段慧明

廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心·廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200

1 引言

外泌體是由所有細(xì)胞釋放地來源于內(nèi)吞的膜囊泡，大小從30～120 nm 并具有一些特定蛋白。外泌體的生物學(xué)功能依賴于其生物活性物質(zhì)，如脂類、代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和核酸等，這些物質(zhì)可被運(yùn)送到體內(nèi)的局部或遠(yuǎn)端位置，從而提供了一種細(xì)胞間通訊的手段［1］。

大多數(shù)細(xì)胞分泌外泌體，但在疾病狀態(tài)下分泌加強(qiáng)，例如在癌癥中，隨著腫瘤向更具侵襲性的表型轉(zhuǎn)變，外泌體的分泌通常會增加［1］。越來越多的證據(jù)表明，來源于腫瘤的外泌體在癌癥中起著關(guān)鍵作用［2］，已經(jīng)成為腫瘤生長、侵襲、腫瘤相關(guān)血管生成、組織炎癥以及免疫重構(gòu)的新角色［3］。

2 外泌體在癌癥中的功能相關(guān)性

2.1 促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及參與腫瘤耐藥

癌細(xì)胞可以通過外泌體將其致癌特性轉(zhuǎn)移到其他癌細(xì)胞，外泌體可轉(zhuǎn)移腫瘤生長所需的RNA和蛋白質(zhì)。癌細(xì)胞可以將mRNA和miRNA轉(zhuǎn)移到周圍的細(xì)胞中，這對于腫瘤的發(fā)生是非常重要的。例如，上皮生長因子受體（EGFR）截短突變體EGFR 變異體III（EGFRvIII）與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的癌癥進(jìn)展和患者預(yù)后不良密切相關(guān)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源的外泌體可將具有翻譯功能的mRNA 傳遞給受體細(xì)胞，并可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。受體細(xì)胞的增殖指數(shù)更高，對凋亡的抵抗力更強(qiáng)［4］；腫瘤來源外泌體也可能轉(zhuǎn)運(yùn)凋亡抑制蛋白，例如，與正常細(xì)胞相比，生存素（Survivin），在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，并以外泌體的形式分泌到細(xì)胞外，然后被成纖維細(xì)胞內(nèi)化。乳腺癌細(xì)胞衍生的Survivin 上調(diào)成纖維細(xì)胞中SOD1 的表達(dá)，然后將其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，反過來在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)乳腺癌增殖［5］。

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性可能是由于基因或表型改變（內(nèi)在耐藥性）引起的，也可能是腫瘤微環(huán)境保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受治療（外在耐藥性）的結(jié)果。因此，外源性耐藥性來自腫瘤細(xì)胞與其周圍環(huán)境的相互作用［6］。

首先，外泌體可以通過多種方式影響腫瘤細(xì)胞耐藥性。第一種方法是外泌體向細(xì)胞外運(yùn)出化療藥物，例如，由于人卵巢癌細(xì)胞釋放出去的富含鉑和鉑輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外泌體的增加，從而對順鉑產(chǎn)生了耐藥性［7］。其次，外泌體還可將藥物外排泵，例如，P糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥蛋白-1（MRP-1）、ABCA-3 和ABCG-2 等轉(zhuǎn)移至鄰近細(xì)胞，通過阻止抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)的充分積累而產(chǎn)生耐藥性［8］。第三，人ATP 結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族與藥物的過度外排密切相關(guān)。在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中，有幾種ATP 驅(qū)動的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是藥物外排的經(jīng)典調(diào)控因子：ABCB1（Pgp/MDR1）、ABCC1 （MRP1）、ABCG2 （BCRP）等。在耐藥腫瘤細(xì)胞中，這些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的過表達(dá)將抗癌藥物泵出細(xì)胞，降低藥物濃度［9］。第四，腫瘤來源的外泌體可將miRNAs 或長鏈非編碼RNAs 運(yùn)送至受體細(xì)胞，并賦予這些受體細(xì)胞耐藥性。例如，在卵巢癌細(xì)胞中，紫杉醇誘導(dǎo)miR-443 表達(dá)，當(dāng)通過外泌體轉(zhuǎn)移時(shí)，miR-443 表達(dá)誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞的衰老，從而導(dǎo)致耐藥［10］。第五，外泌體可以將支持生存和抗凋亡信號的分子傳遞給周圍細(xì)胞，例如，乳腺癌產(chǎn)生的外泌體富含細(xì)胞存活蛋白Survivin，并產(chǎn)生對紫杉醇的耐藥性［11］。最后，腫瘤來源外泌體與基質(zhì)細(xì)胞相互作用，增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性。腫瘤的耐藥性不僅由癌細(xì)胞決定，而且由腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞支持，例如，通過分泌含有Snail和miR-146的誘導(dǎo)耐藥性的外泌體，胰腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）對化療藥物吉西他濱具有內(nèi)在的抗藥性，已被證明在暴露于該藥物時(shí)介導(dǎo)了對胰腺癌上皮細(xì)胞的耐藥性轉(zhuǎn)移，從而增加它們的增殖和存活［12］。

