張夢(mèng)，湯雋，張樹玲，趙健竹

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1.腫瘤科；2.胸外科，沈陽(yáng) 110004）

泛素是一類由76個(gè)氨基酸組成的高度保守的蛋白質(zhì)，分子量約為8.5×103，廣泛存在于所有真核細(xì)胞中。泛素分子攜帶7個(gè)賴氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），底物蛋白可以在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的賴氨酸殘基進(jìn)行泛素化，底物蛋白結(jié)合的賴氨酸殘基不同，底物蛋白的去向不同。泛素化修飾是一個(gè)主要由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2 和泛素連接酶E3等介導(dǎo)的多級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)。首先，E1 利用 ATP 提供的能量，在泛素 C 端賴氨酸殘基上的羧基基團(tuán)與自身的半胱氨酸殘基上的巰基基團(tuán)間形成高能硫酯鍵，從而活化泛素分子。然后，激活的泛素通過硫酯鍵被接合到 E2 的半胱氨酸殘基上。最終，激活的泛素或者通過E2直接連接到蛋白底物上，或是在E3作用下，通過泛素的羧基末端與靶蛋白賴氨酸殘基的氨基之間形成氨基異肽鍵，將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。在這一系列酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，E3在靶蛋白的特異性識(shí)別以及泛素化系統(tǒng)的調(diào)控中起最重要的作用。根據(jù)E3的特征結(jié)構(gòu)域及泛素傳遞到靶蛋白的作用機(jī)制，E3被分為3個(gè)家族類型：含RING finger結(jié)構(gòu)域的E3、含HECT結(jié)構(gòu)域的E3以及含U-box結(jié)構(gòu)域的E3［1-4］。泛素化參與體內(nèi)各種蛋白質(zhì)的降解和（或）信號(hào)通路的變化，調(diào)控機(jī)體的各種生理功能［5-6］。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是由Erbb-1基因編碼的具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體，參與細(xì)胞增殖、有絲分裂等，在腫瘤發(fā)展、腫瘤靶向治療藥物耐藥中起重要作用。EGFR具有3個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，包括胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。EGFR通過結(jié)合各種細(xì)胞外表皮生長(zhǎng)因子配體如表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）而被激活，導(dǎo)致其形成二聚體，二聚體刺激受體固有的酪氨酸激酶活性，并觸發(fā)自磷酸化。隨后，受體傳遞細(xì)胞反應(yīng)，介導(dǎo)各種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化、存活和生長(zhǎng)。EGFR基因擴(kuò)增或突變、基因重排和不同剪接變異體的產(chǎn)生是EGFR參與腫瘤轉(zhuǎn)化或癌癥進(jìn)展的重要途徑［7-11］。EGFR可以通過配體結(jié)合泛素化的方式，進(jìn)行翻譯后修飾。目前發(fā)現(xiàn)有多種E3參與EGFR的泛素化修飾，直接參與EGFR蛋白降解、介導(dǎo)EGFR通路信號(hào)改變、增強(qiáng)EGFR蛋白穩(wěn)定性等，泛素后的EGFR可經(jīng)蛋白酶體途徑、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的或非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑降解［12］。

1 野生型EGFR蛋白的泛素化修飾

1.1 Casitas B家系淋巴瘤（Casitas B-lineage lymphoma，Cbl）家族為最早鑒定的泛素EGFR的E3

泛素連接酶Cbl家族成員（Cbl、Cbl-b和Cbl-c）是受體酪氨酸激酶的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Cbl家族蛋白依賴性泛素化在配體誘導(dǎo)溶酶體靶向和降解中發(fā)揮重要作用。其中，Cbl-c聯(lián)合表皮生長(zhǎng)因子受體途徑底物15（epidermal growth factor receptor pathway substrate 15，EPS15）中功能性泛素相互作用基序來介導(dǎo)EGFR的內(nèi)吞。Cbl-c結(jié)合于EPS15中功能性泛素相互作用基序，募集活化的EGFR進(jìn)入含有EPS15的囊泡。泛素后的EGFR復(fù)合物作為EPS15的對(duì)接位點(diǎn)，將受體招募到網(wǎng)格蛋白的囊泡中。Cbl-c可以通過2種不同的機(jī)制引導(dǎo)泛素化的EGFR進(jìn)入含有EPS15的內(nèi)化路徑：一種為依賴直接與EGFR結(jié)合的Cbl-c的磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)域；另一種為依賴鋅指結(jié)構(gòu)的C端，從而間接結(jié)合于受體。因此，Cbl-c介導(dǎo)EPS15參與活化后EGFR的內(nèi)吞降解［13］。

