劉露 郭紅燕

作者單位：100191,北京大學(xué)第三醫(yī)院婦科

子宮腺肌病疼痛發(fā)生發(fā)展的原因尚未明確,而其痛經(jīng)的表現(xiàn)和嚴(yán)重程度存在較大個(gè)體差異,且保守治療有一定局限性,因此其治療仍有難度,需要進(jìn)一步研究疼痛發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)是分布于外周傷害性感受器上的受體,構(gòu)成機(jī)體進(jìn)行溫度、化學(xué)或機(jī)械感受的物質(zhì)基礎(chǔ)[1],感受各種內(nèi)源性和外源性的物理、化學(xué)等刺激[2],參與疼痛發(fā)生發(fā)展等多種生理功能[3]。TRPV1亦可能在子宮腺肌病疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。P物質(zhì)作為在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)的“疼痛”神經(jīng)遞質(zhì),與TRPV1可能存在相互作用,這在子宮腺肌病疼痛中的價(jià)值值得進(jìn)一步探索。而既往研究提示,雌激素對(duì)子宮腺肌病的發(fā)病和疼痛的機(jī)制起重要作用,雌激素或許對(duì)TRPV1起到一定的促進(jìn)作用。

目前已有研究探索TRPV1在子宮內(nèi)膜異位癥疼痛中的表達(dá)和作用,但關(guān)于TRPV1在子宮腺肌病疼痛的發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)作用的研究只有一項(xiàng),且尚未有研究比較TRPV1、P物質(zhì)和雌激素受體(estrogen receptor,ER)α在子宮腺肌病中的表達(dá)情況,以及分析其和疼痛的相關(guān)性及三者之間的相互作用。因此TRPV1、P物質(zhì)和雌激素受體α在子宮腺肌病中的作用值得進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)從mRNA和蛋白水平上對(duì)子宮腺肌病和正常對(duì)照子宮的ER-α、P物質(zhì)和TRPV1受體的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),以驗(yàn)證三者在兩組中的表達(dá)差異,并分析三者與疼痛程度之間的關(guān)聯(lián)性。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選擇2017年7月—2019年2月在北京大學(xué)第三醫(yī)院進(jìn)行了全子宮切除術(shù)或子宮腺肌病病灶切除術(shù)的51例患者為子宮腺肌病組,選取14例無(wú)子宮腺肌病或痛經(jīng),因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)而接受全子宮切除術(shù)的絕經(jīng)前患者作為正常對(duì)照組。

對(duì)于子宮腺肌病組和正常對(duì)照組,分別采集子宮外肌層子宮腺肌病病灶和正常肌層組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。人體組織標(biāo)本離體后15 min內(nèi)完成采集,經(jīng)液氮冷凍處理后放入-80 ℃冰箱中保存。

2.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

(1)RT-PCR。提取組織總mRNA,實(shí)驗(yàn)步驟按照RNA提取試劑TRIzol(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將得到的cDNA取1 μL,依次加入ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)10 μL,上、下游引物各1 μL,滅菌蒸餾水7 μL,總體積20 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用的StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性10 s,58 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。目的基因TRPV1引物、P物質(zhì)引物、ER-α引物和內(nèi)參基因actin引物由上海擎科生物科技有限公司合成,引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

(2) Western blot。將電泳分離后的組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,依次加入1：1 000多克隆兔抗人TRPV1抗體(美國(guó)Abcam)/單克隆兔抗人ER-α抗體(美國(guó)Abcam)和1：1 000辣根多氧化物酶結(jié)合的鼠抗人IgG(美國(guó)Abcam)。按照ECL發(fā)光液說(shuō)明書(shū)避光顯色,Chemi Doc XRS成像儀(Bio-Rad)拍照并用軟件Quantity One 掃描光密度值進(jìn)行半定量分析。

3.統(tǒng)計(jì)分析方法：本研究使用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和管理。使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),如符合正態(tài)分布,則使用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述,使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,利用Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)兩個(gè)變量之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析;如不符合正態(tài)分布,則使用[中位數(shù)(最小值,最大值)]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述,使用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并利用Spearman相關(guān)系數(shù)對(duì)兩個(gè)變量之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。當(dāng)雙側(cè)P<0.05,為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.患者一般情況：兩組患者的一般情況見(jiàn)表2。

表2 患者一般情況 [中位數(shù)(最小值,最大值)]

2.正常對(duì)照組和子宮腺肌病組中TRPV1的差異表達(dá)：子宮腺肌病中TRPV1 mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。TRPV1蛋白亦高于正常對(duì)照組(P<0.01)(見(jiàn)圖2)。

