何靜怡,魏涯,岑劍偉,3*,李來好,楊賢慶,黃卉,郝淑賢,趙永強,王悅齊,林織

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東 廣州,510300) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)3(大連工業(yè)大學(xué),海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連,116034)4(廣東順欣海洋漁業(yè)集團有限公司,廣東 陽江,529800)

2021年我國漁業(yè)生產(chǎn)總體穩(wěn)定,水產(chǎn)品產(chǎn)量達6 690.29萬t,同比增長2.16%,隨著人民的飲食結(jié)構(gòu)的改變,水產(chǎn)品人均占有量比上年增加0.97 kg,上漲2.09%[1]。我國消費者對魚類的消費習(xí)慣有別于西方,“生猛海鮮”意識根深蒂固,特別是名貴海鮮品種多以鮮活銷售為主,加之我國水產(chǎn)品供給存在不平衡的問題,活魚長途運輸技術(shù)具有巨大的市場前景,水產(chǎn)品遠距離、高密度、集約化?；钸\輸及流通全過程品質(zhì)和安全監(jiān)控等技術(shù)難題是活魚長途保活運輸流通產(chǎn)業(yè)急需解決的關(guān)鍵技術(shù)。當前活魚運輸應(yīng)激研究多集中在激素分泌、血液學(xué)分析、組織結(jié)構(gòu)損傷等方面,而從魚體代謝通路、基因表達等分子生物學(xué)角度的分析仍在發(fā)展階段。本文歸納水質(zhì)實時在線監(jiān)測、低溫暫養(yǎng)、喚醒三大魚類活運關(guān)鍵技術(shù),從轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)角度總結(jié)魚類對應(yīng)激的響應(yīng)機制。

1 活魚運輸方法

目前我國活魚運輸?shù)闹饕獙ο鬄榫哂薪?jīng)濟效益的觀賞魚類和商品成魚類。市場上的活魚銷售種類多有地域限制?；铘~運輸按距離長短可分為短途運輸(≤8 h)和長途運輸(>8 h)[2]?；钸\方式包括有水活運和無水活運兩大類,有水活運是傳統(tǒng)的活運方式,適合短途運輸及名貴的觀賞魚類,但因魚水質(zhì)量比較低使得成本較高。無水活運主要有低溫無水活運及模擬冬眠運輸(生態(tài)冰溫和麻醉輔助),無水運輸大大提高了運輸效率,增加運輸時長。此外,利用高壓使魚體與外界環(huán)境進行氣體交換的高壓活運及用脈沖電麻醉進行活運[3-4],均是新型非化學(xué)的麻醉手段。

2 活魚運輸關(guān)鍵技術(shù)研究進展

2.1 運輸水質(zhì)實時監(jiān)測技術(shù)