2.2 癌癥外泌體觸發(fā)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化

理想的腫瘤生長代謝和生理環(huán)境需要基質(zhì)的支持。在腫瘤微環(huán)境中，具有不同或重疊功能的異質(zhì)性細(xì)胞群有助于腫瘤發(fā)生，而成纖維細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。成纖維細(xì)胞是大多數(shù)實(shí)體組織中最豐富的細(xì)胞，參與對環(huán)境信號的響應(yīng)，并成為腫瘤源性信號的常見靶點(diǎn)。在這些信號中，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體是成纖維細(xì)胞激活狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)器，并在建立腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。

癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）通過與外泌體相關(guān)的不同機(jī)制起源于鄰近的多種細(xì)胞，其中最常見的來源是正常成纖維細(xì)胞（NFs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），它們經(jīng)歷了腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的分化過程，并具有侵襲和遷移能力。

2.2.1 正常成纖維細(xì)胞（NFs）CAFs 存在于各種癌癥的腫瘤基質(zhì)中，是具有細(xì)長胞質(zhì)突起的紡錘形細(xì)胞。與NFs相比，CAFs過表達(dá)標(biāo)記物α-平滑肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）和半乳凝素［13］。另外，CAFs的IL-6/STAT3、FGF-2/FGFR1、NF-kB、TGF-β1/SMAD等多個(gè)信號軸具有異常激活活性。

外泌體遞送的蛋白質(zhì)能誘導(dǎo)NFs-CAFs 轉(zhuǎn)化。例如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）可以通過外泌體進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，激活CAFs，誘導(dǎo)CAFs的分化［14］。

除了蛋白外，miRNA也能誘導(dǎo)NFs-CAFs轉(zhuǎn)變，例如，當(dāng)乳腺癌細(xì)胞的外泌體與NFs 共同培養(yǎng)時(shí)，miR-9 可以將NFs轉(zhuǎn)化為CAFs［13］。

2.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）它們是類似成纖維細(xì)胞的細(xì)胞，可以從不同的組織中分離出來。在胃癌小鼠模型中，至少20%的CAFs來源于骨髓和MSCs［15］。來自乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的外泌體可以在MSCs 上誘導(dǎo)支持腫瘤的肌成纖維細(xì)胞的表型［16-17］。不同的miRNA，如miR-21 和miR -146a，被認(rèn)為是CAFs 誘導(dǎo)、MSCs 增殖和血管生成活性的關(guān)鍵調(diào)控因子［18-19］。另外，蛋白質(zhì)也參與這一過程，例如，四跨膜蛋白可以通過外泌體進(jìn)入MSCs，從而促進(jìn)MSCs 的激活、生長和運(yùn)動［20］。與NFs-CAFs 轉(zhuǎn)化類似，TGF-β 通路也參與這一過程，TGF-β/TGF-βR1 相互作用介導(dǎo)Smad2/3 激活，增加MSCs 中FAP 和α-SMA 的表達(dá)，這些都被認(rèn)為是CAFs的特征［21］。

CAFs 也可能源自其它細(xì)胞，包括通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的上皮細(xì)胞；通過內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）的內(nèi)皮細(xì)胞；脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化；某些癌癥間質(zhì)細(xì)胞（如星狀細(xì)胞）缺乏維生素會導(dǎo)致平滑肌肌動蛋白（SMA）的上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化［22］。

CAFs 可以通過多種機(jī)制促進(jìn)癌癥進(jìn)展，包括促進(jìn)增殖、增強(qiáng)侵襲、轉(zhuǎn)移和血管化，以及抗腫瘤作用。CAFs分泌大量的間質(zhì)細(xì)胞生長因子，如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、間質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF）、肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF）等促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。此外，通過CAFs 的Yes 相關(guān)蛋白、細(xì)胞外間質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）的胞外基質(zhì)重塑被認(rèn)為是促進(jìn)癌癥的主要策略之一。CAFs 還通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和蛋白酶（例如IL-6、IL-8和MMP3）來促進(jìn)侵襲［22］。

