周孝敏，魚麗萍

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指由于各種因素導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，可引起損傷平面以下運動、感覺和括約肌等功能障礙。全球SCI 的發(fā)病率約為25～50 萬人/年[1,2]。目前SCI 的治療方法包括手術減壓、糖皮質激素及康復訓練[3]等，但目前療效仍十分有限。尋找更有效的SCI治療新方法具有重要的意義。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植在SCI 中的作用已被廣泛研究，但細胞移植仍受許多限制，如低生存率、免疫排斥反應、致瘤性等[4]。研究表明，基于細胞治療的有益結果一部分源于供體細胞釋放的外泌體，而這些外泌體中的微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）對SCI 修復有積極的影響[5]。本文對近幾年關于外泌體miRNAs 在SCI 中的診治作用研究進展做一綜述，為外泌體miRNAs與SCI的進一步研究提供一定的參考及臨床治療新思路。

1 概述

1.1 外泌體

1983年，外泌體首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，最初被認為是細胞廢物[6]。研究發(fā)現(xiàn)，體內幾乎所有類型的細胞都可以分泌外泌體[7]，且其存在于幾乎所有的體液中，包括血液、腦脊液、唾液、尿液等[8]。此外，外泌體含有不同的核酸，如mRNA、miRNA 和lncRNA，這些核酸被認為是疾病診斷的潛在標志物[9]。最近研究表明，外泌體由于能夠攜帶功能性miRNAs 或其他小分子，可以作為診斷和治療疾病的潛在工具。同時，還可以選擇性的改變外泌體的內容物，這也有助于運用于疾病的靶向治療。

1.2 miRNAs和外泌體miRNAs

miRNAs 是指平均長度約為22 個核苷酸的內源性非編碼小RNA，主要調控轉錄后的基因表達，并參與許多細胞過程的調控[10]。miRNAs在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，研究表明，多種miRNAs 都參與了SCI 的一系列病理生理過程[11]。外泌體miRNAs 是指通過外泌體介導的miRNAs，包括外泌體中內容物含有的miRNAs及通過轉染等方法使外泌體過表達的miRNAs。研究提示，miRNAs是治療SCI的重要靶點及早期SCI 的生物標志物。具有雙層膜結構的外泌體不僅可以保護miRNAs 免于快速被降解，還可以作為miRNAs 靶向治療SCI 的有效載體，外泌體還可以穿透血腦屏障、血脊髓屏障，這有益于增強miRNAs 的治療效果[12]。

2 外泌體miRNAs對SCI的作用

2.1 外泌體miRNAs對SCI的治療作用

目前關于SCI 治療的研究中，多種外泌體miRNAs 被納入研究，本綜述主要介紹miRNA-126、miRNA-21和miRNA-29b。2.1.1 miRNA-126 miRNA-126 作為一種內皮細胞特異性的miRNA，具有介導血管發(fā)育、生成的功能。研究發(fā)現(xiàn)，將過表達miRNA-126的MSCs移植入SCI大鼠脊髓損傷區(qū)可促進神經(jīng)功能的恢復，其可能機制是抑制了損傷區(qū)的炎癥反應[13]。HUANG JH等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在SCI大鼠模型中，轉染miRNA-126的間充質干細胞外泌體（MSC-exos）可以促進血管生成和神經(jīng)發(fā)生、抑制細胞凋亡，促進SCI 后的功能恢復。體外實驗還發(fā)現(xiàn)，來自miRNA-126 修飾的MSC-exos 通過抑制EVH1 結構域蛋白1（1PRED1）和磷酸肌醇-3 激酶調節(jié)亞基2（PIK3R2）的表達，促進血管生成和人臍靜脈內皮細胞的遷移。隨后一項研究也得出相似結論，miRNA-126修飾的MSC-exos顯著改善了SCI大鼠后肢運動功能、降低損傷脊髓體積、保護神經(jīng)元并促進SCI后的軸突再生，其潛在機制是miRNA-126抑制了RhoA，同時激活了ERK1/2、STAT3 和CREB[15]。這些研究提示，外泌體miRNA-126可促進血管生成和神經(jīng)發(fā)生，從而促進損傷脊髓的修復，但目前具體分子機制尚未明確。

