劉 微, 杜秉健, 孫京超, 張龍振, 臧 鵬

(中國航天員科研訓(xùn)練中心 航天營養(yǎng)與食品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100094)

大米是世界上種植最廣泛,消費(fèi)量最大的糧食作物之一。隨著人們生活節(jié)奏的加快和消費(fèi)水平的提高,消費(fèi)者對米飯的方便性提出了新的需求,因此方便米飯應(yīng)運(yùn)而生。大米加工后出現(xiàn)的淀粉回生問題,特別是長期回生對方便米飯類產(chǎn)品儲存后期的品質(zhì)有重要的影響。大米淀粉的回生是糊化后的大米淀粉分子鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)趨于有序化形成晶體的過程,導(dǎo)致了米飯?jiān)诩庸ず蛢Σ剡^程中出現(xiàn)變硬、干縮等問題,嚴(yán)重影響了米飯的口感和復(fù)水性[1],是限制方便米飯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

在安全天然的框架下解決淀粉的回生問題是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。親水膠體家族及小分子糖類因其較好的持水性被應(yīng)用在食品體系中以改善體系原本的流變和質(zhì)構(gòu)特性[2]。海藻糖作為一種二糖,對人體內(nèi)生物細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[3],其潛在的抗淀粉回生的價值近年來也開始受到學(xué)者的關(guān)注。研究認(rèn)為,海藻糖的添加能夠提高淀粉分子附近水分子的數(shù)量,淀粉鏈與鏈之間被更多的水分子鑲嵌后,淀粉分子鏈周圍的黏度也會提高,改善淀粉的回生現(xiàn)象[4]。Yang等[5]系統(tǒng)探究了海藻酸鈉對大米淀粉糊化、流變和回生性能的影響,發(fā)現(xiàn)高濃度的海藻酸鈉可與大米淀粉通過氫鍵鏈接,從而顯著延遲大米淀粉的回生進(jìn)程。Xu等[6]在一項(xiàng)淀粉-海藻酸鈉對蕎麥面條的品質(zhì)影響研究中同樣證實(shí)了海藻酸鈉可以降低蕎麥淀粉的結(jié)晶度與淀粉凝膠網(wǎng)絡(luò)連續(xù)性,同時也提升了蕎麥面條的抗消化能力。楊鍇[7]通過海藻酸鈉能夠抑制大米淀粉的老化,增強(qiáng)大米淀粉凝膠結(jié)構(gòu)的韌彈性與穩(wěn)定性的特點(diǎn),將其用于改善米發(fā)糕的質(zhì)構(gòu)和食用品質(zhì)。但海藻糖抗大米淀粉回生的機(jī)制方面還沒有較為系統(tǒng)的研究,本研究擬通過分析海藻糖對大米淀粉分子構(gòu)象、水分遷移、短期回生進(jìn)程與長期回生進(jìn)程的影響,明確海藻糖延緩大米淀粉回生的深層機(jī)理,旨在為富含大米淀粉的方便食品的開發(fā)和品質(zhì)的提高提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米,黑龍江省哈爾濱市延壽縣種植的綏粳18品種,2021年當(dāng)季新米,十月稻田公司;海藻糖(純度98%),日本林源公司;其他試劑,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR),德國 Bruker公司;Q2000型差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC),美國TA公司;NMI20-060H-I型核磁共振成像分析儀,上海紐邁電子科技有限公司;CSPM4000型原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM),廣州本原納米儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1淀粉的分離及回生樣品的制備

