陳詩(shī)，母德錦，王瑜，陳林，唐軍榮，蔡年輝，許玉蘭，李孫玲

(1.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201)

氮、磷是植物中核酸、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要組成營(yíng)養(yǎng)元素，不僅在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和各種生理機(jī)制調(diào)節(jié)過程中起到重要的作用，還參與到了地球化學(xué)循環(huán)[1-2]。前人的研究表明，植物葉片中的氮、磷化學(xué)計(jì)量特性變化，可作為判別植物受養(yǎng)分限制的依據(jù)[3]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定植物葉片中氮、磷含量，對(duì)于植物營(yíng)養(yǎng)分析與評(píng)價(jià)、水肥管理以及植物生態(tài)適應(yīng)策略有著重要意義[4-6]。植物全氮、全磷含量測(cè)定的經(jīng)典方法分別是凱氏定氮法和鉬銻抗比色法[7]。但傳統(tǒng)的測(cè)定方法操作繁瑣、受人為影響較大、檢測(cè)分析效率較低、較難滿足快速批量測(cè)定的要求。近年來儀器檢測(cè)技術(shù)得到了越來越多的應(yīng)用[8-11]，但是凱氏定氮儀、分光光度儀、元素分析儀等儀器不能同時(shí)滿足氮、磷含量的測(cè)定，使用效率降低，而流動(dòng)分析儀雖可同時(shí)測(cè)定氮、磷元素含量，卻因價(jià)格高昂以及對(duì)機(jī)器維護(hù)保養(yǎng)以及模塊更換要求高而使用率低。

SmartChem 200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀是最近幾年來離子分析儀器領(lǐng)域中新突破，能夠同時(shí)測(cè)定氮、磷元素含量，因其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)準(zhǔn)確度高，價(jià)格適中等優(yōu)點(diǎn)得到了環(huán)保、農(nóng)林、水產(chǎn)行業(yè)等領(lǐng)域的青睞。前人對(duì)該儀器的測(cè)定方法研究多集中在水質(zhì)監(jiān)測(cè)[12-13]、食品營(yíng)養(yǎng)[14-15]、土壤元素[16]等方面，而對(duì)植物葉片中氮、磷元素測(cè)定方法研究較少。因此，本研究以西南林業(yè)大學(xué)智能溫室大棚1 a生云南松(Pinusyunnanensis)苗的根、莖、葉器官為測(cè)試材料，應(yīng)用SmartChem 200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀進(jìn)行測(cè)定，建立同時(shí)測(cè)定植物葉片中全氮、全磷含量的方法，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)方法結(jié)果做比較，驗(yàn)證該儀器的優(yōu)良性，以期為批量測(cè)定植物中全氮、全磷的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2022年9月于西南林業(yè)大學(xué)智能溫室大棚云南松苗圃采集1 a生云南松針葉樣品14份、莖樣品14份、根樣品14份，共42份樣，依次編號(hào)1～42號(hào)。采樣后將植物材料在120 ℃烘箱殺青30 min，再80 ℃烘至恒重，粉碎機(jī)研磨后將過孔徑100目篩的顆粒干燥備用。

1.2 主要儀器

SmartChem 200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀，萬(wàn)分之一電子分析天平，烘箱，LWY84B型遠(yuǎn)紅外消煮爐等。

1.3 藥品

酒石酸鉀鈉、過氧化氫、氯化鉀、水楊酸鈉、氫氧化鈉、硝普鈉、次氯酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、半水合酒石酸銻鉀、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、氫氧化鉀、四水鉬酸銨、二氯異氰尿酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、曲拉通、異丙醇、聚氧乙烯月桂醚。按照儀器說明書方法配置針洗液、稀釋液、酒石酸銻鉀溶液、TPA試劑、TPB試劑、TPC試劑、磷50 mg/L儲(chǔ)備標(biāo)樣、氮60 mg/L儲(chǔ)備標(biāo)樣、TNA試劑、TNB試劑、TNC試劑。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)原理

通過濃硫酸的消煮過程，將處于游離狀態(tài)的氨根離子、有機(jī)氮和氮元素轉(zhuǎn)化形成硫酸銨。氨與次氯酸鹽和水楊酸鹽反應(yīng)會(huì)生成與氨濃度成正比的藍(lán)色物質(zhì)，加入硝普鈉能夠增加顯色程度，酒石酸鉀鈉則能夠消除鈣離子、鎂離子等的影響，其中的紅色絡(luò)合物在660 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，可測(cè)定其吸光度，由此計(jì)算氮的濃度。磷在酒石酸銻鉀存在的條件下會(huì)與鉬酸銨反應(yīng)生成淡黃色的磷鉬酸銨復(fù)合物，再用還原劑抗壞血酸還原生成深藍(lán)色的鉬藍(lán)，于880 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算磷的濃度。