1.2 具有RING finger結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1（cell growth regulator with RING finger domain 1，CGRRF1）在乳腺癌中調(diào)控EGFR泛素化

CGRRF1是一種生長(zhǎng)抑制因子，由一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)RING finger結(jié)構(gòu)域組成。許多含有RING finger結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有E3的功能，可以將泛素從E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。CGRRF1在體內(nèi)和體外都能抑制乳腺癌的生長(zhǎng)，敲除CGRRF1基因可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，過表達(dá)CGRRF1基因可以抑制乳腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，RING finger結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渖L(zhǎng)抑制活性至關(guān)重要。在異種移植實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)CGRRF1基因的異種移植細(xì)胞中EGFR表達(dá)較低，相反，在CGRRF1基因敲除或敲低細(xì)胞中EGFR表達(dá)增強(qiáng)。CGRRF1通過K48鏈接的泛素化作用使EGFR泛素化，從而導(dǎo)致EGFR通過蛋白酶體降解［14］。

1.3 瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）在胰腺癌中調(diào)控EGFR泛素化

TRPV1首先在感覺神經(jīng)元中被發(fā)現(xiàn)，它被認(rèn)為是緩解疼痛的治療靶點(diǎn)。在胰腺癌細(xì)胞PANC-1中，過表達(dá)TRPV1基因后，EGFR表達(dá)降低，然而沉默TRPV1基因后，EGFR表達(dá)增加。TRPV1基因過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，顯著降低KRAS和AKT2兩種癌基因的mRNA水平。更重要的是，TRPV1通過誘導(dǎo)EGFR泛素化和降解來下調(diào)EGFR水平，從而調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞中EGFR/MAPK信號(hào)通路。這些結(jié)果揭示了TRPV1對(duì)胰腺癌細(xì)胞EGFR的調(diào)控作用及其機(jī)制，為設(shè)計(jì)新的靶向EGFR的抗胰腺癌藥物提供了新思路［15］。

1.4 包含HECT、UBA和WWE結(jié)構(gòu)域的蛋白1（HECT，UBA，and WWE domain-containing protein 1，HUWE1）促進(jìn)EGFR泛素化和降解

HUWE1是一個(gè)分子量約為482×103的E3，被認(rèn)為具有腫瘤促進(jìn)和（或）腫瘤抑制功能。TGF-β1是腎臟纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，它抑制HK-2細(xì)胞中HUWE1表達(dá)，增加EGFR表達(dá)。HUWE1與EGFR相互作用，過表達(dá)HUWE1基因的HK-2細(xì)胞中，EGFR蛋白顯著降低，而EGFRmRNA未顯著降低，表明HUWE1對(duì)EGFR的下調(diào)發(fā)生在翻譯后水平。用MG132處理HK-2細(xì)胞以抑制蛋白質(zhì)降解時(shí)，EGFR表達(dá)增加，這表明HUWE1對(duì)EGFR的調(diào)控與蛋白質(zhì)降解泛素-蛋白酶體途徑之間存在聯(lián)系。HK-2細(xì)胞中，HUWE1基因過表達(dá)誘導(dǎo)EGFR蛋白的半衰期縮短。EGFR蛋白在HUWE1基因過表達(dá)的HK-2細(xì)胞中，偶聯(lián)的泛素量是載體控制細(xì)胞中的2倍多，這表明HUWE1是參與EGFR降解的E3［16］。

1.5 環(huán)指蛋白144A（RING finger protein 144A，RNF144A）促進(jìn)EGFR泛素化并維持EGFR穩(wěn)定

RNF144A是一種含RING finger結(jié)構(gòu)域的E3，RNF144A包含1個(gè)RING finger結(jié)構(gòu)域和1～2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。在幾種類型癌癥中，RNF144A的表達(dá)與EGFRmRNA和蛋白水平呈正相關(guān)。EGFR的配體誘導(dǎo)RNF144A和EGFR相互作用。RNF144A在EGF刺激過程中促進(jìn)EGFR泛素化，維持EGFR穩(wěn)定性，延長(zhǎng)EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過多種方法消耗RNF144A，會(huì)導(dǎo)致EGFR表達(dá)和EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低。RNF144A的消耗減少了依賴EGF的細(xì)胞增殖［17］。

1.6 Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2（Smad ubiquitination regulatory factor 2，SMURF2）促進(jìn)EGFR泛素化并維持EGFR穩(wěn)定