活魚運輸過程重點關(guān)注水質(zhì)、溶解氧及溫度條件,水質(zhì)具有非線性變化、不穩(wěn)定的特征,難以用傳統(tǒng)模型精準預(yù)測水質(zhì)好壞[5]。微型芯片內(nèi)含可反復(fù)擦寫的只讀程序存儲器和隨機數(shù)據(jù)存儲器,執(zhí)行速度快、存儲量大,支持多種計算機開發(fā)語言,為科研工作者及產(chǎn)業(yè)實際應(yīng)用帶來更多可能性。隨著科技進步,微型芯片因可靈活自主編程在各行各業(yè)得到廣泛應(yīng)用[6]。盧俊杰[7]選用AT89C51微型芯片作為監(jiān)測系統(tǒng)的主控,結(jié)合極譜型復(fù)膜式溶解氧電極傳感器和集成型溫度傳感器,將溫度和溶解氧濃度通過傳感器轉(zhuǎn)化為電信號后由A/D轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為數(shù)字量,監(jiān)控系統(tǒng)由數(shù)據(jù)采集分析、傳感器驅(qū)動、人機界面及外圍電路組成,該系統(tǒng)可以實時研判數(shù)據(jù)和預(yù)設(shè)數(shù)據(jù)差值,調(diào)節(jié)溫度和溶解氧系統(tǒng)控制改善水環(huán)境,由微型芯片機驅(qū)動的自動監(jiān)控系統(tǒng)實現(xiàn)了制冷保溫、增氧、殺菌、水凈化等功能,可實時監(jiān)測水質(zhì)。在實際應(yīng)用中,福建省八達龍有限公司采用上述系統(tǒng)半年累計完成38 t 超60 h的活魚運輸,不同魚種的運輸均有極高的存活率。王新鵬等[8]提出結(jié)合無線通信和物聯(lián)網(wǎng)技術(shù),增加多個傳感器以采集水質(zhì)的溫度、濁度、pH及溶解氧等多個參數(shù),通過以太網(wǎng)對傳感器數(shù)據(jù)進行傳輸,結(jié)合前后端信息交互,實現(xiàn)遠程智能控制水質(zhì)。此外,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為一種以神經(jīng)元為基本結(jié)構(gòu)單元的大規(guī)模信號處理系統(tǒng),通常由輸入層、隱藏層和輸出層組成,模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中信號輸入、傳遞、激活過程,不斷調(diào)整計算人工神經(jīng)元之間的權(quán)值,將其相互連接起來,具有較強的學(xué)習(xí)能力和非線性映射能力[9-10],隨人工智能進步,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在污水處理、環(huán)境水質(zhì)、醫(yī)學(xué)、采礦等領(lǐng)域多有應(yīng)用,謝萬里等[11]基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的廣泛適應(yīng)性,創(chuàng)新性地通過調(diào)整權(quán)值和閾值以不斷接近期望值,進而網(wǎng)絡(luò)收斂的反向傳播(back propagation,BP)網(wǎng)絡(luò)和根據(jù)預(yù)設(shè)誤差不斷動態(tài)調(diào)整節(jié)點、標準差,使得樣本轉(zhuǎn)移到新空間以得到逼近結(jié)果的徑向基函數(shù)(radial basis function, RFB),使用該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用于運輸河川沙塘鱧和雜交黃顙魚過程中的水質(zhì)評估,選擇溶解氧、總氨氮TAN、pH指標作為網(wǎng)絡(luò)輸入層,構(gòu)建傳遞函數(shù)、輸出層、隱含層、訓(xùn)練模型,實驗發(fā)現(xiàn)2種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的評價結(jié)果一致,表明模型建立成功,但RFB具有更高的預(yù)測精準度和客觀性,計算參數(shù)更少且有更高的響應(yīng)速度。在水質(zhì)在線監(jiān)測的發(fā)展和當前大量生物傳感器仍易受生物污損而需要經(jīng)常更換元件的局限性下,BOWNIK等[12]提出建立連續(xù)監(jiān)測敏感水生生物指標的行為或生理參數(shù)的實時生物預(yù)警系統(tǒng),基于視頻動物行為追蹤技術(shù),分析動物生理行為特征,掌握水質(zhì)的連續(xù)變化,該系統(tǒng)可檢測出水質(zhì)分析標準之外的微生物毒理參數(shù)等,為優(yōu)化活運水質(zhì)及掌握有水運輸中的污染源提供新思路。隨著活魚長途運輸?shù)母咚侔l(fā)展,傳統(tǒng)理化實驗監(jiān)測及經(jīng)驗運輸理論已經(jīng)不符合現(xiàn)代活運要求,水質(zhì)動態(tài)監(jiān)測及遠程控制技術(shù)在當今活魚長途運輸產(chǎn)業(yè)中亟待提升。

2.2 低溫暫養(yǎng)技術(shù)