圖1 TRPV1、P物質(zhì)和ER-αmRNA在正常對(duì)照組和子宮腺肌病組中的表達(dá)(a)TRPV1 mRNA表達(dá)在子宮腺肌病組中高于正常對(duì)照組;(b)P物質(zhì)mRNA表達(dá)在子宮腺肌病組中高于正常對(duì)照組;(c)ER-α mRNA表達(dá)在子宮腺肌病組中高于正常對(duì)照組;*P<0.01

圖2 TRPV1和ER-α蛋白在正常對(duì)照組和子宮腺肌病組中的表達(dá)(a)TRPV1蛋白表達(dá)在子宮腺肌病中高于正常對(duì)照組;(b)ER-α表達(dá)在子宮腺肌病組與正常對(duì)照組間無(wú)明顯差異;(*P<0.01,nsP >0.05);

3.正常對(duì)照組和子宮腺肌病組中P物質(zhì)的差異表達(dá)：子宮腺肌病中P物質(zhì) mRNA高于正常對(duì)照組(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。

4.正常對(duì)照組和子宮腺肌病組中ER-α的差異表達(dá)：子宮腺肌病中ER-α mRNA高于正常對(duì)照組(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。子宮腺肌病中ER-α蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P=0.315)(見(jiàn)圖2)。

5.子宮腺肌病中TRPV1 、P物質(zhì)和ER-αmRNA表達(dá)和疼痛的相關(guān)性：子宮腺肌病中TRPV1、P物質(zhì)和ER-α mRNA表達(dá)與疼痛VAS評(píng)分存在正相關(guān)(Spearman′r=0.548,P<0.01;Spearman′r=0.350,P<0.01;Spearman′r=0.292,P=0.049)(見(jiàn)圖3)。在子宮腺肌病組中,TRPV1和ER-α蛋白表達(dá)在無(wú)-輕度痛經(jīng)組和中-重度痛經(jīng)組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.921,P=0.921)。

圖3 子宮腺肌病中TRPV1、P物質(zhì)和ER-α mRNA表達(dá)與疼痛程度之間的關(guān)聯(lián)性分析(a)子宮腺肌病中TRPV1 mRNA表達(dá)與疼痛程度之間正相關(guān);(b)子宮腺肌病中P物質(zhì)mRNA表達(dá)與疼痛程度之間正相關(guān);(c)子宮腺肌病中ER-α mRNA表達(dá)與疼痛程度之間正相關(guān)。

6.子宮腺肌病中TRPV1、P物質(zhì)和ER-α mRNA的相關(guān)性：在子宮腺肌病病灶中,TRPV1 mRNA和P物質(zhì)mRNA存在正相關(guān)性(Spearman′r=0.350,P=0.012),TRPV1 mRNA和ER-α mRNA之間無(wú)相關(guān)性(Spearman′r=0.274,P=0.051),P物質(zhì) mRNA和ER-α mRNA之間同樣存在正相關(guān)性(spearman′r=0.559,P<0.01)(見(jiàn)圖4)。

圖4 子宮腺肌病病灶中TRPV1、P物質(zhì)和ER-αmRNA表達(dá)之間的相關(guān)性(a)子宮腺肌病病灶中TRPV1和P物質(zhì)mRNA表達(dá)之間呈正相關(guān);(b)子宮腺肌病病灶中TRPV1和ER-α mRNA表達(dá)之間無(wú)相關(guān)性;(c)子宮腺肌病病灶中P物質(zhì)和ER-α mRNA表達(dá)之間呈正相關(guān)