淀粉提取[8]:大米用膠體磨磨粉,大米粉、NaOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)在料液比(g/mL)1∶5的條件下,浸泡3 h后離心(如無特殊說明,本研究離心參數(shù)均為4 000 r/min、10 min),對沉淀進(jìn)行水洗再離心,并重復(fù)3次,離心所得沉淀按料液比(g/mL)1∶5在體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液中浸泡3 h進(jìn)行脫脂,沉淀物用乙醇清洗后離心(乙醇洗加離心重復(fù)3次),之后再水洗加離心2次,50 ℃烘箱干燥后粉碎過100目篩得到粗淀粉。粗淀粉配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的溶液,50 ℃保持體系pH值恒定在10,加入5 mg/g的蛋白酶,緩慢攪拌反應(yīng)6 h,離心取沉淀水洗后再離心(水洗加離心重復(fù)3次)以充分除去蛋白質(zhì)。將沉淀溶解在蒸餾水中再調(diào)整體系pH值至7,攪拌5 min再離心,刮掉沉淀上層黑棕色物質(zhì)后水洗離心(水洗加離心重復(fù)3次)。沉淀中加入等比例混合的甲醇和乙醚,攪拌1 h后再離心3次充分除去脂類,最后置于50 ℃烘箱干燥。采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)測定蛋白質(zhì)[9],以檢測淀粉提取過程中蛋白質(zhì)是否洗脫徹底;采用蒽酮比色法測定淀粉含量[10]。

稱取3.5 mg大米淀粉、3.5 mg海藻糖和3.5 mg海藻糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%)-大米淀粉混合物(T-淀粉)于坩堝中,按料液比(g/mL)1∶2加入去離子水,密封后平衡過夜。用DSC對平衡樣品進(jìn)行糊化,加熱程序:以8 ℃/min的速率從25 ℃升溫至150 ℃,再以30 ℃/min的速率冷卻至4 ℃。測定淀粉糊化曲線,計算糊化焓(ΔHt),并于4 ℃條件下儲存0、3、24 h和3、7、21 d待用。

1.3.2直鏈淀粉含量的測定

將大米淀粉和T-淀粉配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的懸浮液,95 ℃攪拌30 min使淀粉充分糊化,在4 ℃下冷藏3、24 h后,離心(12 000 r/min、20 min)取上清液。參照劉建壘等[11]的方法,采用雙波長法測定浸出的直鏈淀粉含量;采用HPLC-ELSD法[12],測定T-淀粉上清液中海藻糖含量。

1.3.3淀粉分子構(gòu)象表征

分別精確稱取2.4 mg1.3.1節(jié)儲存0、24 h的樣品(水質(zhì)量分?jǐn)?shù)66.7%),以35 ℃去離子水,梯度稀釋至樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.000 8%。取稀釋液3 μL平鋪于云母片,溫度25 ℃和相對濕度75%的條件下自然蒸發(fā)干燥。干燥后云母片采用AFM以接觸模式掃描并成像。淀粉顆粒大小和形狀由圖像處理軟件Imager 4.50分析。

1.3.4淀粉分子結(jié)構(gòu)的測定

將1.3.2節(jié)中4 ℃冷藏3、24 h后的樣品進(jìn)行真空冷凍干燥,干燥后研磨成粉,與溴化鉀按質(zhì)量比1∶100混合壓片后進(jìn)行FTIR掃描測定。掃描波數(shù)為850～3 600 cm-1,分辨率為4 cm-1。用OMNIC分析軟件分析淀粉的短程有序性。

1.3.5淀粉水分遷移的測定

采用低場核磁共振技術(shù)測定回生樣品自旋-自旋弛豫時間(spin-spin relaxation time,T2)[13]。

1.3.6淀粉凝膠流變學(xué)特性的測定

參照Yang等[5]的方法,配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%大米淀粉以及添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%海藻糖的大米淀粉混合液的樣品懸浮液,在磁力攪拌器不停地攪拌下取1 mL樣品置于流變儀的不銹鋼平臺上。溫度掃描程序:以5 ℃/min的加熱速率從30 ℃加熱到95 ℃,在95 ℃下保持3.5 min,然后再以5 ℃/min的速率從95 ℃降溫至50 ℃,繼續(xù)保溫2.0 min。前10 s內(nèi)攪拌速率為960 r/min,而后以160 r/min的攪拌速率進(jìn)行測定。