低溫暫養(yǎng)主要是使魚體適應(yīng)運輸環(huán)境、代謝排泄及對魚冷訓(xùn),常采用梯度降溫和禁食操作。暫養(yǎng)的本質(zhì)是在維持魚類生存環(huán)境條件下適度饑餓以調(diào)節(jié)能量代謝和降低氧化應(yīng)激來提高機體的抗逆能力,減少新陳代謝和耗氧量,延長?；顣r間,提高存活率[13]。暫養(yǎng)環(huán)境和方式由魚的種類、運輸方式、運輸時長等決定,隨著活運技術(shù)進步和應(yīng)用推廣,在保證運輸成活率的前提下,暫養(yǎng)時間逐漸縮短[14]。陳亞楠等[15]研究暫養(yǎng)溫度、氨氮濃度、暫養(yǎng)密度對斑點叉尾鮰的肌肉水分含量、pH和持水力三大肌肉理化性質(zhì)和質(zhì)構(gòu)特性影響,結(jié)果表明溫度和氨氮濃度越高,肌肉理化和質(zhì)構(gòu)特性下降越顯著,暫養(yǎng)密度過大導(dǎo)致溶氧少而降低持水力,過小則因活動少也導(dǎo)致肌肉水分和持水力下降。李小勤等[16]在不同鹽度下暫養(yǎng)草魚發(fā)現(xiàn)鹽度越高滲透耗氧量越大,草魚損耗率越大,但合理的鹽度升高可增加肌肉羥脯氨酸、膠原蛋白含量,改善草魚口感。除控制上述水質(zhì)理化因素外,陳帥等[17]采用混合式直接傳熱系統(tǒng)對暫養(yǎng)池水降溫,設(shè)計包含機械制冷、熱交換、給水和自控的溫控系統(tǒng),通過熱工計算制冷量,將換熱器、制冷機和過濾器連接一體,使得池水降溫過濾循環(huán),補充了冰塊降溫和自然對流等傳統(tǒng)降溫模式無法滿足觀賞魚的養(yǎng)殖要求,該設(shè)備運用于珍珠、紅獅等觀賞魚暫養(yǎng)中,成活率達98%以上。SHRIVASTAVA等[18]評估禁食時長對鯉魚耗氧率、氨含量、Na+/K+ATP酶和H+ATP酶活性等的影響,實驗結(jié)果表明,魚體具有最適禁食暫養(yǎng)時長,適宜時長可保證清腸,在運輸中不產(chǎn)生過多排泄物,但超過最佳時長,魚體則不能維持自身基礎(chǔ)代謝水平,對運輸應(yīng)激的抵抗力也將下降,加重應(yīng)激損傷。因此,對魚種個性化暫養(yǎng)條件優(yōu)化的探究是保證活魚運輸?shù)年P(guān)鍵步驟,需全面考慮各因素之間相互聯(lián)系。目前,廣東省活魚運輸企業(yè)運用“低溫暫養(yǎng)、冷鏈運輸”技術(shù)[19-20],采用高低位暫養(yǎng)池設(shè)計,應(yīng)用新型微孔供氧和多級過濾技術(shù),保證供氧均勻、低溫能耗低,暫養(yǎng)密度大,結(jié)合液氧配送,不添加任何麻醉劑,成功突破活魚遠程冷鏈運輸時長超過50 h的技術(shù)難關(guān),存活率高達99%以上,實現(xiàn)“南魚北運”,成為了全國活魚長途運輸產(chǎn)業(yè)的典范。

2.3 喚醒技術(shù)

運輸?shù)竭_目的地后需要對活魚進行喚醒操作,將運輸后的魚類放置于水溫約為該魚生態(tài)冰溫區(qū)的暫養(yǎng)池中,隨后梯度升溫使魚體恢復(fù)正常。喚醒需要控制的關(guān)鍵點是暫養(yǎng)池中水的初始溫度和升溫速率,目前多側(cè)重于對改善活魚暫養(yǎng)條件及減少運輸過程中應(yīng)激的研究[21],對喚醒環(huán)境的研究多體現(xiàn)在升溫速率方面,張長峰等[22]設(shè)計了無水保活方法及工業(yè)化實現(xiàn)系統(tǒng),在該系統(tǒng)應(yīng)用于鯽魚、鯉魚等通過梯度降溫使其進入半休眠或休眠期,運輸后在不同溫度梯度內(nèi)設(shè)置升溫速率對魚進行喚醒:當溫度為-2～5 ℃時,適宜的升溫速率為0.8～1.5 ℃/h;當升溫至5～10 ℃時,適宜的升溫速率為1.5～3 ℃/h;當升溫至10～30 ℃時,適宜的升溫速率為3～5 ℃/h。無論何種活運方式,經(jīng)過禁食暫養(yǎng)、?；钸\輸后的魚體維持基礎(chǔ)代謝水平,理想的喚醒時長、喚醒環(huán)境是保證魚體健康的關(guān)鍵,其溫度耐受性和理想升溫速率不同,認為對暫養(yǎng)環(huán)境的研究可為喚醒技術(shù)提供數(shù)據(jù)參考,監(jiān)測魚體特征,調(diào)節(jié)適宜升溫速率可提高喚醒率,研究不同魚的喚醒模式對魚類運輸亦是重要一環(huán)。