2.1.2 miRNA-21 miRNA-21 是實體腫瘤中的一個抗凋亡基因。研究提示，SCI中上調miRNA-21有利于促進損傷脊髓的修復[16]。關于外泌體miRNA-21 與SCI 的相關研究近年來也引起學者們廣泛關注。JI 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs）表現(xiàn)出胰島素抵抗，而BMSCs 的這種胰島素抵抗降低了其分泌的外泌體miRNA-21 水平，失去了對SCI 的保護作用。通過在肥胖大鼠BMSCs 中轉染miRNA-21 后恢復了骨髓間充質干細胞外泌體對SCI的保護作用。這提示，主要是外泌體miRNA-21對SCI起積極作用。KANG等[18]在SD大鼠的SCI模型中發(fā)現(xiàn)miRNA-21表達降低，抑癌基因（PTEN）和程序性細胞死亡因子4（PDCD4）表達增加，用轉染后過表達miRNA-21的MSC-exos靜脈注射治療發(fā)現(xiàn)，miRNA-21可下調PTEN/PDCD4信號通路，抑制細胞死亡，增加神經(jīng)細胞活力從而改善SCI大鼠的運動功能。XU等[19]進行的體內、外實驗也得出了同樣的結論。然而，NING等[20]的研究卻得出矛盾的結果，在他們的研究中，SCI 大鼠中miRNA-21水平顯著增加，且通過在SCI區(qū)注射miRNA-21抑制劑可下調IL-6 受體蛋白、酪氨酸激酶（JAK）和轉錄激活因子3（STAT3），抑制炎癥反應，從而促進SCI的恢復。導致研究結果之間差異性的原因可能是SCI 是一個動態(tài)變化的過程，在不同時期miRNAs表達具有差異，其作用也不盡相同，提示應在損傷不同時期進行動態(tài)檢測相應miRNAs的變化。

2.1.3 miRNA-29b YU 等[21]分別運用BMSCs、miRNA-29b 轉染的BMSCs、BMSCs 提取的外泌體和轉染miRNA-29b 后從BMSCs 提取的外泌體對SCI 大鼠進行治療，對比發(fā)現(xiàn)miRNA-29b 外泌體和miRNA-29b 轉染的BMSCs 對SCI 大鼠的運動功能均有改善，且神經(jīng)絲蛋白200（NF200）、生長相關蛋白43（GAP-43）增加，以及神經(jīng)膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）減少。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，通過注射miRNA-29b 轉染后提取的BMSCs外泌體比直接注射miRNA-29b轉染的BMSCs恢復效果更顯著（P＜0.05）。提示miRNA-29b 是其中起作用的主要物質，且外泌體比直接移植干細胞療效更佳。最近研究發(fā)現(xiàn)，轉染miRNA-29b 的人神經(jīng)上皮干細胞外泌體可以通過下調PTEN/caspase-3信號通路，進而抑制神經(jīng)細胞的凋亡，促進SCI大鼠功能的恢復[22]。

2.1.4 其他外泌體miRNA 近兩年來，越來越多的外泌體miRNAs被大家納入研究，BMSCs來源的外泌體miRNA-544顯著抑制了SCI后促炎細胞因子IL-1a、TNF-a、IL-17b和IL-36b的產生，表明外泌體miRNA-544 可以通過減輕SCI 后的炎癥、促進神經(jīng)元存活從而改善功能恢復[23]。LI 等[24]通過外泌體miRNA-124-3 實驗發(fā)現(xiàn)，其通過調節(jié)內質網(wǎng)核心信號1（Ern1）和M2巨噬細胞的極化，減輕了脊髓缺血再灌注損傷（SCIRI）誘導的神經(jīng)損傷。在2020年，ZHANG等[25]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓源性巨噬細胞外泌體miRNA-421-3p可以結合到mTOR的3‘非翻譯區(qū)（3’UTR）直接抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR），從而促進自噬、減少細胞凋亡、修復損傷的脊髓。ZHANG 等發(fā)現(xiàn)，外泌體中miRNA-338-5p 的過表達顯著提高了神經(jīng)絲蛋白-m（NF-m)和GAP-43的表達水平，降低了髓鞘相關糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）和膠質纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）的表達水平，從而促進軸突生長，促進功能恢復。同時體外發(fā)現(xiàn)，在外泌體中miRNA-338-5p 的過表達抑制了過氧化氫誘導的PC12細胞氧化應激損傷后的細胞凋亡，其潛在機制是miRNA-338-5p 通過激活PI3K/Akt 信號通路，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡[26]。這些研究均提示外泌體miRNAs 對SCI具有修復作用，主要包括抑制細胞凋亡、減少脊髓生長的相關抑制因子、減輕炎癥反應等機制來促進功能恢復，但具體信號通路尚不清楚，見表1。

