陳棉棉，王培琳，謝新暉，聶昭雯，劉忠純

0 背景

抑郁癥（major depressive disorder，MDD）發(fā)病率持續(xù)增高，影響患者的身心健康[1]。MDD 相關的遺傳、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫相關機制受到廣泛關注[2]。隨著測序技術的發(fā)展，腸道微生物群與MDD 的關系逐漸成為研究熱點[3,4]。在抑郁癥患者中檢測到了腸道微生物群的改變[5]，將MDD患者的腸道微生物移植到嚙齒類動物體內(nèi)，可以誘發(fā)抑郁樣行為[6,7]，口服益生菌后又觀察到此類抑郁樣行動的減少[8]。因此，腸道微生物群被認為與MDD的致病機制相關。

然而，目前對腸道微生物群落的分析主要集中在疾病中微生物物種豐度或功能的改變，較少關注對物種間關系的探索，可能導致對微生物群落部分特征的忽略。在群落中，其組成物種不是獨立的，而是相互作用的。在宏觀生態(tài)研究，例如對海洋、土壤等環(huán)境微生物群落的研究中，已經(jīng)廣泛開展了微生物共存網(wǎng)絡（co-occurrence network）的分析，以獲取微生物相互作用、結構變化的信息[9,10]。而在腸道微生物領域，共存網(wǎng)絡分析仍然有待發(fā)展。

因此，本研究招募MDD 患者，采集糞便樣本進行宏基因組測序，將數(shù)據(jù)應用于微生物共存網(wǎng)絡的構建與后續(xù)的分析。構建腸道微生物共存網(wǎng)絡，探索與健康對照相比，MDD 人群腸道微生物共存網(wǎng)絡的改變，并比較2 組網(wǎng)絡的拓撲屬性以及關鍵節(jié)點的變化，以補充一個新的、純豐度或功能數(shù)據(jù)以外的視角，探索MDD 中微生物物種之間相互作用關系的改變，探明MDD患者失調的腸道微生態(tài)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從2020 年至2021 年就診于武漢大學人民醫(yī)院精神衛(wèi)生中心的患者中，招募首發(fā)或復發(fā)MDD 患者，符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊（第五版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-fifth edition，DSM-5）中重性抑郁發(fā)作（當前2 周）的診斷標準。同時招募一般人口學數(shù)據(jù)相匹配的健康人納入對照組（healthy control，HC）。排除患有或共病符合DSM-5標準的其他精神障礙以及腦器質疾病所致精神障礙，患有嚴重的軀體疾病、代謝相關疾病或者免疫相關疾病，既往顱腦外傷史，1周內(nèi)有益生菌、益生元、抗生素使用史的受試者。本研究通過武漢大學人民醫(yī)院學術倫理道德委員會審核。所有被試均自愿參與本項研究并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 患者信息收集 為全面反映樣本特征，采集一般人口學信息，并使用漢密爾頓抑郁量表（Hamilton depression scale-17，HAMD-17）和患者健康問卷（Patient Health Questionnaire-9，PHQ-9）進行抑郁嚴重程度的他評和自評；使用漢密爾頓焦慮量表（Hamilton anxiety scale，HAMA）和廣泛性焦慮障礙量表（Generalized Anxiexy Disorde-7，GAD-7）進行焦慮嚴重程度的他評和自評；患者健康問卷軀體癥狀群量表（Patient Health Questionnaire-15，PHQ-15）進行軀體癥狀嚴重程度的自評。糞便樣本使用糞便DNA 樣本保存管（江蘇康為世紀）采集，利用布里斯托大便評分（Bristol Stool Form Scale，BSS）對患者提供的糞便樣本進行質量控制[11]。

1.2.2 宏基因組分析 使用NEBNext?Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒（NEB，USA）構建測序文庫，Illumina Hiseq2500 測序儀（Illumina，San Diego，CA，USA）用于測序，每個樣本輸出6 GB原始數(shù)據(jù)。Readfq 軟件（version 8，https://github.com/cjfields/readfq）用于預處理以及去宿主，使用MEGAHIT 軟件（version 1.0.4-beta）組裝分析，通過Bowtie2（version 2.2.4，http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）軟件將各樣品Clean Data分別對比至其Scaftigs上。使用MetaGeneMark 軟件（version 2.10，http://topaz.gatech.edu/GeneMark）進行ORF預測，CD-HIT[12]軟件（version 4.5.8，http://www.bioinformatics.org/cd-hit/）去冗余。通過Bowtie2 軟件將各樣品Clean Data 比對至初始gene catalogue，計算得到各基因在各樣品中的豐度信息。使用DIAMOND[13]軟件（version 0.9.9.110, https://github.com/bbuchfink/diamond/），將Unigenes 與NCBI的NR數(shù)據(jù)庫進行比對獲得各個樣品在各個分類層級上的豐度信息。

