馮晴霞, 孫艷艷, 孫晶波, 苑廣信, 安麗萍,*

(1.吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院 食品藥品工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130012;2.北華大學(xué) 藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

人體的衰老是指細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)和機(jī)能上所出現(xiàn)的退行性變化,如神經(jīng)系統(tǒng)逐步發(fā)生衰退進(jìn)而產(chǎn)生行為障礙、學(xué)習(xí)記憶能力減退等[1-2]。機(jī)體氧化應(yīng)激程度加劇是衰老發(fā)生的重要原因,主要取決于氧化與抗氧化體系的平衡[3-6]。因此,提高機(jī)體的抗氧化能力,可以延緩衰老進(jìn)程。天然產(chǎn)物含有大量的抗氧化活性物質(zhì),其所具有的預(yù)防衰老及相關(guān)疾病功能已成為食品營(yíng)養(yǎng)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

姬松茸(AgaricusblazeiMurill)又名小松菇、巴西蘑菇,是一種大型真菌,具有濃郁杏仁香味,屬擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇(黑傘)科蘑菇(黑傘)屬[7-8]。姬松茸子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、糖類、甾醇、黃酮等多種生物活性物質(zhì),具有廣泛的生物活性,如抗腫瘤、降血糖、抗炎、增強(qiáng)免疫力等[9-10]。姬松茸蛋白具有突出的抗氧化活性,能夠提高乙酰膽堿酯酶的活性。蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶部分水解后,可獲得具有多種生物活性的多肽。與大分子蛋白相比,小分子生物多肽具有安全穩(wěn)定、易溶于水、易吸收等優(yōu)點(diǎn)。并且多肽抗氧化的能力與分子質(zhì)量有關(guān),分子質(zhì)量越小,其抗氧化能力越好[10]。蒲超等[11]研究表明,姬松茸多糖可以抑制軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡。徐天雄[12]研究發(fā)現(xiàn),姬松茸水提物具有良好的腫瘤微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)活性,并促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。而國(guó)內(nèi)目前對(duì)于姬松茸多肽的研究鮮見(jiàn)報(bào)道,因此,本研究選擇姬松茸子實(shí)體中提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶水解后的活性物質(zhì),即姬松茸多肽(Agaricusblazeipolypeptide,ABp)。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)也證明,ABp具有體外抗氧化作用,對(duì)羥基自由基具有較好的清除作用,但其抗衰老效果和作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究擬通過(guò)D-半乳糖(D-gal)注射建立小鼠衰老模型,并評(píng)價(jià)ABp的抗衰老作用,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白免疫印跡分析ABp干預(yù)后衰老小鼠的基因及蛋白表達(dá)差異,探討ABp抗衰老的潛在作用機(jī)制。研究旨在為姬松茸的抗衰老功能食品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姬松茸子實(shí)體,江蘇省蘇威微生物研究有限公司,經(jīng)北華大學(xué)藥學(xué)院韓東教授鑒定;D-gal,西格瑪奧(上海)貿(mào)易公司;SPF級(jí)雄性ICR小鼠,4～5周齡,體質(zhì)量(20.0±2.0)g,52只,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SCX(吉)-2016-0003,長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司;活性氧簇(ROS)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒,南京建成生物工程研究院;大鼠單克隆BrdU抗體、單克隆抗體NeuN、山羊抗大鼠IgG-Alexa Fluor 594、山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488,abcam公司;HOECHST 33258,ABclonal公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,北京艾德來(lái)生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA Purifer TM10型蛋白質(zhì)層析儀,美國(guó)通用電氣公司;UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),島津國(guó)際貿(mào)易有限公司;MT-200型Morris水迷宮分析儀,成都泰盟科技有限公司;BA-200型小鼠避暗儀,成都泰盟科技有限公司;TOWER2.2型熒光定量PCR儀,德國(guó)ANALYTIKJENA;scandrop型超微量核酸蛋白測(cè)定儀,德國(guó)耶拿分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1ABp的制備

將姬松茸的粉狀子實(shí)體(約2 500 g)在5 000 mL冰水混合物中勻漿,5 000 r/min離心3 min取上清液,隨后采用硫酸銨,在4 ℃下,將上清液中的可溶性蛋白質(zhì)沉淀過(guò)夜。合并得到的沉淀,在去離子水中溶解,并使用截留分子質(zhì)量30 kDa的透析膜,在4 ℃下,用去離子水透析24 h。透析后,冷凍干燥得到姬松茸蛋白粉,按料液比1∶20(g/mL)加入蒸餾水,用 0.1 mol/L 的鹽酸調(diào)pH值至2.5,按照3 000 U/mg 的加酶量加入胃蛋白酶解液,混勻后置于37 ℃恒溫水浴中酶解4 h,100 ℃條件下加熱10 min使酶失活,凍干后初步提取出姬松茸粗多肽。