3 多組學(xué)技術(shù)在魚類應(yīng)激響應(yīng)研究的應(yīng)用

應(yīng)激是魚類對外界環(huán)境變化的響應(yīng),魚體通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)分泌激素調(diào)節(jié)免疫、代謝、生長等生理活動。評估應(yīng)激對魚類的影響多從生理生化、血液學(xué)、組織結(jié)構(gòu)等角度展開,但應(yīng)激是動態(tài)過程,和魚體存在復(fù)雜的聯(lián)系。高通量、高靈敏度的組學(xué)技術(shù)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué))可得到更多有效數(shù)據(jù),多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)流程如圖1所示。目前組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖、污染影響、疾病診斷、食品加工領(lǐng)域中應(yīng)用,成為了當前的主流研究技術(shù)手段[24],但從組學(xué)角度分析魚類運輸應(yīng)激響應(yīng)機制并基于組學(xué)技術(shù)提出改善運輸環(huán)境的相關(guān)實用技術(shù)尚少,表1列舉了部分基于組學(xué)技術(shù)分析魚類常見應(yīng)激的研究機制,掌握魚體內(nèi)的基因表達、代謝產(chǎn)物及通路的改變,為從分子生物學(xué)角度完善活魚運輸技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

表1 近年來各組學(xué)技術(shù)在魚類應(yīng)激中的研究進展

3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

生物體在特定發(fā)育階段或生理條件下細胞、組織或器官的一整套轉(zhuǎn)錄本稱為轉(zhuǎn)錄組,轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)是用于研究生物體轉(zhuǎn)錄組的技術(shù),主要包括雜交(如微陣列)、新一代高通量RNA測序技術(shù)(RNA-sequencing, RNA-seq)和實時定量聚合酶反應(yīng)(real time- quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)3種技術(shù)[36-38]。VALDéS等[39]結(jié)合其工作原理對比上述3種技術(shù)的優(yōu)缺點,可用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的實際應(yīng)用。經(jīng)技術(shù)更迭完善,微陣列及RT-qPCR技術(shù)因需特殊生物平臺且水生生物基因信息覆蓋少而逐漸被可以不依賴已知生物基因信息的RNA-seq所取代[40]。RNA-seq主要包括四大階段:質(zhì)量控制、基因比對、定量和差異表達。測量生物體基因在不同組織、條件或時間點的表達情況,對轉(zhuǎn)錄組圖譜分析,包括基因表達、可變剪切、反義轉(zhuǎn)錄本、基因結(jié)構(gòu)、基因功能新注釋、GO及KEGG富集分析差異表達基因和單核苷酸多態(tài)性、等位基因特異性表達和基因融合等豐富的信息[38,41]。

CAO等[42]分析不同鹽度、缺氧狀態(tài)及高溫脅迫下魚體的應(yīng)激狀況,通過生物信息學(xué)技術(shù)及RNA-seq進行基因功能注釋、GO及KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)鹽度脅迫下差異基因主要富集在細胞過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞定位、細胞/離子轉(zhuǎn)運、類固醇生物合成、不飽和脂肪酸及能量代謝、生物調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答中,代謝是鹽度影響最大的途徑,XU等[43]基于脾臟和頭腎組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué),研究長期的高鹽度脅迫造成顯著的免疫途徑改變,降低凝血功能,脾臟腫大、增強吞噬活性并下調(diào)補體途徑;CHEN等[44]對魚體肝臟、鰓、心臟組織富集分析發(fā)現(xiàn),隨缺氧時間延長,合成代謝相關(guān)途徑在肝臟中富集,mTOR(雷帕霉素靶蛋白)和VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)信號通路在鰓中富集,心肌細胞中的腎上腺素在心臟中富集;魏亞麗等[28]在不同高溫脅迫下對尼羅羅非魚肝臟組織分析,發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在糖酵解、細胞周期、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工及胰島素信號等通路上,實驗表明高溫脅迫下肝臟組織中參與熱應(yīng)激相關(guān)的基因涉及生長、蛋白質(zhì)折疊及能量代謝等多個生物學(xué)過程,羅非魚神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控抑制生長,高溫下機體的新陳代謝和能量消耗不斷增強。