1.2.3 微生物共存網(wǎng)絡分析 使用R語言ggclusternet包[14]，基于Spearman 等級相關性矩陣構建種水平腸道微生物共存網(wǎng)絡。由于低豐度物種數(shù)據(jù)可能導致計算中的假陽性，選取豐度前5%的物種數(shù)據(jù)用于后續(xù)計算分析之中。并對微生物共存網(wǎng)絡進行可視化，其中物種用節(jié)點表示，物種之間的相關性用連接節(jié)點的邊表示。R語言ggclusternet包同時用于計算網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，包括連接性、平均度、平均路徑長度、直徑、聚集系數(shù)等，并計算節(jié)點包括Zi（模塊內(nèi)連通度的Z-score）和Pi（模塊間連通度的參與系數(shù)）值等相關屬性。使用R 語言psych 包（version 2.2.5）對關鍵節(jié)點的相對豐度與一般人口學數(shù)據(jù)及臨床量表評估結果進行Spearman相關分析，使用pheatmap包（version 1.0.12）進行可視化呈現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計分析。本研究中年齡、BMI值等連續(xù)變量用（±s）表示，組間比較使用獨立樣本均數(shù)t檢驗；分類數(shù)據(jù)以頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較使用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般人口學

本研究共納入MDD組35例，HC組35例。2組的年齡、性別、體質量指數(shù)（body mass index，BMI）、糞便性狀等差異無統(tǒng)計學意義；在抑郁和焦慮癥狀的嚴重程度上，MDD 組的自評及他評評分均顯著高于HC 組（P＜0.001），且具有更多的軀體不適癥狀（P＜0.001），見表1、表2。

表1 2組一般資料比較[(±s)或例(%)]

表1 2組一般資料比較[(±s)或例(%)]

項目年齡/歲BMI/(kg/m2)女性藥物使用無抗抑郁藥其他糞便性狀堅硬正常松散HC組（35例）22.1±3.0 20.5±2.2 32(91.4)MDD組（35例）21.5±2.68 20.0±2.3 30(85.7)t/χ2值－0.792－0.921－0.302 16.000 P值0.431 0.360 0.716<0.001 35(100.0)0(0.0)0(0.0)22(62.9)10(28.6)3(8.6)1.449 0.484 2(5.7)29(82.9)4(11.4)5(14.3)26(74.3)4(11.4)

表2 2組各量表評分比較（分,±s）

表2 2組各量表評分比較（分,±s）

組別HC組MDD組t值P值例數(shù)35 35 HAMD-17 1.80±2.10 20.6±5.03 20.41<0.001 HAMA 1.71±2.61 17.8±6.95 12.84<0.001組別HC組MDD組t值P值PHQ-9 2.00±2.36 16.7±4.20 17.99<0.001 GAD-7 1.14±1.56 10.40±5.55 9.48<0.001 PHQ-15 2.91±3.39 13.5±5.00 10.35<0.001

2.2 共存網(wǎng)絡

為了描述腸道微生物群落中物種之間潛在關系，基于Spearman相關系數(shù)構建了2 組微生物共存網(wǎng)絡，見圖1。分布在2個共存網(wǎng)絡中的物種主要來自4個門（Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria）。與負相關相比，2個網(wǎng)絡的強正相關的數(shù)量要高得多，但HC組的微生物群落網(wǎng)絡更為復雜。為了量化差異，計算了2 個微生物網(wǎng)絡的拓撲特征，見表3。結果顯示，與使用相同方法構造的HC網(wǎng)絡相比，MDD網(wǎng)絡顯示出較少的節(jié)點數(shù)和連接數(shù)。此外，MDD中的平均度和圖密度均較低，反映了MDD中物種之間的相互作用較少，網(wǎng)絡較稀疏。2組共存網(wǎng)絡拓撲結構復雜性不同，直徑和平均聚集系數(shù)等參數(shù)均具有一定的差異。

