代利霞,馬學(xué)波,王會(huì)瑩,劉春芳,薄曉宇,包秋華

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010018)

有些細(xì)菌在不利于生存的環(huán)境下,可能會(huì)進(jìn)入活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)[1]。細(xì)菌處于該生理狀態(tài)下,不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長繁殖,但仍然保持一定的代謝活性,當(dāng)給予適宜的條件時(shí),又會(huì)恢復(fù)到可培養(yǎng)狀態(tài),被認(rèn)為是細(xì)菌躲避不利環(huán)境的一種特殊存活形式[1-2]。細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)后細(xì)胞形態(tài)特征會(huì)發(fā)生變化,有的細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺,菌體體積變小或菌體聚集等變化[3-4]。目前報(bào)道能進(jìn)入VBNC態(tài)的微生物有100多種[1],如大腸桿菌[5]、鼠傷寒沙門氏菌[6]、金黃色葡萄球菌[7]、短乳桿菌[8]和德式乳桿菌保加利亞亞種ND02[3]等。大多數(shù)都為革蘭氏陰性致病菌,少數(shù)為革蘭氏陽性非致病菌。不同細(xì)菌在不同條件下VBNC態(tài)的誘導(dǎo)、檢測方法、形成和復(fù)蘇機(jī)理等研究方向被深入探究[9]。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一類革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱[10]。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酸性代謝產(chǎn)物,使發(fā)酵液pH值降低,抑制了致病菌生長,延長了產(chǎn)品貨架期,提供了誘人風(fēng)味[11]。同時(shí),乳酸的累積也一定程度抑制了乳酸菌的生長,所以酸脅迫是乳酸菌發(fā)酵后期面臨的最大不利生存環(huán)境之一。乳酸菌在生產(chǎn)、貯藏過程中,除酸脅迫外,還不可避免地受到低溫等多種不利生長的環(huán)境脅迫[12-13]。在這些不利生存的條件下,有些乳酸菌可能會(huì)進(jìn)入VBNC態(tài),目前報(bào)道能進(jìn)入VBNC態(tài)的乳酸菌有腸球菌、雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、短乳桿菌等[1,3,8]。乳酸菌進(jìn)入VBNC態(tài)有利有弊,如果啤酒中存有雜菌短乳桿菌VBNC態(tài),一旦復(fù)蘇會(huì)使其產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[8]。也可以將不利變成有利,如果乳酸菌從VBNC態(tài)轉(zhuǎn)為可培養(yǎng)態(tài),將會(huì)增加活菌數(shù)量、利于挖掘各種生境中大量不可培養(yǎng)的乳酸菌資源等[9]。

干酪乳酪桿菌Zhang(LacticaseibacilluscaseiZhang)是一株分離篩選自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中的具有耐酸、耐膽鹽、改善腸道菌群、提高免疫力等多種優(yōu)良特性的益生菌,已被廣泛應(yīng)用到發(fā)酵乳、飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域[14-15]。益生乳酸菌在酸脅迫下進(jìn)入VBNC態(tài)鮮有報(bào)道。由于在實(shí)驗(yàn)室條件下誘導(dǎo)細(xì)菌VBNC態(tài)時(shí),常常采用多個(gè)條件復(fù)合誘導(dǎo)[16],所以本研究以L.caseiZhang為研究對象,在酸和低溫復(fù)合條件下脅迫,定期取樣檢測,通過對誘導(dǎo)過程中菌體細(xì)胞的活性、細(xì)胞完整性及形態(tài)的測定,初步探究L.caseiZhang是否能夠在酸和低溫脅迫條件下形成VBNC態(tài)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

干酪乳酪桿菌Zhang(LacticaseibacilluscaseiZhang),由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏并提供。

1.2 主要試劑

MRS培養(yǎng)基(pH 6.8,g/L):無水葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、大豆蛋白胨10.0、酵母浸粉5.0、無水乙酸鈉5.0、無水磷酸氫二鉀2.0、檸檬酸鈉2.0、七水硫酸鎂0.2、五水硫酸錳0.05,混和均勻,于121 ℃下滅菌15 min。

PBS緩沖溶液(0.01 mol/L,pH 7.2):氯化鈉0.8 g,磷酸二氫鉀0.02 g,磷酸氫二鈉0.115 g,100 mL蒸餾水、充分?jǐn)嚢柚寥芙夂笥?21 ℃滅菌15 min。

