，γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)，能提高暖地杓蘭種子的萌發(fā)率(38.74%)且原球莖未褐化，最終能分化出根及芽。根莖苗出瓶春化栽培后能順利舒展出葉片，長(zhǎng)大的植株最終能否回歸到原生境中，實(shí)現(xiàn)回歸保育，緩解瀕危狀況仍需長(zhǎng)期觀察評(píng)估。