1.4.2 樣品的處理

基于陳劍磊等[16]的方法改良。稱取0.20 g植物樣品倒入消煮管中，加入1.5 mL去離子水潤(rùn)濕后，再加入5 mL 98%濃硫酸，使用振蕩器搖勻使其充分碳化。將裝有碳化后樣品的消煮管置于遠(yuǎn)紅外消煮爐中消解并將溫度調(diào)至80 ℃，待消煮爐溫度上升至80 ℃時(shí)向消煮管內(nèi)加入5滴30%過氧化氫。按此方法每間隔30 min將消煮爐溫度升至160、240、280、320 ℃，過氧化氫量逐次減少直至消煮管內(nèi)液體澄清，340 ℃時(shí)需加熱5～10 min。除不加樣品液外，空白試驗(yàn)也照此方法進(jìn)行。待消煮管自然冷卻后，用去離子水將管內(nèi)液體沖洗入50 mL容量瓶并定容。過濾后的上清液按氮500倍、磷100倍稀釋備測(cè)。

1.4.3 上機(jī)步驟

待電腦和SmartChem 200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀開機(jī)預(yù)熱15 min后，依次在反應(yīng)池中添加樣品、1%硫酸稀釋液、針洗液、標(biāo)樣試劑、TNA試劑、TNB試劑、TNC試劑、TPA試劑、TPB試劑、TPC試劑以及測(cè)標(biāo)曲需要的5個(gè)空樣杯。

在全自動(dòng)間斷化學(xué)分析控制軟件上選用0～12 mg/L(以N計(jì))測(cè)量范圍設(shè)定參數(shù)，將濾光片F(xiàn)ilter1設(shè)定為660 nm并啟用Fluidics，設(shè)置樣品量30 uL、TNA試劑290 uL并延時(shí)36 s、TNB試劑64 uL并延時(shí)36 s、TNC試劑32 uL并讀數(shù)612 s，機(jī)器可自動(dòng)將標(biāo)準(zhǔn)氮稀釋為0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、12.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)液。全自動(dòng)間斷分析儀先按照上述檢測(cè)條建立全氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=18.059 9X+0.007 5(R2=0.999 9)。

選取以0～5 mg/L(以P計(jì))測(cè)量范圍設(shè)定磷的標(biāo)曲參數(shù)。將濾光片F(xiàn)ilter1設(shè)定為880 nm啟用Fluidics，設(shè)置樣品量48 uL、TPA試劑292 uL并延時(shí)36 s、TPB試劑56 uL、TPC試劑24 uL并讀數(shù)576 s，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)將標(biāo)準(zhǔn)磷稀釋為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)液。按上述檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，全磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=8.476 0X-0.1707(R2=0.999 4)。然后對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)分析，分析結(jié)束后將測(cè)定結(jié)果導(dǎo)出計(jì)算含量。

1.5 結(jié)果計(jì)算

全氮計(jì)算公式如下。

W=C×0.5/M

①

全磷計(jì)算公式如下。

W=C×0.1/M

②

式中：W為氮、磷元素含量，單位g/kg；C為機(jī)器測(cè)定出的吸光度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的氮、磷濃度，單位mg/L；M為樣品質(zhì)量，單位為g。

加標(biāo)回收率的計(jì)算公式如下。

R(%)=(Cs-C)/S×100

③

式中：R是回收率，Cs為加標(biāo)樣品含量，C為樣品含量，S為加到樣品中的分析物量。

精確度實(shí)驗(yàn)中，選定的樣品消煮液重復(fù)測(cè)定3次；測(cè)定值Xi的算術(shù)平均值為樣品元素含量的估測(cè)值，用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，即

④

RSD=SD/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值×100%

⑤

式中：xi為測(cè)定值，SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析與數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并利用直線回歸方程作圖分析全自動(dòng)間斷分析儀和傳統(tǒng)方法測(cè)定植物全氮、全磷含量的相關(guān)性及顯著性，采用Spss 18.0軟件對(duì)不同方法測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全自動(dòng)間斷分析儀與傳統(tǒng)方法所測(cè)植物全氮、全磷的比較