利用蛋白質(zhì)層析儀分離多肽。將Preswollen DEAE-32柱填料裝入5 mL柱體中。隨后用1.5 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡3個(gè)柱體積,流速為0.5 mL/min。將粗蛋白質(zhì)溶于Tris-HCl緩沖液中,使用0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行上樣,0～0.5 mol/L線性梯度NaCl溶液連續(xù)洗脫,并使用級(jí)分收集器收集220 nm吸收峰處的級(jí)分,凍干。使用同樣的方法安裝并平衡Cellulose CM-52柱,將級(jí)分進(jìn)一步于CM-52柱進(jìn)行分離,并用 0～0.5 mol/L的線性梯度NaCl溶液沖洗3個(gè)柱體積,流速為0.5 mL/min,收集220 nm吸收峰處的組分。將組分凍干成粉末溶于去離子水中,最終通過(guò)Hi TrapTM脫鹽柱凈化脫鹽,使用去離子水洗脫1.5個(gè)柱體積,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

1.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

選取6周齡雄性ICR小鼠52只,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照(Con)組、模型(Mod)組、ABp組和吡拉西坦(Pir)組,每組13只。除Con組外,其他組小鼠按體質(zhì)量每日皮下注射D-gal 300 mg/kg。Con組小鼠注射相同劑量的生理鹽水,Pir組每日按體質(zhì)量灌胃800 mg/kg的吡拉西坦,ABp組每日按體質(zhì)量灌胃400 mg/kg ABp。Con組、Mod組每日灌胃等量蒸餾水。

1.3.3小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

小鼠處理第42天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。小鼠放入明室中使其適應(yīng)環(huán)境后,給予5 min持續(xù)電流,以2 d為訓(xùn)練周期,記錄5 min內(nèi)的小鼠錯(cuò)誤總數(shù)和小鼠第1次被電擊的錯(cuò)誤潛伏期。

采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。將各組小鼠定點(diǎn)放入水池,記錄每只小鼠在120 s內(nèi)到達(dá)隱形平臺(tái)的潛伏期,共訓(xùn)練6 d。第7天撤去平臺(tái),以120 s內(nèi)小鼠分別在中心環(huán)、中環(huán)、目標(biāo)象限的游泳穿梭次數(shù)評(píng)估小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[12]。

1.3.4小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠末次處理24 h后,眼球取血,4 ℃離心(10 000 r/min)分離血清,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清總抗氧化能力及SOD、MDA、ROS水平。

1.3.5小鼠海馬區(qū)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

選取小鼠海馬區(qū)進(jìn)行差異基因篩選。利用Hisat軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)參考基因組,利用比對(duì)的結(jié)果組裝轉(zhuǎn)錄本。采用edgeR進(jìn)行差異表達(dá)分析,采用R語(yǔ)言對(duì)差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行圖形化展示。

采用FPKM度量基因表達(dá)的豐度值以衡量基因的表達(dá)水平。同時(shí)通過(guò)t檢驗(yàn)閾值以及對(duì)t檢驗(yàn)P值進(jìn)行FDR校正的Q閾值初步篩選出目的基因。按照同時(shí)滿足FPKM>10、Q閾值<0.05、差異倍數(shù)>1.5或差異倍數(shù)<0.6的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。

1.3.6小鼠海馬區(qū)基因的表達(dá)水平檢測(cè)

采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)小鼠海馬區(qū)的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作,合成的cDNA在94 ℃進(jìn)行預(yù)變性5 min,35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 s),72 ℃退火7 min,基因引物見(jiàn)表1。測(cè)定軟件為SDS v2.2,基于Ct方法計(jì)算靶基因表達(dá)水平。

表1 基因引物序列

1.3.7小鼠海馬區(qū)蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)

取小鼠海馬區(qū)加入適量體積的RIPA裂解液進(jìn)行裂解和蛋白抽提。利用Bradford法測(cè)定抽提液的蛋白濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白的分離,隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉條帶1 h,孵育Nrf2、HO-1、Keap1、p53、Hsph1、Apoe、Trim32一抗(體積比 1∶500稀釋)過(guò)夜,于37 ℃恒溫靜置孵育二抗(體積比1∶200 0稀釋)1 h,清洗3次,顯色后用掃描儀掃描膠片。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理各組數(shù)據(jù),結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差,采用t檢驗(yàn)判斷結(jié)果的顯著性,P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABp的制備及純化結(jié)果