對運輸過程中的應(yīng)激可以用于生物標記,作為生物或致病過程的指標,新一代基因測序技術(shù)對總轉(zhuǎn)錄本的分析揭示了發(fā)生在單個細胞或復(fù)雜群落中的過程(元轉(zhuǎn)錄復(fù)制)[45],分析應(yīng)激對基因表達的影響,明確在不同環(huán)境中差異基因主要的富集通路不同,進而可準確分析不同應(yīng)激對魚體各組織結(jié)構(gòu)的影響機制,但通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析運輸中的短期應(yīng)激研究并改善活運條件的實際應(yīng)用尚少,基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的魚類應(yīng)激分析多集中在慢性應(yīng)激,認為轉(zhuǎn)錄組學(xué)對發(fā)展養(yǎng)殖具有抗應(yīng)激性狀的新魚種具有巨大潛力。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

轉(zhuǎn)錄組學(xué)只提供基因表達的理論信息,并不能解釋蛋白質(zhì)翻譯、不能提供關(guān)于基因產(chǎn)物的亞細胞定位或蛋白質(zhì)修飾的信息,且mRNA豐度與蛋白質(zhì)水平不一定完全相關(guān),因此蛋白質(zhì)組學(xué)快速發(fā)展以完善功能基因組研究[46]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一項大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化研究某一個細胞、組織或生物體在特定時期所表達的全部蛋白質(zhì)的技術(shù),它是研究蛋白質(zhì)組成及其變化調(diào)控規(guī)律的科學(xué)[47-48]。蛋白組學(xué)分為定性和定量研究,定性研究包括通過酶解手段降解蛋白質(zhì)至肽段再倒推蛋白質(zhì)信息的自下而上和直接將蛋白質(zhì)打碎的自上而下的分析方法[48],圖2展示了2種不同方法的分析步驟?；谫|(zhì)譜分析,定量研究分為靶向和非靶向定量,非靶向定量分為穩(wěn)定同位素標記定量和非標記定量,標記定量包括相對和絕對定量同位素標記(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)和串聯(lián)質(zhì)譜標簽(tandem mass tags, TMT),非標記定量采用液質(zhì)聯(lián)用;靶向定量技術(shù)包括多重反應(yīng)檢測技術(shù)和平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)[47]。蛋白質(zhì)組學(xué)主要用于研究發(fā)病機制、免疫調(diào)節(jié)及宿主病原體的相互作用,可分析監(jiān)測蛋白質(zhì)活性的改變并提供關(guān)于翻譯后蛋白質(zhì)的機械信息,通過蛋白質(zhì)組學(xué)在魚類中確定活魚福利的生物指標[49-50]。

圖2 蛋白質(zhì)組學(xué)的典型工作流程:基于凝膠的自上而下和無凝膠自下而上的策略[49]