食品級乳酸購自天津鑫鉑特有限公司;LIVE/DEAD?BacLightTMBacterial Viability試劑盒(L7012)購自美國Molecular probes公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;AR2202CN電子天平, 奧豪斯儀器上海有限公司;R5810高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司;DMi8熒光顯微鏡、DM4000B熒光顯微鏡,德國Leica公司;CytoFLEX流式細(xì)胞儀,美國貝克曼庫爾特有限公司;GE4852T PCR儀,杭州 BIO-GENER公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1L.caseiZhang VBNC態(tài)的誘導(dǎo)

將L.caseiZhang接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫靜置培養(yǎng),培養(yǎng)3代,擴(kuò)培后鏡檢為純的L.caseiZhang后,取對數(shù)生長末期的菌懸液4 000×g離心5 min,棄上清液,用PBS緩沖溶液洗滌2次。將菌液按2%的接種量接種到5種不同pH值(用乳酸調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH值至2.5、3、4、5、6)的誘導(dǎo)液中,置于4 ℃進(jìn)行酸和低溫脅迫,不同時(shí)間點(diǎn)取樣,采用3種方法檢測細(xì)胞活性和完整性。

1.4.2L.caseiZhang的可培養(yǎng)數(shù)檢測

在誘導(dǎo)L.caseiZhang VBNC態(tài)過程中階段性取0.5 mL樣品,用4.5 mL的滅菌生理鹽水按10倍梯度稀釋,選擇合適梯度采用平板傾注法利用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行可培養(yǎng)菌數(shù)計(jì)數(shù)。每次試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.4.3L.caseiZhang細(xì)胞完整性的檢測

LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒已被廣泛應(yīng)用在細(xì)菌完整性的檢測中。將試劑盒中兩種染料SYTO 9和碘化丙啶染料(propidium iodide,PI)各稀釋至濃度0.1 mmol/L和0.2 mmol/L于-20 ℃保存,取1 mL的液體樣品離心,用PBS緩沖液洗2次,并用200 μL PBS緩沖液回溶,加入PI和 SYTO 9各5 μL,振蕩均勻后避光染色15 min。在熒光顯微鏡下觀察其細(xì)胞完整性,有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)(活的可培養(yǎng)和VBNC態(tài))的細(xì)胞呈綠色,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破損(死細(xì)胞)的細(xì)胞呈紅色。

1.4.4L.caseiZhang細(xì)胞活性檢測

利用流式細(xì)胞儀與熒光染料相結(jié)合的非培養(yǎng)方法檢測L.caseiZhang在不同脅迫下的細(xì)胞活性。取1 mL的誘導(dǎo)菌懸液4 000×g離心5 min,棄上清液,用PBS緩沖液洗滌2次后回溶,將菌濃度稀釋至106CFU/mL左右,然后加入兩種熒光染料(0.1 mmol/L SYTO 9和0.2 mmol/L PI)各10 μL,充分混合,避光染色15 min后,采用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞活性。

1.4.5L.caseiZhang VBNC態(tài)純度鑒定與細(xì)胞形態(tài)觀察

為避免在誘導(dǎo)過程中進(jìn)行階段性取樣時(shí)雜菌污染而影響檢測結(jié)果,每次實(shí)驗(yàn)都做革蘭氏染色觀察其細(xì)胞形態(tài),并每隔一段時(shí)間取適量樣本,采用16S rDNA序列分析法進(jìn)行細(xì)菌鑒定以檢驗(yàn)樣本純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.casei Zhang可培養(yǎng)活菌數(shù)的變化

L.caseiZhang在不同pH MRS液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)VBNC態(tài)過程中可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的變化如圖1所示。

圖1 不同脅迫條件下L.casei Zhang可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的變化

由圖1可知,不同脅迫條件下L.caseiZhang的可培養(yǎng)數(shù)隨著誘導(dǎo)時(shí)間而降低。當(dāng)細(xì)胞被置于pH 2.5和pH 3的MRS液體培養(yǎng)基時(shí),菌體的可培養(yǎng)數(shù)分別在第3天和第7天降為0;當(dāng)L.caseiZhang被置于pH 4 的MRS液體培養(yǎng)基時(shí),菌體的可培養(yǎng)數(shù)先增加后降低,從初始3.4×107CFU/mL先升高到3 d的1.36×108CFU/mL,隨后下降,其中3～28 d內(nèi)呈緩慢下降趨勢,28 d后下降速度加快,直到120 d活菌數(shù)降為0;當(dāng)L.caseiZhang被置于pH 5和pH 6的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,菌體的可培養(yǎng)數(shù)先上升后下降,下降速度較pH 4條件緩慢。