掃描結(jié)束后的樣品,立即進(jìn)行動態(tài)頻率掃描測試,動態(tài)頻率掃描的測定參數(shù):掃描溫度50 ℃、角頻率0.2～200 rad/s、應(yīng)變1%。

1.3.7淀粉凝膠回生特性的測定

將1.3.1節(jié)中儲藏24 h和3、7、21 d的樣品進(jìn)行熱流測定,測定樣品的回生焓(ΔH),測試的升溫程序:以10 ℃/min的速率從25 ℃升溫至150 ℃。分別計算回生1、3、7、21 d時大米淀粉和T-淀粉ΔH與ΔHt的比值,作為淀粉回生率R(%)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Excel 2019和SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,單因素方差分析差異顯著性,采用Origin2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖對大米浸出直鏈淀粉含量的影響

直鏈淀粉與支鏈淀粉相比,對熱處理更為敏感,加熱后,溶出的直鏈淀粉容易相互聚集,并對淀粉凝膠的形成和回生都會產(chǎn)生一定的影響[14]。海藻糖對大米浸出直鏈淀粉含量的影響見表1。由表1可知,T-淀粉中游離的直鏈淀粉質(zhì)量比顯著降低(P<0.05)?；厣? h處理后,T-淀粉的浸出直鏈淀粉質(zhì)量比比大米淀粉降低了8.6%,隨著低溫儲藏時間的延長,回生24 h處理后,T-淀粉浸出的直鏈淀粉含量比大米淀粉降低了11.5%。直鏈淀粉分子間的聚合重排產(chǎn)生的結(jié)晶,致使淀粉形成了短期回生現(xiàn)象,海藻糖因其特有的持水性,攜水分子共同參與淀粉回生過程中分子重排的進(jìn)程,抑制了直鏈淀粉分子之間的相互作用?；厣? h處理的T-淀粉上清液中海藻糖的質(zhì)量比為1.37 mg/g,而回生24 h處理的T-淀粉上清液中海藻糖的質(zhì)量比降低到1.28 mg/g(表1)。這個結(jié)果也從側(cè)面證實(shí)了海藻糖會隨著淀粉回生的進(jìn)程而逐漸參與淀粉分子的重排,降低直鏈淀粉之間形成團(tuán)聚體的可能性,從而延緩大米淀粉的回生[15],老化時間越長其抑制效果越明顯。因此,海藻糖是非常有潛力和優(yōu)勢的抗大米淀粉老化的添加物質(zhì)。