討論

本研究發(fā)現(xiàn),TRPV1 mRNA和蛋白在子宮腺肌中的表達(dá)高于子宮正常對(duì)照,并且TRPV1mRNA和痛經(jīng)存在正相關(guān),提示TRPV1在子宮腺肌病疼痛有重要作用。已有研究報(bào)道TRPV1在內(nèi)異癥中表達(dá)升高,但關(guān)于子宮腺肌病中TRPV1的表達(dá)和作用機(jī)制的研究只有一篇報(bào)道。Nie等針對(duì)子宮腺肌病中TRPV1受體表達(dá)進(jìn)行了臨床研究,選取50例子宮腺肌病患者及18例正常對(duì)照,發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病病灶中TRPV1的表達(dá)顯著增加,且與痛經(jīng)嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[2]。上述結(jié)果提示TRPV1在子宮腺肌病的發(fā)病尤其是疼痛發(fā)生發(fā)展中存在重要作用。TRPV1參與子宮腺肌病疼痛過(guò)程的可能機(jī)制如下：(1)在子宮腺肌病炎性環(huán)境中,組織和神經(jīng)損傷后釋放多種炎癥介質(zhì)和神經(jīng)因子至周?chē)M織,引起周?chē)窠?jīng)元上TRPV1激活后[4],發(fā)生鈣離子內(nèi)流,進(jìn)而導(dǎo)致了神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)肽類和興奮性氨基酸,完成傷害性感受的傳遞功能;(2)子宮腺肌病中TRPV1的表達(dá)水平增加,其對(duì)疼痛的傳遞作用隨之增加;(3)TRPV1是許多炎癥途徑的下游靶點(diǎn),受到炎癥刺激后的TRPV1激活閾值顯著降低,導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)生[5];(4)TRPV1還可以激活多種炎癥介質(zhì)和神經(jīng)肽的分泌,這些物質(zhì)同樣在疼痛的傳導(dǎo)功能中起到作用,并且可以反作用激活TRPV1[3,6]。因此,TRPV1在疼痛中的重要作用為慢性盆腔痛的藥物研究提供了新的方向。目前已進(jìn)行了TRPV1靶向治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),國(guó)內(nèi)研究者通過(guò)建立子宮腺肌病小鼠模型,對(duì)TRPV1拮抗劑——槲皮素的疼痛治療效果進(jìn)行驗(yàn)證并取得了陽(yáng)性結(jié)果[7]。但臨床藥物試驗(yàn)尚未開(kāi)展,TRPV1靶向治療對(duì)于人類慢性盆腔痛的治療作用和不良反應(yīng)尚不明確,還值得進(jìn)一步探索和研究。

本研究發(fā)現(xiàn),P物質(zhì)mRNA在子宮腺肌病病灶中表達(dá)升高并與痛經(jīng)程度存在正相關(guān)。P物質(zhì)是廣泛參與各種疼痛過(guò)程的重要神經(jīng)遞質(zhì),當(dāng)外周神經(jīng)受到刺激后,P物質(zhì)可在神經(jīng)末梢釋放并發(fā)揮痛覺(jué)傳遞作用[8]。有研究顯示將選擇性P物質(zhì)受體激動(dòng)劑注射進(jìn)大鼠體內(nèi)后,可以產(chǎn)生劑量依賴性痛覺(jué)過(guò)敏;而向已誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射P物質(zhì)受體拮抗劑,發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)表達(dá)減少,痛覺(jué)過(guò)敏也明顯減輕,提示P物質(zhì)在痛覺(jué)過(guò)敏的形成和維持中起到重要作用[9]。P物質(zhì)在子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病中亦起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠內(nèi)異癥病灶中P物質(zhì)的表達(dá)水平較對(duì)照組升高[10]。Li等還發(fā)現(xiàn),子宮炎癥可以增加P物質(zhì)陽(yáng)性且特異性支配子宮的脊髓背角神經(jīng)元數(shù)量,這些神經(jīng)元數(shù)量增加可以誘導(dǎo)和加重疼痛的發(fā)生發(fā)展[11]。Lertvikool等通過(guò)檢測(cè)P物質(zhì)表達(dá)來(lái)代表子宮腺肌病病灶中的神經(jīng)纖維密度,并發(fā)現(xiàn)在子宮腺肌病病灶中,中-重度疼痛組的神經(jīng)纖維密度要高于輕度疼痛組[12]。這些研究結(jié)果均提示P物質(zhì)可以在子宮腺肌病等疼痛中產(chǎn)生重要作用。

P物質(zhì)和TRPV1之間存在一定相互促進(jìn)作用,共同參與子宮腺肌病疼痛的發(fā)生發(fā)展。既往研究在結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎等慢性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)和TRPV1存在相互作用。Lapointe等的研究表明,結(jié)腸傳入神經(jīng)長(zhǎng)期暴露于P物質(zhì)后可能產(chǎn)生TRPV1致敏,并引起結(jié)腸急性炎癥后慢性腹痛的發(fā)生[13]。TRPV1和P物質(zhì)相互作用的機(jī)制包括兩方面：(1)各種刺激激活初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元末梢的TRPV1,引起鈣離子內(nèi)流,胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度增高促使神經(jīng)末梢中P物質(zhì)的釋放[14];(2)P物質(zhì)通過(guò)阻斷TRPV1的降解通路以及促進(jìn)其再循環(huán)至細(xì)胞膜,增加背根神經(jīng)元細(xì)胞膜上TRPV1的表達(dá),引起辣椒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的電流幅度顯著增加[13]。而在子宮腺肌病中,并未有研究對(duì)P物質(zhì)和TRPV1之間的相關(guān)性進(jìn)行探索。本研究發(fā)現(xiàn),子宮腺肌病中P物質(zhì)mRNA和TRPV1 mRNA之間存在正相關(guān)性。P物質(zhì)可以通過(guò)和TRPV1的相互作用參與疼痛的發(fā)生發(fā)展?；诖俗饔脵C(jī)制,同樣可以對(duì)P物質(zhì)靶向的疼痛治療進(jìn)行進(jìn)一步探索。向患有關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)內(nèi)注射P物質(zhì)受體拮抗劑,發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)表達(dá)減少,痛覺(jué)過(guò)敏也明顯減輕[9]。亦有學(xué)者提出P物質(zhì)存在對(duì)于TRPV1的誘導(dǎo)激活作用[15]。目前尚無(wú)P物質(zhì)受體拮抗劑在子宮腺肌病模型中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