2.3 外泌體刺激血管生成

在腫瘤發(fā)展過程中，快速生長的癌細(xì)胞會缺乏營養(yǎng)和氧氣，為了維持生存和進(jìn)一步生長，一定大小的腫瘤必須激活內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）以形成新血管，這一過程稱為血管生成開關(guān)。血管生成主要由缺氧引起，由缺氧誘導(dǎo)因子-1和缺氧誘導(dǎo)因子- 2 感知。在缺氧時(shí)，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，激活缺氧依賴性靶基因的表達(dá)。其中一個(gè)基因是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），它通過與VEGF 受體結(jié)合，刺激骨髓中的內(nèi)皮前體細(xì)胞，通過化學(xué)反應(yīng)將內(nèi)皮細(xì)胞吸引到腫瘤上，并激活其生長。VEGF/VEGFR 信號通路是最有希望的血管生成靶點(diǎn)，它在腫瘤血管生成和腫瘤生長中起著關(guān)鍵作用。因此，ECs 是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞，它們對來自外泌體的信號作出反應(yīng)［23］。

腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體是誘導(dǎo)血管形成的主要機(jī)制之一。VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素8（IL-8）是外泌體攜帶的主要血管生成刺激因子［24］。此外，最近發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)相互作用分子（STIM1）可通過減少乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中的外泌體miR-145促進(jìn)血管生成［25］。其次，結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞通過外泌體將miR-21-5p 輸送到內(nèi)皮細(xì)胞，直接抑制受體內(nèi)皮細(xì)胞中的KRIT1 表達(dá)，隨后從VE 鈣粘蛋白（一種介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附連接的蛋白質(zhì)）向細(xì)胞核釋放β-連環(huán)蛋白，進(jìn)行TCF/LEF 依賴性轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌中的血管生成和血管通透性［26］。再有，耐藥腫瘤細(xì)胞也可以促進(jìn)血管生成，例如，5-FU 抗性結(jié)腸癌細(xì)胞的外泌體促進(jìn)血管生成，其中，外泌體二肽基肽酶IV（DPP4）是這種血管生成的有效誘導(dǎo)劑［27］。最后宮頸癌來源的外泌體可以通過向巨噬細(xì)胞傳遞TIE2蛋白，以促進(jìn)血管生成［28］。

2.4 轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成

轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位（PMN）形成是腫瘤細(xì)胞植入遠(yuǎn)處器官所必需的。這種PMN 是在骨髓源性細(xì)胞（BMDCs），例如造血細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的幫助下形成的。腫瘤分泌的外泌體可促進(jìn)不同類型的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和各種BMDCs向PMN募集。

腫瘤來源的外泌體通過促進(jìn)血管系統(tǒng)破壞而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。外泌體含有特定的miRNA，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞減少重要緊密連接蛋白（如ZO-1、鈣粘蛋白和P120）的表達(dá)。外泌體會滲入血液，然后轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移部位，被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，下調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，從而破壞血管的完整性。血管完整性地破壞有利于轉(zhuǎn)移［29］。原發(fā)性腫瘤來源的外泌體可通過血管或淋巴管將蛋白質(zhì)（如整合素、EGFR）和核酸（如miRNA、癌基因）轉(zhuǎn)移到特定器官并與常駐細(xì)胞結(jié)合，從而啟動遠(yuǎn)處器官作為轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位［30］。不同類型癌細(xì)胞的外泌體可以在其表面顯示不同的整合素蛋白，這些整合素決定了哪些組織內(nèi)皮細(xì)胞可以優(yōu)先識別它們，并在特定器官中發(fā)展出前轉(zhuǎn)移生態(tài)位［29］。例如，整合素可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞和肝Kupffer細(xì)胞吸收外泌體，建立轉(zhuǎn)移前生態(tài)位，含有ITGαvβ5的外泌體特異性地與Kupffer細(xì)胞結(jié)合，從而促進(jìn)了向肝臟的趨向性；而表達(dá)ITGα6β4的和ITG 的α6β1 的外泌體則有利于與肺內(nèi)的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)肺的趨向性［31］；再比如，乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體在促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其通過將miR-21 轉(zhuǎn)移到破骨細(xì)胞，與轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成有關(guān)。miR-21 可作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移臨床診斷和治療的潛在靶點(diǎn)［32］。另外，源自胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）外泌體的CD44v6/C1QBP 復(fù)合物對于纖維化肝微環(huán)境的形成和PDAC肝轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。高表達(dá)的外泌體CD44v6和C1QBP是預(yù)測PDAC 患者預(yù)后和肝轉(zhuǎn)移的有希望的生物標(biāo)志物［33］。