章孝穎等[29]、李明云等[51]采用TMT、雙向凝膠電泳分離蛋白和液相色譜及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜結(jié)合,分別研究高溫和低溫脅迫下大黃魚的肝臟蛋白組學(xué),結(jié)果表明,熱休克蛋白70、鈣網(wǎng)蛋白和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正確折疊,丙酮酸激酶參與高溫下的能量供給,高溫對蛋白質(zhì)折疊、能量代謝有顯著影響,高溫下魚體激活合成熱應(yīng)激蛋白抵抗脅迫,糖酵解通路是高溫下缺氧產(chǎn)能的重要途徑,而低溫脅迫后肝臟細胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運中的ATP酶、角蛋白18和2-半胱氨酸過氧化物酶表達顯著下調(diào),肌球蛋白重鏈表達顯著上調(diào),表明低溫抑制細胞分泌和融合,蛋白出現(xiàn)轉(zhuǎn)運障礙導(dǎo)致受損細胞不能被修復(fù)使得細胞凋亡,破壞肝細胞骨架,致肝細胞最終凋亡,而過氧化物酶表達下降表明機體的抗凋亡能力下降,認為低溫通過加速細胞凋亡和阻礙受損細胞及時得到修復(fù)最終導(dǎo)致魚體死亡,基于此,黃智慧等[52]通過對大菱鲆急性低溫脅迫提出,提高肌球蛋白輕鏈的表達以滿足ATP酶活性需要,保證低溫下魚體對基本能量代謝需求。NUEZ-ORTN等[53]研究高溫慢性應(yīng)激下大西洋鮭魚肝臟的蛋白組學(xué),發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解減慢作為高溫下能量不足的補償機制,能量代謝途徑的變化是為了適應(yīng)高溫條件下代謝率的增加,而脂質(zhì)氧化是由于在高溫下氧化還原反應(yīng)的不平衡產(chǎn)生大量活性氧,在應(yīng)激中抑制蛋白質(zhì)的合成和降解是重要的調(diào)節(jié)機制,有必要進一步了解不同氨基酸提高肝臟解毒能力的潛力,評估成分和添加劑以補償能量不足,改善魚體對應(yīng)激的承受能力。

肝臟作為魚類應(yīng)激過程中主要的免疫、滲透調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)合成器官,也是蛋白組學(xué)最重要的研究對象。通過蛋白組學(xué)研究應(yīng)激對魚體的影響,可選擇更適合魚種的運輸方式,蛋白質(zhì)的合成和分解是機體抵抗應(yīng)激最直接的方式,和細胞、酶活性、生物體直接相關(guān),找到應(yīng)激因素下相關(guān)的關(guān)鍵蛋白,通過蛋白組學(xué)能闡釋在動態(tài)應(yīng)激條件下魚體的免疫改變,從小分子角度表明在運輸應(yīng)激過程中魚體蛋白質(zhì)的實際情況。

3.3 代謝組學(xué)分析

代謝組學(xué)是建立在數(shù)據(jù)處理基礎(chǔ)上的小分子代謝分析,一般分子質(zhì)量小于1 kDa,是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)后的一種小分子高通量技術(shù),目前多在魚類飼料、重金屬影響、病理學(xué)等方面展開研究[54]。代謝組學(xué)的中心任務(wù)包括檢測、量化和編錄內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其動態(tài)變化規(guī)律,確定此變化規(guī)律與生物學(xué)過程之間的有機聯(lián)系[48]。實驗步驟包括取樣、樣品制備、儀器分析、數(shù)據(jù)處理和生物學(xué)闡釋,為實現(xiàn)改善代謝組和功能基因組相關(guān)生物信息現(xiàn)狀的目標提出了獨特的挑戰(zhàn)[23],如圖3所示為代謝組學(xué)分析流程。數(shù)據(jù)的處理有多元統(tǒng)計分析和模式識別法(pattern recognition, PR),PR主要包括無監(jiān)督和有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析,無監(jiān)督主成分分析(principal component analysis, PCA)是代謝組學(xué)分析的第一步,在確定成分和樣本的關(guān)系后,采用監(jiān)督數(shù)據(jù)分析法確定樣本分類及其來源的預(yù)測,包括正交最小偏二乘法回歸-判別分析、偏最小二乘回歸、聚類分析、顯著性分析等[24]。