表1 海藻糖對大米浸出直鏈淀粉質(zhì)量比的影響

2.2 海藻糖對淀粉分子有序化形態(tài)的影響

大米淀粉顆粒粒徑為3～8 μm,絕大多數(shù)為支鏈淀粉,其含量約占淀粉總量的80%,支鏈淀粉一般由幾千個葡萄糖殘基構(gòu)成,帶有多分枝結(jié)構(gòu),在較高的溫度下,支鏈淀粉被充分水化,分子結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展,有序結(jié)構(gòu)被解開,分子鏈以單螺旋或無規(guī)則線團(tuán)的形式存在。支鏈淀粉對糊化以及回生后淀粉的形態(tài)起決定性的作用。海藻糖對淀粉分子有序化形態(tài)的影響見圖1。由圖1(a)可知,剛開始糊化的大米淀粉分子呈明顯的多邊形凝聚狀,除個別形成200 nm×500 nm左右的聚集團(tuán)外,其余分布較均勻的聚集團(tuán)橫向?yàn)?0～40 nm,縱向約為100 nm,由于淀粉單鏈螺旋直徑約1.3 nm,等效于大部分分布均勻的聚集團(tuán)內(nèi)部橫向排列23～30條單螺旋分子鏈,縱向排列大約70條單螺旋分子鏈,整體上糊化的淀粉分子呈現(xiàn)縱向排列的趨勢[16-17]?；厣?4 h后,大米淀粉分子鏈橫向排列更為緊湊,縱向構(gòu)象趨于收縮并具有排列有序性[圖1(b)]。不同于剛糊化淀粉的多邊形凝聚狀,回生淀粉呈現(xiàn)較為明顯的顆粒狀凝聚,且凝聚的集團(tuán)整體變小,大部分大小較均勻的聚集團(tuán)的橫向約為30 nm,縱向?yàn)?0～40 nm,與糊化態(tài)相比,表現(xiàn)出典型的球形或圓柱狀,等效于聚集團(tuán)內(nèi)部橫向和縱向均排列30條左右的單螺旋分子鏈,表明在淀粉回生過程中,淀粉分子鏈構(gòu)象收縮,更趨于有序規(guī)則化排列[18]。T-淀粉在回生處理3 h后還具有和糊化的大米淀粉基本相似的多邊形凝聚狀[圖1(c)];回生處理24 h,T-淀粉的分子構(gòu)象收縮不顯著[圖1(d)],不同于圖1(b)中大米淀粉表現(xiàn)出明顯的顆粒聚集態(tài),T-淀粉仍呈現(xiàn)出多邊形的聚集狀,且淀粉分子仍表現(xiàn)為縱向排列,說明海藻糖可以有效抑制淀粉分子向有序構(gòu)象發(fā)生收縮重排。

圖1 海藻糖對淀粉分子有序化形態(tài)的影響

2.3 海藻糖對大米淀粉分子結(jié)構(gòu)的影響

利用FTIR測定了不同處理后回生樣品的分子結(jié)構(gòu),見圖2。所有回生樣品的紅外光譜在3 100～3 600 cm-1有一個寬而強(qiáng)的吸收峰,這是多糖分子間的羥基伸縮振動吸收峰[19]。糊化淀粉和回生24 h的淀粉羥基伸縮振動吸收峰都出現(xiàn)在波數(shù)3 286 cm-1左右,而回生24 h處理的T-淀粉的羥基伸縮振動吸收峰出現(xiàn)在3 276 cm-1,這種變化表明海藻糖的添加,可以有效增加分子之間的氫鍵相互作用。添加海藻糖只是引起譜帶位移的變化,沒有形成新的特征峰,說明海藻糖與大米淀粉之間沒有發(fā)生共價結(jié)合且并未形成新的基團(tuán),只是二者之間的氫鍵相互作用阻礙了直鏈淀粉間氫鍵的形成[20]。

圖2 不同處理后大米淀粉紅外光譜

FTIR光譜波數(shù)800～1 200 cm-1可以反映淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)。1 022 cm-1和1 047 cm-1分別表示淀粉顆粒中無定形和有序(結(jié)晶)區(qū)域的數(shù)量,1 047 cm-1/1 022 cm-1的值可以表征晶體的有序程度(order degree,OD)[20],不同處理大米淀粉的OD 值見表2。大米淀粉在儲藏過程中OD值發(fā)生了較大變化,大米淀粉回生24 h后OD值增加了19.0%,而T-淀粉回生24 h后OD值僅比未回生淀粉增加了3.0%,海藻糖顯著降低了OD值(P<0.05),這賦予了海藻糖延緩淀粉回生程度的能力。

表2 不同處理對大米淀粉有序程度的影響

2.4 海藻糖對大米淀粉水分分布的影響

回生處理24 h后,大米淀粉與T-淀粉的水分分布見圖3。由圖3可知,回生處理的T-淀粉與大米淀粉樣品的弛豫譜中都有強(qiáng)結(jié)合水、弱結(jié)合水、自由水3種不同遷移率的水分子[21],海藻糖的加入在本質(zhì)上沒有改變淀粉中水分的存在形式。