表1 外泌體miRNAs在SCI中的治療作用

2.2 外泌體miRNAs對SCI的生物標志作用

目前SCI患者病情嚴重程度和預后判斷的方法主要依靠美國SCI 協(xié)會（the American Spinal Injuries Association，ASIA）評分、神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查及影像學檢查。但ASIA 評分受到許多限制，如脊髓休克期、患者昏迷狀態(tài)下均難以執(zhí)行評估，同時存在主觀性強以及費時等缺點。而連續(xù)的影像學檢查對于患者來說是不現(xiàn)實的。因此，臨床工作中需尋找易于檢測且具有特異性的標志物來評估SCI 患者病情和臨床預后。近年來隨著對miRNAs 不斷研究發(fā)現(xiàn)，它們在體液中相對穩(wěn)定且具有組織特異性。因此，miRNAs 可能是一個非常好的候選標志物[27]。TIGCHELAAR[28]等研究發(fā)現(xiàn)，SCI 患者血清和腦脊液中分別有83個miRNAs和204個miRNAs在不同時期出現(xiàn)差異性表達，同時多種miRNAs與預后改善相關，其中miRNA-423-3p與半年后的功能恢復正相關。WANG等[29]納入113例SCI后神經(jīng)性疼痛患者的研究結果提示，miRNA-204-5p、miRNA-519d-3p、miRNA-20b-5p、miRNA-6838-5p 可能是SCI 患者的潛在生物標志物。

然而，外泌體miRNAs 廣泛分布于體液中，相較于游離miRNAs 具有許多優(yōu)點，如可以穿透血腦屏障、血脊髓屏障；外泌體的脂質雙分子膜可以增強miRNAs 的穩(wěn)定性，同時中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特定miRNAs 可被運輸?shù)酵庵苎h(huán)并集中在外泌體中，從而提高檢測時體液中miRNAs 擴增的敏感性以及降低出現(xiàn)假陰性結果的可能性[30,31]。DING 團隊運用下一代測序對比分析了假手術組和SCI大鼠血清外泌體的miRNAs譜。結果顯示，與對照組相比，SCI可導致血清外泌體miRNAs發(fā)生改變，其中98 個miRNAs 上調，43 個miRNAs 下調。這提示雖然單個miRNAs 可能缺乏特異性，但結合這些有價值的miRNAs，如miRNA-30b-5p、miRNA-152-3p、miRNA-200c-3p、miRNA-125b和miRNA-124-3p 形成檢測譜對SCI 的診斷和預后具有重要意義[32]。KHAN等[33]發(fā)現(xiàn)，SCI小鼠模型血漿中外泌體miRNAs主要 包 括 ：miRNA-93-5p、miRNA-486-5p、miRNA-21-5p、miRNA-29b-3p 和miNAR-206 在傷后發(fā)生了顯著的變化，且其變化與炎癥刺激后星形膠質細胞釋放的外泌體miRNAs的變化相似。當將其注射到SCI 小鼠側腦室時，增加了腦皮質的促炎基因及反應性星形膠質細胞基因的表達，提示SCI 后血漿外泌體可能與創(chuàng)傷后腦炎相關。提示這些改變的miRNAs及其相關分子機制也許可以解釋SCI 的潛在病理機制，外泌體miRNAs不但可以作為SCI 早期的生物標志物，而且對相關機制研究以及治療都有一定的啟發(fā)作用。

3 小結與展望

綜上所述，SCI 無論是對患者還是家庭和社會都產生不可忽視的影響。然而，目前尚無成功的臨床治療方法。外泌體miRNAs因其特有的穩(wěn)定性、能通過血腦屏障和血腦脊髓屏障、廣泛分布于各種體液等特點，逐漸成為醫(yī)學研究的熱點。外泌體miRNAs 與SCI 的多種病理生理密切相關，同時多項研究提示外泌體miRNAs 具有促進SCI 功能恢復的作用，同時具有幫助SCI早期診斷的生物標志作用。但目前外泌體miRNAs促進SCI 相關功能恢復的具體分子機制及信號通路尚不明確，且目前的研究都處于體內、體外模型實驗階段，運用到臨床仍有許多問題亟待解決。在不久的將來，外泌體miRNAs 有望成為一種具有特異性且簡便可行的新方法協(xié)助SCI 的早期診斷，也可能作為一種生物活性載體結合生物材料和藥物等實現(xiàn)其對疾病的靶向治療。