圖3 代謝組學(xué)分析流程

LOW等[23]歸納了應(yīng)用代謝組學(xué)分析魚類受各種病毒、細菌等感染后的代謝變化,認為通過高通量技術(shù)對受感染魚類的代謝組進行表征,可開發(fā)出病毒感染生物標志物。康玉軍[48]對高溫脅迫下的虹鱒肝臟展開代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)研究,利用超高液相色譜-飛行時間/質(zhì)譜非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對慢性熱應(yīng)激后肝臟的代謝產(chǎn)物和豐度進行分析,差異代謝物顯著富集到與蛋白質(zhì)組消化與吸收、氨基酸代謝、氨酰-tRNA生物合成等相關(guān)的通路,表明在慢性熱應(yīng)激中肝臟蛋白質(zhì)合成能力減弱,虹鱒體內(nèi)的能量供給主要依靠賴氨酸而不是脂肪酸和葡萄糖,對其他代謝物如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等顯著富集在不飽和脂肪酸代謝中,表明脂質(zhì)代謝的干預(yù)或調(diào)節(jié)可能對緩解虹鱒慢性熱應(yīng)激有作用。LIU等[35]結(jié)合核磁共振和RNA-Seq研究典型的冷水魚在熱應(yīng)激下肝臟及血漿的生理代謝變化,結(jié)果表明,熱應(yīng)激導(dǎo)致該魚出現(xiàn)能量代謝抑制、脂質(zhì)、氨基酸、膽堿和核苷酸代謝的改變,誘導(dǎo)谷氨酸代謝激活,因此認為谷氨酸可能是該冷水魚的代謝標志物。而WEN等[55]研究冷應(yīng)激對鐵餅魚(溫水性)鰓的生理反應(yīng),發(fā)現(xiàn)影響最大的代謝途徑包括戊糖磷酸途徑、淀粉和蔗糖、甘油脂和脯氨酸代謝。劉佳琳等[54]對不同鹽度下的褐牙鲆幼魚組織進行代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)氮氧三甲胺是該魚應(yīng)對海洋高鹽度的主要滲透調(diào)節(jié)物,及部分代謝標志物如?；撬?氨基酸含量的顯著升高表明低鹽濃度影響了蛋白質(zhì)合成,應(yīng)采用不同養(yǎng)殖策略以適應(yīng)鹽度脅迫,張彥坤等[34]和高淑芳等[56]分別用基于LC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)研究饑餓脅迫14 d后劍尾魚肝臟組織和不同鹽度脅迫下刀鱭卵巢代謝產(chǎn)物分析,認為饑餓脅迫主要通過干擾劍尾魚肝臟中的糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝影響其免疫、抗炎癥及抗氧化能力,FoXO通路在饑餓脅迫中影響多種生物學(xué)過程,饑餓后L-精氨酸和?；撬犸@著下調(diào)表明免疫和抗氧化應(yīng)激能力的下降,但肝臟中亞油酸的上調(diào)彌補了與免疫相關(guān)代謝物的減少,因此,就饑餓脅迫是否造成免疫下降需進一步確認,而不同鹽度下變化顯著的通路有氨酰-tRNA的生物合成和嘧啶代謝通路,認為上述2種通路改變及鞘磷脂通路的改變均與刀鱭卵發(fā)育。SUN等[57]采用高分辨率的超高液相色譜-飛行時間/質(zhì)譜和化學(xué)計量分析學(xué)研究鯽魚在堿性脅迫下應(yīng)激的生物標志物和代謝機制,發(fā)現(xiàn)7種堿性脅迫下的標志物和23種受影響的代謝通路,表明堿性暴露導(dǎo)致代謝模式發(fā)生改變,其中包括氨基酸、丙酮酸的代謝破壞等,對后續(xù)培育具有耐鹽堿的的魚種魚苗計劃提供理論支持。

運用代謝組學(xué)分析應(yīng)激因素對魚類代謝產(chǎn)物的影響,在不同應(yīng)激因素下,其顯著富集的代謝通路和差異代謝物均不同,通過非靶向代謝組學(xué)找到富集代謝通路和產(chǎn)物,進而通過靶向鑒定各產(chǎn)物性質(zhì)和推理應(yīng)激對魚體的影響,分析多種因素下魚體的變化及應(yīng)激響應(yīng)機制,針對性培育對抗不同應(yīng)激影響的魚種并運輸,目前基于代謝組學(xué)的機制研究多從非靶向角度出發(fā),即還未確定不同魚類在應(yīng)激下代謝的規(guī)律,因此,認為有必要加大對多種魚類的代謝組學(xué)研究以探究魚體內(nèi)的應(yīng)激響應(yīng)規(guī)律,通過高通量技術(shù)對應(yīng)激魚類進行靶向代謝組表征有利于推進魚類應(yīng)激響應(yīng)機制的研究。