圖3 不同處理對大米淀粉水分分布的影響

根據(jù)弛豫譜的積分結(jié)果,獲得強(qiáng)結(jié)合水、弱結(jié)合水、自由水在淀粉中對應(yīng)峰的峰面積(PA21、PA22、PA23),見表3。海藻糖的添加,增加了淀粉中的強(qiáng)、弱結(jié)合水的含量,二者含量的提高也導(dǎo)致淀粉中自由水含量被進(jìn)一步壓縮。在淀粉的回生過程中,淀粉鏈與淀粉鏈的結(jié)合等級優(yōu)先于淀粉鏈與水分子的結(jié)合,回生使得在充盈水環(huán)境中完全糊化形成的淀粉鏈與水分子的氫鍵趨于不穩(wěn)定而斷裂,淀粉重結(jié)晶過程中結(jié)合水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?。海藻糖與暴露出來的淀粉分子鏈末端的自由羰基通過氫鍵相互作用結(jié)合,而缺失電子的羰基被水分子附著并滲透到淀粉晶型結(jié)構(gòu)中去,從而導(dǎo)致淀粉的雙螺旋重新排列。海藻糖作為小分子糖類,易自由進(jìn)入淀粉分子鏈的內(nèi)部,這是海藻糖能參與淀粉重結(jié)晶的第一個關(guān)鍵基礎(chǔ);此外,海藻糖攜帶的多羥基結(jié)構(gòu)又可以與淀粉分子鏈末段暴露的羰基相互結(jié)合,二者的結(jié)合可以有效抑制淀粉分子鏈與鏈之間氫鍵相互作用的形成,使體系中自由水的析出以及重結(jié)晶進(jìn)程受阻,大大抑制了淀粉的短期回生[22]。

表3 不同處理對大米淀粉弛豫峰面積的影響

2.5 海藻糖對大米淀粉流變學(xué)特性的影響

淀粉溫度掃描結(jié)果見圖4。無論添加海藻糖與否,隨著溫度的升高,體系的儲能模量(G′)均會增強(qiáng),表明糊化為體系帶來的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)開始逐漸形成,然而當(dāng)溫度開始降低后,凝膠網(wǎng)絡(luò)的剛性逐漸降低,表現(xiàn)為G′下降[23]。但是海藻糖的加入,致使體系整體的G′下降。根據(jù)表1的結(jié)果,添加海藻糖可以有效降低浸出直鏈淀粉含量,這阻礙了淀粉凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成,淀粉體系的剛性下降,進(jìn)而導(dǎo)致其G′低于大米淀粉體系。本研究溫度掃描實(shí)驗(yàn)中升溫和降溫時間較短,旨在闡述海藻糖對淀粉短期回生進(jìn)程的影響,得到的淀粉體系剛性降低的結(jié)果再一次印證了海藻糖對大米淀粉的短期回生具有抑制作用。

圖4 海藻糖對大米淀粉溫度掃描曲線的影響

添加海藻糖對大米淀粉凝膠動態(tài)頻率掃描曲線的影響見圖5。從圖5中可以看出,在角頻率小于2 rad/s時,大米淀粉凝膠體系和T-淀粉凝膠體系的損耗模量(G″)均高于G′;當(dāng)角頻率逐漸增大后,2種凝膠體系又都表現(xiàn)出G′高于G″的趨勢。隨著掃描頻率的增加,2種淀粉凝膠的G′和G″都逐漸增加,且G′高于相應(yīng)的G″。在掃描范圍內(nèi),2種淀粉凝膠的G′一直在升高,而當(dāng)角頻率大于80 rad/s后,2種淀粉凝膠的G″開始下降。對于添加了海藻糖的淀粉凝膠體系來說,G′低于而G″高于大米淀粉凝膠體系,這可能是由于海藻糖的加入使得凝膠體系中海藻糖分子和淀粉分子鏈間發(fā)生一定的纏結(jié),浸出的直鏈淀粉減少,凝膠體系的剛性變?nèi)?但是海藻糖與淀粉分子的糾纏卻增加了混合物凝膠體系網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)的密度[23],從而增加了體系的黏性,增大了回生重結(jié)晶的阻力。當(dāng)掃描角頻率大于80 rad/s后,體系的形變過大,已經(jīng)超出線性黏彈區(qū)范圍,凝膠體系的損耗模量開始下降,但由于海藻糖的糾纏,T-淀粉表現(xiàn)出對形變更好的抵抗性。