姬松茸蛋白水解物經(jīng)不同柱層析純化結(jié)果,見(jiàn)圖1。由圖1可知,DEAE-32離子交換色譜柱純化蛋白水解物得到4個(gè)主峰。將響應(yīng)值最大的DE2峰組分用于CM-52離子交換色譜純化,得到2個(gè)主峰。采用脫鹽柱純化響應(yīng)值最大的CM1組分得到ABp。ABp在蛋白電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果中呈現(xiàn)單一條帶,分子質(zhì)量為3.3 kDa。

圖1 ABp的純化及鑒定

2.2 ABp對(duì)D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠記憶能力的影響

小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,與Con組比較,Mod組小鼠避暗錯(cuò)誤次數(shù)增高100%(P<0.05)。與Mod組比較,ABp組錯(cuò)誤次數(shù)減少37.5%(P<0.05),且潛伏期時(shí)間顯著增加。Morris水迷宮測(cè)試,見(jiàn)圖3。研究結(jié)果表明,與Con組比較,Mod組小鼠在第4～5 d期間到達(dá)平臺(tái)的潛伏期顯著增加(P<0.05)。與Mod組相比,ABp組小鼠的潛伏時(shí)間顯著降低,為Mod組的56.3%(P<0.05)。第7 d的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較Con組,Mod組小鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間顯著增加,穿越中心環(huán)和中環(huán)的次數(shù)顯著減少(P<0.05)。而與Mod組的相比,ABp組小鼠的潛伏期更短,在中心環(huán)和中環(huán)逗留的時(shí)間及穿越次數(shù)顯著增加(P<0.05)。

與Con組比較,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。與Mod組比較,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.3 ABp對(duì)D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠血清氧化水平的影響

小鼠血清中MDA濃度、ROS水平、CAT活力及總抗氧化能力變化見(jiàn)圖4。與Con組比較,Mod組小鼠血清中MDA濃度及ROS含量顯著升高,而血清抗氧化能力及CAT活性明顯降低(P<0.05)。而與Con組比較,ABp組小鼠血清中MDA濃度降低65.0%(P<0.05),CAT活性升高98.6%,總抗氧化能力升高30.2%(P<0.05)。

與Con組比較,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。與Mod組比較,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.4 ABp對(duì)D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠海馬區(qū)基因表達(dá)的影響

Mod組和ABp組小鼠海馬區(qū)基因表達(dá)差異見(jiàn)圖5。由圖5可知,ABp組與Mod組相比存在大量具有顯著性差異的基因。

基因聚類分析結(jié)果表明,Mod組和ABp組小鼠中共存在295個(gè)差異基因。與Mod組比較,ABp上調(diào)小鼠海馬區(qū)基因79個(gè),下調(diào)基因216個(gè)。

GO和 KEGG富集性分析結(jié)果顯示,Mod組與ABp組小鼠的差異基因主要涉及細(xì)胞膜組成、蛋白質(zhì)結(jié)合,如神經(jīng)活性配體-受體相互作用,突觸功能等。表達(dá)差異顯著的基因分別是Apoe、Hsph1、Trim32、Atp1a3、Stxbp1、Mapk8ip1、Hnrnpa1、Hk1、Grik5。小鼠海馬區(qū)腦組織mRNA的驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖6。與Mod組相比,ABp組小鼠海馬區(qū)的Hsph1、Trim32、HK1、Hnrnpa1、Grik5 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05),Atp1a3、Stxbp1、Apoe、Mapk8ip1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。

*表示同一基因組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.5 ABp對(duì)D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠海馬區(qū)蛋白表達(dá)影響

小鼠海馬區(qū)蛋白表達(dá)水平差異見(jiàn)圖7。與Con組比較,Mod組小鼠海馬區(qū)中Keap1、P53、Apoe蛋白水平顯著升高(P<0.05),Nrf2、HO-1、Hsph1、Trim32蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與Mod組相比,ABp組小鼠海馬區(qū)中Keap1、P53、Apoe蛋白水平分別降低32.6%、71.4%、25.7%(P<0.05),Nrf2、HO-1、Hsph1、Trim32蛋白水平分別顯著上升20.5%、52.8%、125.4%、52.4%(P<0.05)。

與Con組比較,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。與Mod組比較,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