2.2 L.casei Zhang細(xì)胞完整性檢測

VBNC態(tài)的細(xì)胞膜保持著完整性和被檢測性[17]。LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒結(jié)合熒光顯微鏡在檢測細(xì)菌完整性方面已被廣泛應(yīng)用[18]。熒光染料SYTO 9可以透過所有細(xì)胞膜與DNA結(jié)合,在熒光顯微鏡下呈綠色熒光;而熒光染料PI只能透過破損的細(xì)胞膜與SYTO 9競爭結(jié)合位點(diǎn),在熒光顯微鏡下產(chǎn)生紅色熒光[19]。當(dāng)平板菌落計(jì)數(shù)法檢測的可培養(yǎng)菌數(shù)為0,且熒光顯微鏡視野中仍然存在完整性的綠色熒光細(xì)胞時(shí),認(rèn)為菌體在誘導(dǎo)條件下可以獲得VBNC態(tài)[20]。

L.caseiZhang在可培養(yǎng)數(shù)為0時(shí)的細(xì)胞完整性部分檢測結(jié)果如圖2所示。L.caseiZhang被pH 2.5和pH 3的MRS液體培養(yǎng)基處理第7天,在熒光顯微鏡視野中細(xì)胞全部均為紅色,如圖2-a所示,說明在此條件下細(xì)胞直接進(jìn)入了死亡態(tài),未進(jìn)入VBNC態(tài)。L.caseiZhang被pH 4的MRS液體培養(yǎng)基處理120 d時(shí),從圖2-b可以看出當(dāng)可培養(yǎng)菌數(shù)為0時(shí),熒光顯微鏡視野中存在綠色細(xì)胞,說明綠色細(xì)胞是VBNC態(tài)細(xì)胞,在此誘導(dǎo)條件下,L.caseiZhang能夠進(jìn)入VBNC態(tài)。

a-死菌;b-pH 4.0

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測L.casei Zhang細(xì)胞活性

近幾年,利用流式細(xì)胞儀(flow cytometer, FCM)與熒光染料相結(jié)合的非培養(yǎng)方法在檢測細(xì)胞活性方面被廣泛應(yīng)用,常用的檢測細(xì)菌活性的熒光染料有PI與SYTO 9,當(dāng)采用SYTO 9處理樣品時(shí),SYTO 9會(huì)使具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,當(dāng)采用PI處理樣品時(shí),PI只能透過死菌發(fā)出紅色熒光[21-22]。

在不同pH的MRS液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)L.caseiZhang VBNC態(tài)過程中,采用流式細(xì)胞儀檢測L.caseiZhang的細(xì)胞活性,結(jié)果如圖3所示。圖3是以FITC(SYTO 9)為x軸,PE(PI)為y軸。其中Q1為未染色區(qū)域,Q2為死菌區(qū)域,Q3為活菌區(qū)域,Q4為VBNC態(tài)區(qū)域。

a-空白對照組;b-pH 2.5;c-pH 3.0;d-pH 4.0;e-pH 5.0;f-pH 6.0

L.caseiZhang被pH 2.5和pH 3的MRS液體培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)第3天和第7天時(shí),大部分細(xì)胞處于死菌區(qū)域(圖3-b、圖3-c),表明細(xì)胞未進(jìn)入VBNC態(tài),而是直接進(jìn)入死亡;L.caseiZhang被pH 5和pH 6的MRS液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)120 d,Q3區(qū)域細(xì)胞顆粒數(shù)分別為88.19%和75.40% (圖3-e、圖3-f),表明處于活性狀態(tài)的細(xì)胞大于75%,結(jié)合圖1結(jié)果,推斷這2個(gè)條件和120 d的時(shí)間節(jié)點(diǎn)未能獲得VBNC態(tài)。