圖1 2組受試者腸道微生物群落的共存網(wǎng)絡圖

表3 2組的網(wǎng)絡拓撲結構屬性

2.3 隨機網(wǎng)絡

建立相同節(jié)點數(shù)以及相同連接數(shù)的Erd?s-Réyni隨機網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)HC組和MDD組網(wǎng)絡的平均聚集系數(shù)極高，但平均路徑長度較小，接近隨機網(wǎng)絡，表明2 組腸道網(wǎng)絡具有小世界特性，其聚集相較隨機網(wǎng)絡更為顯著，見表4。從單個節(jié)點度分布圖上可以看出，2 組微生物的度分布遵循冪律分布規(guī)律，大部分的節(jié)點具有較低的度，只有少數(shù)核心節(jié)點具有較高的度，表明2組網(wǎng)絡都是無標度網(wǎng)絡，見圖2。

表4 2組的隨機網(wǎng)絡拓撲結構屬性

2.4 Zi-Pi

為了研究MDD 網(wǎng)絡中改變的拓撲結構是否由特定的生物驅動，本研究進一步測量了網(wǎng)絡中每個物種的相對影響。依據(jù)節(jié)點的拓撲特征尋找網(wǎng)絡核心節(jié)點是網(wǎng)絡分析的熱點。目前，基于Zi-Pi網(wǎng)絡核心節(jié)點判別方法得到了廣泛的應用[15]。模塊是網(wǎng)絡中高度連接的區(qū)域，是系統(tǒng)發(fā)育、進化或功能上獨立的單元，模塊中心節(jié)點（Module hubs，模塊內(nèi)部具有高連通度節(jié)點，Zi >2.5且Pi<0.62）作為特定模塊內(nèi)復雜交互網(wǎng)絡的關鍵物種，對維持這一協(xié)同單元的正常功能有重要作用，連接節(jié)點（Connectors，模塊之間高連通度節(jié)點，Zi<2.5且Pi>0.62）被認為可以維持網(wǎng)絡的一致性[16]。我們發(fā)現(xiàn)在HC網(wǎng)絡中，Ruminococcus flavefaciens是模塊中心節(jié)點，Clostridium CAG 389和Lachnospiraceae bacterium.A2是連接節(jié)點；MDD 網(wǎng)絡中uncultured Blautia sp,Bacteroides mediterraneensis和Parabacteroides distasonis是MDD網(wǎng)絡的模塊中心節(jié)點，見圖3。

圖3 2組網(wǎng)絡節(jié)點的Zi-Pi圖

2.5 相關熱圖

根據(jù)Zi 和Pi 的網(wǎng)絡核心節(jié)點判別方法尋找到關鍵物種后，對其豐度與臨床量表評估得分進行了Spearman相關分析，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過FDR 校正后，Ruminococcus flavefaciens豐度與臨床量表HAMD-17（ρ=－0.265，P=0.026）、PHQ-9（ρ=－0.260，P=0.030）、GAD-7（ρ=－0.315，P=0.008）得分之間存在顯著相關；Clostridium CAG 389豐度與臨床量表HAMD-17（ρ=－0.326，P=0.006）、HAMA（ρ=－0.309，P=0.009）、PHQ-9（ρ=－0.327，P=0.006）、GAD-7（ρ=－0.312，P=0.009）以及PHQ-15（ρ=－0.340，P=0.004）得分之間存在顯著相關，見圖4。

圖4 關鍵物種豐度和臨床指標的相關熱圖

3 討論

目前針對MDD 患者腸道微生物物種豐度或功能改變進行的研究已經(jīng)取得了一定成果，但對微生物相互作用關系的探索仍顯欠缺。本研究使用共存網(wǎng)絡分析，從另一個角度展示腸道微生態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)與HC組相比，MDD 組中微生物相互作用有所減少，群落中的關鍵成員改變，反映了MDD 組腸道群落微生態(tài)失調。

利用對微生物相關關系的認識，建立了共存網(wǎng)絡，2組腸道微生物群落均表現(xiàn)出物種間較強正相關的共存網(wǎng)絡。健康的腸道微生物組是一個復雜網(wǎng)絡，適應不斷變化的環(huán)境條件。在人類腸道微生物組的背景下，這些相互作用可能源自互補的資源獲取策略、生態(tài)位劃分或包括代謝物在內(nèi)的資源轉移[17]。與HC相比，MDD 組的網(wǎng)絡拓撲屬性發(fā)生了變化，網(wǎng)絡較稀疏，物種之間的相互作用較少。而在MDD 中這些相互作用的減少可能會增加受到環(huán)境擾動時腸道微生態(tài)系統(tǒng)的不穩(wěn)定。