衰老是機(jī)體各組織、器官功能隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生退行性變化的過(guò)程。衰老可降低機(jī)體面對(duì)環(huán)境脅迫維持動(dòng)態(tài)平衡的能力,從而增加機(jī)體患病和死亡的可能性,其發(fā)生與氧化應(yīng)激的積累密切相關(guān)[10-14]。D-gal誘導(dǎo)的衰老模型能夠阻斷大腦皮層、隔區(qū)、海馬中受體的結(jié)合位點(diǎn),并引發(fā)腦內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)改變[15-16]。D-gal致衰老的機(jī)制在于可使生物體中產(chǎn)生大量的ROS,導(dǎo)致細(xì)胞線粒體系統(tǒng)損傷,產(chǎn)生大量過(guò)氧化脂質(zhì),同時(shí)過(guò)氧化產(chǎn)物使MDA水平升高,CAT等抗氧化酶活力下降,最終導(dǎo)致抗氧化水平降低及機(jī)體損傷;同時(shí),海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)彌散、細(xì)胞核變小、排列松散等現(xiàn)象[17-18]。研究結(jié)果顯示,Mod組小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶力衰退、行為學(xué)能力降低、反應(yīng)遲緩,具有明顯的衰老癥狀。而ABp干預(yù)后,小鼠運(yùn)動(dòng)和記憶力能力有所提高。小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ABp組與Mod組比較,錯(cuò)誤次數(shù)減少37.5%。水迷宮實(shí)驗(yàn)中,相比Mod組,ABp組小鼠的潛伏期更短,在中心環(huán)和中環(huán)逗留的時(shí)間增加,穿越次數(shù)增加。與Mod組比較,ABp組小鼠血清MDA濃度降低65.0%、CAT活性升高98.6%、總抗氧化能力升高30.2%。研究結(jié)果表明,ABp能夠顯著增強(qiáng)抗氧化酶的活力,清除過(guò)剩的ROS,降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,ABp在參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜的組成、蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程中影響基因分布最廣,包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、GABA突觸功能等。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,Apoe可以調(diào)控多種氧化損傷相關(guān)基因,包括Atp1a3、Mapk8ip1、Hnrnpa1等,在神經(jīng)元的發(fā)育、修復(fù)和重塑中發(fā)揮重要作用。Stxbp1復(fù)合物調(diào)節(jié)發(fā)育中的神經(jīng)元突觸前囊泡融合,參與腦部發(fā)育與神經(jīng)傳遞[19]。HK1為線粒體外膜蛋白(己糖激酶),是糖酵解過(guò)程中的第一個(gè)限速酶,參與細(xì)胞的糖脂代謝。Grik5為谷氨酸受體離子型,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多突觸中充當(dāng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[20]。經(jīng)ABp干預(yù)的衰老小鼠海馬區(qū)中Hsph1、Trime32、HK1 mRNA表達(dá)量顯著增高,Atp1a3、Stxbp1 mRNA表達(dá)量顯著降低。ABp的抗衰老作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂蛋白代謝功能、神經(jīng)傳遞障礙、氧化損傷、新神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育,并對(duì)Apoe、Hsph1、Trim32、Atp1a3、Stxbp1、Mapk8ip1、Hnrnpa1、Hk1、Grik5基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,從而發(fā)揮抗衰老作用。

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,對(duì)腦組織中氧化應(yīng)激敏感;通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)Nrf2的活性,可以有效地對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而減輕衰老癥狀[21]。Apoe和Keap1是Nrf2負(fù)調(diào)控因子,其自身的泛素化、磷酸化以及核穿梭水平影響Nrf2的活力,在神經(jīng)元的發(fā)育、修復(fù)和重塑中發(fā)揮重要作用。P53作為一種控制多種分子信號(hào)通路的關(guān)鍵性蛋白,參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)并受Nrf2調(diào)控,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因氧化損傷而出現(xiàn)的生長(zhǎng)停滯或凋亡[21-22]。研究結(jié)果顯示,與Mod組相比,ABp組小鼠腦組織中Keap1蛋白水平降低32.6%、P53蛋白水平降低71.4%、Nrf2顯著上升20.5%。因此,ABp可能通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/P53信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激,發(fā)揮抗衰老作用。

4 結(jié) 論

通過(guò)胃蛋白酶水解姬松茸子實(shí)體蛋白,獲得分子質(zhì)量為3.3 kDa的ABp。研究結(jié)果表明,ABp可顯著改善由D-gal引起的小鼠記憶功能紊亂。相比Mod組小鼠,ABp顯著降低了衰老模型小鼠血清中ROS含量和MDA濃度,顯著提升總抗氧化能力及CAT酶活力。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明:ABp組與Mod組小鼠基因表達(dá)水平對(duì)比,出現(xiàn)295個(gè)差異基因;與Mod組小鼠海馬區(qū)腦組織基因表達(dá)水平相比,ABp顯著上調(diào)了79個(gè)基因表達(dá)水平,顯著下調(diào)216個(gè)基因表達(dá)水平。蛋白印跡結(jié)果表明,ABp抗衰老活性的潛在作用機(jī)制可能與Keap1/Nrf2/P53信號(hào)通路有關(guān)。