4 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了活魚暫養(yǎng)、運輸水質(zhì)實時監(jiān)測、喚醒3種活魚長途運輸關(guān)鍵技術(shù),簡述不同技術(shù)的工作原理及實際應(yīng)用,歸納了應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)分析各應(yīng)激因素對魚體中重要組織(如肝臟、腸、頭腎、腦、鰓等)基因轉(zhuǎn)錄翻譯、蛋白質(zhì)表達情況及代謝產(chǎn)物變化的影響,基于高通量技術(shù)、質(zhì)譜色譜聯(lián)用、多元統(tǒng)計學(xué)等分析魚體對應(yīng)激響應(yīng)機制的研究進展。目前國內(nèi)外逐漸重視對不同魚種應(yīng)激響應(yīng)機制的研究,通過單一組學(xué)從不同角度分析應(yīng)激影響下通路及差異基因(蛋白質(zhì)/代謝產(chǎn)物)改變,并就此提出應(yīng)激研究對培育新抗應(yīng)激性狀魚種的重要價值,但研究多為長期應(yīng)激,針對活魚運輸中的短暫應(yīng)激的研究和通過運輸應(yīng)激響應(yīng)機制研究提出實際可行的改善方案目前尚少。通過組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)更多的潛在生物標記物,對不同魚體實現(xiàn)個性化、準確度更高的應(yīng)激分析;培育適合運輸?shù)目共煌瑧?yīng)激性狀的新魚種;基于組學(xué)技術(shù)分析科學(xué)暫養(yǎng)、飼喂以提高魚體抗應(yīng)激能力;在提高運輸存活率前提下就改善活魚口感滋味,對更多無殘留運輸方法的開發(fā)等多個問題均有待通過組學(xué)技術(shù)解決。通過對多組學(xué)技術(shù)的分析得到單一組學(xué)技術(shù)由于其孤立的數(shù)據(jù)不能完全揭示生物體的復(fù)雜性,因此,多組學(xué)核心平臺與尖端生物信息學(xué)的結(jié)合,將深化運輸魚類應(yīng)激機理的研究。在活魚應(yīng)激中,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)可闡釋差異基因表達,得到更多特征生物標記物,基于蛋白質(zhì)組學(xué)可反映魚類免疫應(yīng)答的機制,通過代謝組學(xué)可評估壓力對魚體的影響,有利于在動態(tài)過程中捕獲更多代謝產(chǎn)物的變化,實時跟進魚體生理狀況,提高運輸效率和魚肉品質(zhì)。

多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用分析應(yīng)激因素對魚體從基因表達到肌肉品質(zhì)等多方面影響的快速檢測將更快更準。我國目前組學(xué)技術(shù)仍在發(fā)展階段,多組學(xué)技術(shù)意味著更龐大的數(shù)據(jù)庫,對數(shù)據(jù)融合、存儲、分析、建模等的專業(yè)要求更高,對數(shù)據(jù)的有效整合、動態(tài)分析的正確使用和解釋是目前的組學(xué)技術(shù)挑戰(zhàn)[48]。另外,組學(xué)檢測設(shè)備建立于高端的質(zhì)譜檢測技術(shù),這些設(shè)備、維護管理及耗材費用高昂,常規(guī)實驗室難以承受?；铘~運輸是動態(tài)變化過程,組學(xué)分析要求對樣品的快速分析,因此在實際應(yīng)用中應(yīng)綜合考慮精準快檢和樣品前處理的時效性。我國常見大宗經(jīng)濟魚類的長途運輸距離已覆蓋全國,達到了國際領(lǐng)先水平。多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)從分子層闡明活魚運輸過程應(yīng)激反應(yīng)的機理并就此提出可行性方案將有助于我國活魚運輸產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,相關(guān)研究亟待開展。