本實(shí)驗(yàn)中所用的42個(gè)云南松苗各器官樣本全氮含量在5.935～14.960 g/kg之間，全磷含量在1.442～2.426 g/kg之間。由表1可知?jiǎng)P氏定氮儀與全自動(dòng)間斷分析儀測(cè)定的全氮平均含量為10.108 g/kg和10.020 g/kg，雙側(cè)t檢驗(yàn)，P(T≤t)=0.128，表明實(shí)驗(yàn)中所用的2種方法測(cè)定的相同材料全氮含量差異不顯著。鉬銻抗比色法與全自動(dòng)間斷分析儀測(cè)定的全磷平均含量為1.916 g/kg和1.908 g/kg，雙側(cè)t檢驗(yàn)，P(T≤t)=0.397，表明實(shí)驗(yàn)中用同2種方法測(cè)定的同種植物材料樣品全磷含量無(wú)差異。

表1 傳統(tǒng)方法與全自動(dòng)間斷分析儀測(cè)定植物全氮、全磷含量t檢驗(yàn)

2.2 全自動(dòng)間斷分析儀與傳統(tǒng)方法所測(cè)全氮、全磷含量的相關(guān)性

由圖1可知，全自動(dòng)間斷分析儀與凱氏定氮儀所測(cè)定全氮含量擬合的回歸方程為Y=0.982 8X+0.261(R2=0.979 3)，因此2種方法所測(cè)定的全氮數(shù)值相關(guān)性極顯著(P<0.01)。全自動(dòng)間斷分析儀與鉬銻抗比色法測(cè)定的全磷含量所擬合的回歸方程Y=1.091 9X-0.167 7(R2=0.966 7)，進(jìn)一步說明2種方法測(cè)定的全磷含量相關(guān)性極顯著(P<0.01)。2個(gè)方程的斜率分別是0.982 8和1.091 9，比較趨近于1，表明全自動(dòng)間斷分析儀與傳統(tǒng)方法所測(cè)定的全氮、全磷含量結(jié)果較一致。

圖1 全自動(dòng)間斷分析儀與傳統(tǒng)方法測(cè)定植物全氮、全磷含量的相關(guān)性

2.3 全自動(dòng)間斷分析儀測(cè)定全氮、全磷含量回收率與精確度分析

以其中3個(gè)樣品(11號(hào)、17號(hào)、32號(hào))為本底，加入NH4CL 100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)氮和KH2PO450 mg/L標(biāo)準(zhǔn)磷進(jìn)行回收率測(cè)定方法的驗(yàn)證。在相同條件下，按照表2量進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，全自動(dòng)間斷分析儀測(cè)定全氮的回收率(R)為98.900%～101.850%，全磷的R為96.100%～105.200%。說明全自動(dòng)間斷分析儀同時(shí)測(cè)定全氮、全磷的準(zhǔn)確度較高。

表2 全氮、全磷的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在相同測(cè)定環(huán)境下，用全自動(dòng)間斷分析儀對(duì)11號(hào)、17號(hào)、32號(hào)的樣品全氮、全磷平行測(cè)定3次，結(jié)果見表3。全氮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.020%～2.790%，全磷的RSD為0.250%～1.280%，由此可見該方法對(duì)植物全氮、全磷測(cè)定的精密度較高，結(jié)果穩(wěn)定。

表3 全氮、全磷平行測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

測(cè)定植物全氮、全磷含量，無(wú)論是應(yīng)用傳統(tǒng)測(cè)定方法還是自動(dòng)化儀器測(cè)定方法，首先都需要將樣品材料預(yù)處理成待測(cè)液，再進(jìn)行測(cè)定。而待測(cè)液的制備所需要消耗的時(shí)間和精力成本往往比含量檢測(cè)消耗得更多，樣品材料的消煮過程將直接影響到元素含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。本研究雖然選用硫酸-過氧化氫對(duì)干樣進(jìn)行消煮，但在消煮溫度上采用階梯式增溫的方式，而非直接370 ℃消煮[17-18]。因此，避免了直接過高的溫度導(dǎo)致消煮管中的液體一直沸騰放熱，樣品容易噴濺到消煮管壁上，導(dǎo)致消煮不完全而造成材料損失影響精度的，同時(shí)給檢測(cè)人員帶來危險(xiǎn)，污染周圍環(huán)境等情況。消煮到320 ℃時(shí)消煮管內(nèi)液體顏色透明無(wú)色，仍需在320 ℃煮10 min，此步驟可除去消煮管內(nèi)剩余的過氧化氫，減少測(cè)定時(shí)的干擾[19]。