SMURF2是一種HECT型E3，SMURF2可以泛素化EGFR，但通過保護(hù)EGFR不受Cbl-c介導(dǎo)的降解而穩(wěn)定EGFR。相反，小干擾RNA 介導(dǎo)的SMURF2基因敲除會(huì)使EGFR蛋白不穩(wěn)定，誘導(dǎo)自噬反應(yīng)，并降低表達(dá)EGFR的癌細(xì)胞的存活率，而對(duì)EGFR陰性癌細(xì)胞、正常成纖維細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞的影響極小。頭頸部鱗狀癌細(xì)胞UMSCC74B在裸鼠體內(nèi)形成侵襲性腫瘤，在小干擾RNA介導(dǎo)的SMURF2基因敲除后，其體內(nèi)成瘤能力顯著喪失。EGFR和SMURF2mRNA和蛋白表達(dá)具有很強(qiáng)的相關(guān)性。這些結(jié)果表明，SMURF2介導(dǎo)的EGFR泛素化可能是某些腫瘤中EGFR高表達(dá)的原因，并支持靶向SMURF2-EGFR相互作用作為治療EGFR依賴性腫瘤的新治療方法［19］。

1.7 假性激酶Tribble 3（pseudokinase Tribble 3，TRIB3）招募含有WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋白連接酶1（WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1）促進(jìn)EGFR泛素化并維持EGFR穩(wěn)定

TRIB3作為一種壓力傳感器，對(duì)各種壓力源做出反應(yīng)，通過與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和功能蛋白相互作用，參與慢性炎癥、代謝和惡性疾病。TRIB3通過與自噬受體P62相互作用，破壞自噬體和蛋白酶體降解癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的功能，從而促進(jìn)幾種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。TRIB3缺失導(dǎo)致多種腫瘤促進(jìn)因子（包括EGFR）表達(dá)顯著降低。TRIB3基因過表達(dá)增強(qiáng)K63鏈接的EGFR泛素化，并且修飾發(fā)生在EGFR的近膜區(qū)。TRIB3與EGFR相互作用，招募蛋白激酶C-α，使EGFR在T654位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致WWP1催化K63鏈接的K689泛素化EGFR，增強(qiáng)EGFR的再循環(huán)，從而增強(qiáng)了EGFR的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［20］。

2 突變型EGFR蛋白的泛素化修飾

2.1 Hsc70相互作用蛋白的C端（C-terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP）促進(jìn)突變的EGFR泛素化和降解

CHIP是一個(gè)HSP70/HSP90共伴侶，具有E3活性。CHIP自身的E3活性獨(dú)立于HSP70/HSP90。CHIP選擇性地與EGFR突變體（G719S、L747_E749del A750P和L858R）相互作用，降低其表達(dá)。CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域具有E3活性，是EGFR突變體通過泛素化下調(diào)所必需的。CHIP在肺腺癌細(xì)胞中選擇性相互作用，并下調(diào)內(nèi)源性EGFR突變體。CHIP降低細(xì)胞增殖和致瘤性，尤其是在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中。CHIP基因過表達(dá)抑制了EGFR突變株的細(xì)胞增殖和異種移植瘤的生長(zhǎng)，但對(duì)野生型EGFR細(xì)胞株沒有抑制作用。EGFR突變體特異性泛素化修飾，可能是肺腺癌中EGFR調(diào)控的重要機(jī)制。CHIP可以有望成為克服EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）耐藥的新的治療靶點(diǎn)［21］。

2.2 姜黃素促進(jìn)EGFR泛素化和降解

姜黃素是一種名為二氟乙烯基甲烷的天然化合物，可以通過多種機(jī)制抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗轉(zhuǎn)移。姜黃素還通過調(diào)節(jié)EGFR蛋白水平下調(diào)前列腺癌細(xì)胞中的EGFR信號(hào)，表明姜黃素抑制內(nèi)在的EGFR酪氨酸激酶活性，抑制配體誘導(dǎo)的EGFR激活。姜黃素能通過泛素化野生型EGFR和突變型EGFR（T790M細(xì)胞），誘導(dǎo)EGFR蛋白降解。姜黃素誘導(dǎo)的EGFR降解，可能通過增強(qiáng)吉非替尼耐藥細(xì)胞的泛素-蛋白酶體能力來實(shí)現(xiàn)［22］。