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測L.caseiZhang被pH 4的MRS液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)120 d的結(jié)果見圖3-d,Q4區(qū)域細(xì)胞顆粒數(shù)(VBNC態(tài))占59.18%,Q2區(qū)域細(xì)胞顆粒數(shù)占14.18%,說明細(xì)胞此時(shí)大部分處于VBNC態(tài),少數(shù)細(xì)胞進(jìn)入了死亡態(tài)。該結(jié)果和前文的可培養(yǎng)數(shù)與細(xì)胞膜完整性結(jié)果相結(jié)合,完全符合細(xì)胞進(jìn)入VBNC態(tài)的特征。PALOMA等[23]通過使用流式細(xì)胞術(shù)也檢測到了大量常規(guī)平板計(jì)數(shù)法無法檢測到的阪崎腸桿菌受損細(xì)胞,并且能夠?qū)BNC態(tài)細(xì)胞與活細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分開。

綜上所述,L.caseiZhang在pH 4的MRS液體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)液時(shí)可以獲得VBNC態(tài)。

2.4 L.casei Zhang VBNC態(tài)的純度鑒定與細(xì)胞形態(tài)觀察

2.4.1 純度鑒定

為了排除誘導(dǎo)過程中對L.caseiZhang進(jìn)行階段性取樣時(shí)引入雜菌污染菌體影響檢測結(jié)果。部分實(shí)驗(yàn)樣本采用16S rDNA進(jìn)行細(xì)菌鑒定。所測樣本的16S rDNA序列單一、無雙峰,經(jīng)BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對,與L.caseiZhang的基因組序列同源性為100%,說明菌體在誘導(dǎo)過程中未發(fā)生污染。

2.4.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

采用顯微鏡觀察L.caseiZhang正常態(tài)(對數(shù)期細(xì)胞)和VBNC態(tài)(酸和低溫誘導(dǎo)120 d的細(xì)胞)細(xì)胞形態(tài),革蘭氏染色結(jié)果如圖4所示。從圖4-a可以看到L.caseiZhang對數(shù)期細(xì)胞呈直桿狀且成鏈狀排列;L.caseiZhang VBNC態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞長度變短變彎曲,且大部分細(xì)胞呈聚式排列(圖4-b)。這一結(jié)果與許多研究[24-25]的結(jié)果相似,其中金磊等[25]在MRS液體培養(yǎng)基中-20 ℃有氧條件誘導(dǎo)植物乳桿菌,發(fā)現(xiàn)進(jìn)入VBNC態(tài)細(xì)胞的體積變小,菌體較聚集,且細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。

a-L.casei Zhang正常態(tài)細(xì)胞;b-L.casei Zhang VBNC態(tài)細(xì)胞

3 結(jié)論與討論

本研究通過低溫和酸的不同條件對L.caseiZhang進(jìn)行VBNC態(tài)誘導(dǎo),誘導(dǎo)過程中采用平板計(jì)數(shù)法、熒光顯微鏡觀察法和流式細(xì)胞術(shù)3種方法對L.caseiZhang的細(xì)胞活性和完整性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明L.caseiZhang在pH 4的MRS液體培養(yǎng)基4 ℃低溫脅迫菌體120 d時(shí)能夠形成VBNC態(tài)。革蘭氏染色觀察到VBNC態(tài)細(xì)胞長度變短變彎曲。

乳酸菌具有很高的耐酸性,在低濃度的酸脅迫下,為了維持細(xì)胞內(nèi)的酸平衡,保護(hù)細(xì)胞免受損傷,細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生許多應(yīng)激反應(yīng)來應(yīng)對酸脅迫,譬如通過改變細(xì)胞膜通透性、胞內(nèi)pH和產(chǎn)生應(yīng)激蛋白等[26-27]。本研究L.caseiZhang在pH 4的低溫脅迫條件下,細(xì)胞會(huì)通過進(jìn)入VBNC態(tài)躲避酸脅迫。研究發(fā)現(xiàn)乳酸可能也是一個(gè)促進(jìn)乳酸菌進(jìn)入VBNC態(tài)的條件,可能由于乳酸是一種弱酸,其pKa為3.86,大多數(shù)弱酸是以分子狀態(tài)存在于pKa的酸性中,分子態(tài)的弱酸很容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,隨著乳酸濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)游離有機(jī)陰離子的積累可能會(huì)由于滲透壓和壓力的增加而導(dǎo)致細(xì)胞受損[28]。所以導(dǎo)致L.caseiZhang進(jìn)入了VBNC態(tài)。該研究為益生菌L.caseiZhang進(jìn)入VBNC態(tài)的條件及菌體活力提升提供了一定的參考依據(jù)。