有研究提出雌激素和TRPV1之間可能存在相互作用。Greaves等發(fā)現(xiàn),經(jīng)E2或雌激素受體激動(dòng)劑處理后的感覺(jué)神經(jīng)元中TRPV1 mRNA表達(dá)增加[16]。雌激素可以從基因表達(dá)和受體功能兩方面來(lái)影響TRPV1受體發(fā)揮作用：(1)雌激素與ER結(jié)合后,通過(guò)與TRPV1 DNA上的反應(yīng)元件結(jié)合,促進(jìn)TRPV1轉(zhuǎn)錄[17];(2)E2與ER、G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)結(jié)合后,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子、環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)增加,激活PKC途徑作用于TRPV1受體[17]。但本研究未發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病病灶中TRPV1 mRNA和ER-αmRNA之間存在正相關(guān)性,可能與研究樣本量偏小有關(guān)。此外,盡管在子宮中ER-α表達(dá)高于ER-β,但ER-α的表達(dá)情況或許并不能完全替代雌激素的作用情況。

在子宮腺肌病中,雌激素亦可能對(duì)P物質(zhì)間存在一定促進(jìn)作用,共同參與疼痛過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn),子宮腺肌病病灶中P物質(zhì) mRNA和ER-α mRNA之間存在正相關(guān)性。Mowa等提出,雌激素受體和P物質(zhì)在感覺(jué)神經(jīng)元上共表達(dá),當(dāng)卵巢去勢(shì)大鼠接受外源性雌激素處理后,脊髓背角神經(jīng)元中的P物質(zhì) mRNA合成呈劑量依賴性增加,而這種作用可以被ER阻滯劑阻斷[18]。因此在子宮腺肌病中,除了自身和受體結(jié)合發(fā)揮作用外,雌激素還可能通過(guò)促進(jìn)P物質(zhì)表達(dá)的方式參與疼痛的發(fā)展。

因此,基于TRPV1、P物質(zhì)和ER-α在子宮腺肌病疼痛發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同作用,TRPV1的抑制在治療子宮腺肌病疼痛上可能更具優(yōu)勢(shì),除了直接抑制外周傷害性感受的傳遞,還可減少外周神經(jīng)遞質(zhì),共同減弱疼痛致敏的發(fā)生。此外,雌激素抑制治療,亦能發(fā)揮抑制TRPV1的作用。抑制雌激素和TRPV1的雙聯(lián)治療,或許能夠顯著的緩解子宮腺肌病患者的疼痛癥狀。

本研究存在一定的局限性：(1)本研究樣本數(shù)量較少;(2)由于接受手術(shù)的子宮腺肌病患者多數(shù)伴有嚴(yán)重的痛經(jīng),可能存在一定的選擇偏倚。(3)本研究采用VAS評(píng)分對(duì)患者的痛經(jīng)程度進(jìn)行評(píng)估,可能存在回憶偏倚,并且對(duì)于疼痛的耐受程度,存在個(gè)體差異。(4)本研究從mRNA水平發(fā)現(xiàn)雌激素受體、P物質(zhì)和TRPV1受體在子宮腺肌病病灶中表達(dá)升高,且和疼痛程度存在正相關(guān)性,但尚不能充分證明三者之間的相互作用和調(diào)節(jié)機(jī)制,需要更多對(duì)三者的相互調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)行補(bǔ)充。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)TRPV1、P物質(zhì)和ER-α在子宮腺肌病病中表達(dá)升高,與疼痛程度存在正相關(guān)性。子宮腺肌病中高雌激素環(huán)境促進(jìn)P物質(zhì)表達(dá)并增加TRPV1 的表達(dá)和敏感性,TRPV1和P物質(zhì)相互促進(jìn),不斷增強(qiáng)傷害性感受器的作用,導(dǎo)致疼痛敏化。三者相互促進(jìn)協(xié)同,參與疼痛的發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)果為子宮腺肌病的疼痛相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了一些依據(jù),并希望能為子宮腺肌病的疼痛治療帶來(lái)一些新的切入點(diǎn)。