2.3 SMURF2促進(jìn)突變的EGFR泛素化并維持突變的EGFR穩(wěn)定

SMURF2與EGFR相互作用，對(duì)EGFR的穩(wěn)定性和TKI的反應(yīng)至關(guān)重要。L858R/T790M突變的EGFR優(yōu)先被SMURF2-UBCH5（一種E3-E2介導(dǎo)的多聚泛素化）穩(wěn)定。4個(gè)賴氨酸殘基作為泛素化位點(diǎn)，用擬乙?；墓劝滨０啡〈渲幸粋€(gè)殘基，會(huì)增加突變體EGFR對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)的降解敏感性。在肺癌細(xì)胞株中，SMURF2基因過表達(dá)增加了L858R/T790M突變的EGFR蛋白水平，增加了TKI耐受性，而SMURF2基因敲低可降低L858R/T790M 突變的EGFR蛋白水平，使肺癌細(xì)胞對(duì)TKI敏感?？傮w來說，SMURF2介導(dǎo)的L858R/T790M突變的EGFR多聚泛素化可能與乙?；閷?dǎo)的受體內(nèi)化相競(jìng)爭(zhēng)，而后者與增強(qiáng)受體穩(wěn)定性相關(guān)。因此，SMURF2增強(qiáng)L858R/T790M 突變的EGFR蛋白的穩(wěn)定性和對(duì)TKI的抗性［23］。

3 展望

泛素對(duì)蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾在維持蛋白穩(wěn)態(tài)、參與蛋白定位和轉(zhuǎn)位、調(diào)控蛋白活性和蛋白相關(guān)作用等方面扮演重要角色，使細(xì)胞對(duì)外部和內(nèi)部刺激變化做出迅速、敏感的反應(yīng)。蛋白質(zhì)泛素化修飾廣泛參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)吞等病理生理過程，為更好地認(rèn)知蛋白質(zhì)的功能提供更寬泛的視角。EGFR的泛素化修飾被認(rèn)為與EGFR的膜定位、降解、活化和內(nèi)吞等過程密切相關(guān)。一般認(rèn)為EGFR的泛素化為多位點(diǎn)的單泛素化，其泛素化形式包括以K48鏈為主和以K63鏈為主的2種不同形式。其中，K48鏈泛素化易被26S蛋白酶體識(shí)別和降解，而K63鏈泛素化則可被內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體識(shí)別，誘導(dǎo)EGFR通過細(xì)胞內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)涵體，并進(jìn)一步通過溶酶體降解［24-25］。這一過程在下調(diào)EGFR相關(guān)通路及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、負(fù)性調(diào)控酪氨酸酶等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Cbl家族是既往研究最為廣泛的泛素EGFR的E3。除此之外，近年來越來越多的證據(jù)表明，仍有部分E3參與EGFR泛素化過程，系統(tǒng)梳理其種類和功能，從而為進(jìn)一步尋找新的臨床靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。EGFR及其下游通路的異常活化是泛素化中廣泛存在的驅(qū)動(dòng)因素，目前針對(duì)EGFR的抑制劑已被廣泛用于臨床，如針對(duì)非小細(xì)胞肺癌中EGFR通路的TKI，已被臨床指南推薦作為EGFR敏感突變的一線治療首選。然而，目前第3代TKI奧西替尼在臨床治療中的主要瓶頸為治療后耐藥，其耐藥形式主要以EGFR通路依賴的突變?yōu)橹鳎?0外顯子的C797S突變、20外顯子插入突變、18外顯子G724S突變以及EGFR擴(kuò)增等［26］。因此，從泛素化蛋白降解的角度下調(diào)EGFR水平，成為扭轉(zhuǎn)耐藥的關(guān)鍵。

近年來被廣泛關(guān)注的蛋白水解靶向嵌合體（proteolysis targeting chimera，PROTACT）人工合成異源嵌合型分子，是針對(duì)EGFR TKI耐藥后治療策略的研究熱點(diǎn)。PROTACT技術(shù)是以招募靶蛋白相關(guān)E3為基礎(chǔ)，靶向識(shí)別目的蛋白，并通過泛素化降解靶蛋白的方法。目前，針對(duì)不同突變類型的EGFR蛋白的PROTACT分子研發(fā)正在開展廣泛的基礎(chǔ)研究，并已獲得初步研究結(jié)果［27］。因此，加強(qiáng)對(duì)EGFR E3的理解和分析，能夠促進(jìn)尋找靶向泛素-蛋白酶體系統(tǒng)治療新靶點(diǎn)，為拓寬基礎(chǔ)研究和臨床策略提供多角度的理解和思路。