圖5 海藻糖對大米淀粉動態(tài)頻率掃描曲線的影響

2.6 海藻糖對淀粉長期回生特性的影響

在低溫條件下貯存時,糊化后淀粉分子向低能態(tài)轉(zhuǎn)變,淀粉鏈之間通過分子重排,以氫鍵結(jié)合方式形成趨向規(guī)則的晶體聚合物。淀粉ΔH為淀粉晶體聚合物發(fā)生熔融時所需要的能量,ΔH越大,說明淀粉的回生程度越大[24]。不同回生天數(shù)的大米淀粉和T-淀粉的焓變曲線如圖6。2種樣品的回生吸熱峰均出現(xiàn)在45～60 ℃,隨著回生時間的延長,2種樣品的回生吸熱峰的峰面積都逐漸增大;但是相同回生時間下,T-淀粉的回生吸熱峰峰面積一直低于大米淀粉。表4為大米淀粉與T-淀粉的回生參數(shù)。由表4可知,加入海藻糖后淀粉體系的ΔH和回生度(R)均顯著降低,且海藻糖帶來的這種優(yōu)勢隨著老化時間的延長而越發(fā)凸顯,說明淀粉晶體堆積的能力逐漸減弱,淀粉回生程度逐漸降低。Xiao等[25]研究發(fā)現(xiàn),因?yàn)槎喾又械牧u基易與淀粉中的羥基形成氫鍵,從而抑制淀粉分子聚合鏈的形成,使得回生淀粉的重結(jié)晶在熔融時所需的能量下降。海藻糖也含有多羥基,其抑制淀粉長期回生的機(jī)理與多酚可能類似。海藻糖比茶多酚分子更小,具有更小的空間位阻,更容易進(jìn)入淀粉分子內(nèi)部,除與直鏈淀粉發(fā)生氫鍵相互作用外,與支鏈淀粉發(fā)生糾纏的機(jī)會也更大,支鏈淀粉分子間的重新結(jié)晶排布,是淀粉發(fā)生長期回生的主要原因。因此,海藻糖的參與可以有效抑制支鏈淀粉間的氫鍵相互作用,從而對阻止淀粉的長期回生也同樣具有積極的作用。

圖6 不同回生時間大米淀粉焓變曲線

表4 大米淀粉糊化特性及低溫儲藏過程中的回生特性

3 結(jié) 論

研究了海藻糖影響大米淀粉回生特性的機(jī)理。結(jié)果顯示,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%海藻糖的大米淀粉(T-淀粉)回生3、24 h后,浸出直鏈淀粉含量比大米淀粉分別降低了8.6%和11.5%,海藻糖抑制了直鏈淀粉的浸出重排。添加海藻糖后淀粉回生過程中分子鏈構(gòu)象收縮被顯著抑制。大米淀粉回生24 h后OD值增加了19.0%,而T-淀粉回生24 h后OD值僅比未回生淀粉增加了3.0%,表明海藻糖能顯著降低大米淀粉體系的短程有序結(jié)構(gòu),延緩淀粉回生程度。比較大米淀粉和T-淀粉水分遷移的區(qū)別,發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)秀持水性的海藻糖使淀粉的強(qiáng)結(jié)合水和弱結(jié)合水含量顯著增大,抑制了水分的遷移。進(jìn)一步分析海藻糖對淀粉凝膠體系流變學(xué)和長期回生特性的影響,發(fā)現(xiàn)海藻糖不僅能夠有效抑制淀粉的短期回生,對長期回生也有較好的抑制作用。