核心微生物群在微生物群落中起著重要作用，并維持其功能。因此，核心微生物的鑒定非常重要。但目前核心微生物的鑒定標準尚未統(tǒng)一[18]?；赯i和Pi的網(wǎng)絡核心節(jié)點判別方法在生態(tài)網(wǎng)絡模塊中所識別的關鍵節(jié)點，被認為對維持微生物群落結構穩(wěn)定性可能起重要作用[16]。我們測量了網(wǎng)絡中每個物種的相對影響。為了確定連接不同微生物、與其他微生物密切相關，能夠影響網(wǎng)絡中的其他節(jié)點的潛在關鍵物種，我們重點研究了基于Zi-Pi 網(wǎng)絡核心節(jié)點判別方法尋找到的樞紐物種，并將其豐度與量表得分進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)其中2個關鍵物種的豐度與臨床癥狀嚴重程度呈負相關。

然而，由于目前對其他關鍵物種研究尚不足，我們著重關注已被相關研究報道的物種。Ruminococcus flavefaciens是HC 網(wǎng)絡模塊中心節(jié)點，Parabacteroides distasonis是MDD 網(wǎng)絡的模塊中心節(jié)點。瘤胃球菌屬（Ruminococcus）在精神疾病中受到廣泛關注。動物研究發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬的豐度與小鼠的快感缺乏行為之間存在正相關[19]。此外，補充益生元在抗抑郁同時也表現(xiàn)出了瘤胃球菌屬豐度的降低[20]。另一項動物研究直接引入單一的瘤胃球菌物種，發(fā)現(xiàn)補充Ruminococcus flavefaciens能夠消除度洛西汀的抗抑郁作用[21]。在我們的研究中，Ruminococcus flavefaciens的豐度與抑郁和焦慮癥狀呈負相關，而且在HC網(wǎng)絡中被確認為模塊中心節(jié)點，具有模塊內(nèi)的高連通度，表明該物種潛在的重要性。Ruminococcus flavefaciens在正常腸道微生態(tài)網(wǎng)絡以及與情緒、行為的關系有待進一步探索。

Parabacteroides distasonis作為潛在的益生菌，對結直腸癌[22]和炎癥性腸病[23]等具有保護作用，可以促進人類的消化健康。然而，相矛盾的是，在許多疾病模型中都發(fā)現(xiàn)了Parabacteroides distasonis的致病作用[24]。同樣的，動物研究發(fā)現(xiàn)，Parabacteroides distasonis灌胃處理誘導小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為[25]。作為被發(fā)現(xiàn)的第1個具有誘導抑郁作用的特定菌種，結合我們的研究結果，Parabacteroides distasonis對于人體的潛在致病作用不容忽視。綜上所述，網(wǎng)絡分析有助于提供補充純豐度或功能數(shù)據(jù)的視角，表明MDD中微生物相互作用關系和關鍵物種的改變，并進一步表明與對照相比腸道微生態(tài)失調。

本研究局限在于，數(shù)據(jù)為橫斷面數(shù)據(jù)，無法推測定向網(wǎng)絡。需要縱向數(shù)據(jù)或合成群落的自下而上方法進一步探索菌株-菌株相互作用的方向性以及探索特定菌株對群落的影響。此外，我們的樣本量較小，盡管納入的主要為首發(fā)未用藥患者，但對其具體病程及用藥情況未做進一步的了解，未來有必要對更大的數(shù)據(jù)集進行進一步研究，進一步探索MDD患者腸道微生物物種相互作用關系的改變，與臨床特征的聯(lián)系，尤其是抑郁發(fā)作期和緩解期的縱向改變，為更進一步的實驗提出合適的假設。

4 結論

本研究使用共存網(wǎng)絡分析，探討了MDD和健康人群腸道微生物的差異，發(fā)現(xiàn)腸道微生物組的復雜生態(tài)網(wǎng)絡在MDD 中發(fā)生變化，微生物相互作用減少，群落中關鍵成員有所改變。對這些有所改變的相互關系以及關鍵物種對MDD 的影響值得進一步研究。未來在MDD 中進行的腸道微生物研究有必要在共存網(wǎng)絡方面做更多的努力，從純豐度或功能的單一角度之外探討MDD中腸道微生物群落的改變。