2.5 免疫抑制

外泌體是癌癥中免疫調(diào)節(jié)的重要媒介，因?yàn)樗鼈兲峁┝舜罅啃盘?，可以支持或抑制腫瘤中淋巴和髓系細(xì)胞群的免疫抑制［34］。腫瘤來源外泌體促進(jìn)腫瘤免疫反應(yīng)可通過兩個(gè)方面：一方面，抑制樹突狀細(xì)胞（DCs）、T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞的功能。樹突狀細(xì)胞作為先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)之間的介導(dǎo)者，在誘導(dǎo)T 細(xì)胞抗腫瘤活性方面起著至關(guān)重要的作用。DCs 在免疫應(yīng)答的激活中發(fā)揮著重要作用。例如小鼠乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體在體內(nèi)靶向骨髓中的CD11b+髓樣前體細(xì)胞，抑制其向樹突狀細(xì)胞分化［23，35］。胰腺癌來源的外泌體通過miR-203 下調(diào)TLR4 的表達(dá)來抑制DC 細(xì)胞因子。肺癌來源的外泌體通過下調(diào)CD80、MHC-II 和CD86 等表面標(biāo)記物但上調(diào)CD11B 和PD-L1 的表達(dá)來阻斷DC 分化［35］。此外，外泌體也可以通過將細(xì)胞外ATP 轉(zhuǎn)化為腺苷來抑制T 細(xì)胞的增殖。腺苷可抑制多種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，因此，腫瘤中較高的腺苷水平有助于免疫抑制微環(huán)境。腫瘤來源的外泌體表面攜帶外核苷酶CD39 和CD73，將ATP 轉(zhuǎn)化為胞外腺苷，從而抑制T 細(xì)胞增殖［36］。最近發(fā)現(xiàn)，食管癌干細(xì)胞（ECSCs）外泌體中的O-GlcNAc 轉(zhuǎn)移酶（OGT）通過上調(diào)PD-1 可保護(hù)ECSCs 免受CD8+T 細(xì)胞的損傷［37］。NKG2D（NK 細(xì)胞激活受體NK 組2，成員D）是NK、NKT、CD8（+）和gammadelta（+）T 細(xì)胞的激活受體，其在癌癥中的異常丟失是免疫逃避的關(guān)鍵機(jī)制，NKG2D 可能是外泌體介導(dǎo)的癌癥免疫逃避的生理靶點(diǎn)［38］。NK 細(xì)胞的NKG2D 受體是癌癥免疫監(jiān)測的重要組成部分，因?yàn)榘┘?xì)胞通常不同程度地表達(dá)NKG2D配體，這標(biāo)志著它們對NK細(xì)胞介導(dǎo)的破壞?。攜帶NKG2D 配體的外泌體可以減少NK 細(xì)胞上NKG2D 受體的表達(dá)，使它們處于無活性狀態(tài)，從而降低NK 細(xì)胞識別和殺死惡性細(xì)胞的能力［39］，例如，癌細(xì)胞來源的外泌體表達(dá)TGFβ 和NKG2D 的配體，下調(diào)NK 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D 的表達(dá)，從而阻斷其活性［40］。另一方面，腫瘤來源外泌體可通過各種信號通路擴(kuò)增骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）的數(shù)量，并刺激巨噬細(xì)胞向促癌的M2 期的極化［41］。例如，腫瘤外泌體通過分泌PGE2、TGFβ 或IL6、TNFα 和CCL2 將髓系細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MDSCs；腫瘤外泌體中的TGFβ 上調(diào)Foxp3+ T 調(diào)節(jié)細(xì)胞的生成［35］；乳腺癌來源的外泌體通過糖蛋白130/STAT3信號改變巨噬細(xì)胞極化至M2 期。具體來說，糖蛋白130 在癌源性外泌體中富集，激活骨髓源性巨噬細(xì)胞的STAT3通路，導(dǎo)致IL6 分泌并極化至M2 期［41］。最后，腫瘤來源的外泌體還可能通過在原發(fā)腫瘤旁邊發(fā)展異種衛(wèi)星腫瘤而推進(jìn)癌癥進(jìn)展，這叫區(qū)域性癌變，即腫瘤周圍的形態(tài)學(xué)和分子發(fā)生異常，雖然沒有明顯的組織學(xué)改變。它是幾種癌癥發(fā)生的基礎(chǔ)，其分子病因目前仍不清楚。

3 結(jié)論

外泌體是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)。外泌體內(nèi)的物質(zhì)，具有改變自身或其他細(xì)胞命運(yùn)的作用，例如，外泌體對腫瘤的影響表現(xiàn)在可以促進(jìn)腫瘤的增殖及耐藥、觸發(fā)肌成纖維細(xì)胞的形成、刺激血管生成、建立轉(zhuǎn)移前生態(tài)位以及免疫抑制。為了更好地了解外泌體的功能和生物學(xué)意義，還需要有新的技術(shù)和方法來跟蹤外泌體的起源和體內(nèi)物質(zhì)的選擇和釋放，這有助于將外泌體用于診斷目的以及用作藥物運(yùn)載工具和治療靶點(diǎn)。