傳統(tǒng)的凱氏定氮法測(cè)氮是將消煮液中的銨鹽經(jīng)過堿化后形成氨，并在濃堿作用下蒸餾將氨吸收到硼酸溶液中形成硼酸胺，加入甲基紅-溴甲酚綠指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定的消耗量來計(jì)算出樣品中的全氮含量[20]。鉬銻抗比色法測(cè)磷的原理則是樣品液中的正磷酸與偏釩酸以及鉬酸反應(yīng)得到黃色的三元雜多酸，在880 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，并利用其吸光度與磷酸濃度成正比關(guān)系計(jì)算磷濃度[17]?？梢?種測(cè)定氮、磷含量方法的原理與全自動(dòng)間斷分析儀測(cè)定原理完全不相同。就測(cè)定結(jié)果比對(duì)而言，二者數(shù)值無(wú)顯著的差異，并存在顯著的線性關(guān)系，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，精密度均優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(10%、15%)[21-22]，說明不管是傳統(tǒng)方法還是全自動(dòng)間斷分析儀方法均能準(zhǔn)確測(cè)定植物全氮和全磷含量。

本研究所用SmartChem 200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀由預(yù)設(shè)的程序控制，是將傳統(tǒng)比色分析法自動(dòng)化的儀器。通過全自動(dòng)機(jī)器手帶動(dòng)取樣針把藥品液和待測(cè)液精準(zhǔn)地加入比色皿中，再自動(dòng)攪拌、反應(yīng)，再利用雙光束高精度數(shù)字檢測(cè)器測(cè)定吸光度，通過標(biāo)曲公式可自動(dòng)計(jì)算得到相應(yīng)的濃度，整理結(jié)果報(bào)告，可以有效避免人為操作誤差。按照溫云杰等[23]對(duì)傳統(tǒng)凱氏定氮法的計(jì)算表明樣品待測(cè)液吸取、蒸餾、滴定過程總共耗時(shí)約為6 min，按照每天測(cè)定工作時(shí)間7 h算，每天大約可檢測(cè)70個(gè)樣品，這其中還沒有包括硼酸反應(yīng)液與酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液配制與標(biāo)定耗時(shí)，測(cè)定過程中每個(gè)樣品用量約40 mL，消耗試劑約50 mL。李萍等[17]對(duì)鉬銻抗比色法測(cè)磷的計(jì)算表明從待測(cè)液加入二硝基酚指示劑后滴加氫氧化鈉溶液顯色開始，再到添加硫酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，最后到添加鉬銻抗試劑反應(yīng)等待變色測(cè)定，至少需要35 min，而測(cè)定過程中每個(gè)樣品用量約5 mL，消耗試劑約50 mL。全自動(dòng)化學(xué)間斷分析儀一次可測(cè)定最多126個(gè)樣品，測(cè)定速度可達(dá)每小時(shí)200個(gè)樣，測(cè)定400個(gè)樣品僅需40 mL試劑，每個(gè)樣品待測(cè)液用量3 mL。因此SmartChem 200全自動(dòng)間斷分析儀在測(cè)定植物全氮、全磷時(shí)，節(jié)省樣品和試劑、減小污染，同時(shí)消除了因?yàn)槿藛T操作和條件差異而產(chǎn)生的誤差。

3.2 結(jié)論

與傳統(tǒng)的凱氏定氮法和鉬銻抗比色法測(cè)定氮、磷相比，SmartChem 200全自動(dòng)間斷分析儀測(cè)定1 a生云南松苗全氮、全磷含量無(wú)明顯差異，并且與傳統(tǒng)方法測(cè)定的數(shù)據(jù)呈顯著的相關(guān)性，全氮的RSD在3%以內(nèi)、全磷的RSD在2%以內(nèi)，且該方法測(cè)定回收率在98.90%～101.85%和96.10%～105.20%之間。上述分析結(jié)果表明，應(yīng)用SmartChem 200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀同時(shí)測(cè)定植物樣品中全氮、全磷的方法集自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)稀釋、分光光度計(jì)、數(shù)據(jù)處理為一體，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、回收率高、測(cè)量速度快、藥品和樣品用量少、高度自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究中的方法可以應(yīng)用于批量檢測(cè)植物全氮、全磷含量。