覃亞娟, 王 萍, 陳小愛, 徐 飛, 朱科學(xué),張彥軍,*, 譚樂和

(1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040; 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 香料飲料研究所/國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心/海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質(zhì)控制重點實驗室/海南省熱帶香料飲料作物工程技術(shù)研究中心,海南 萬寧 571533)

淀粉是人類膳食的主要成分和最主要的能源物質(zhì),然而,淀粉類似于隱藏的糖,其快速消化會導(dǎo)致餐后血糖水平升高[1]。長期持續(xù)的餐后高血糖水平會造成胰島素分泌異常,進而誘發(fā)糖尿病和心血管疾病等慢性病[2]。目前,預(yù)防和治療高血糖主要通過改變飲食習(xí)慣,如控制高升糖食物的攝入或者在消化過程中干預(yù)葡萄糖的吸收等。據(jù)報道,α-淀粉酶是將淀粉水解為麥芽糖、低聚糖和少量葡萄糖的關(guān)鍵消化酶[3]。通過抑制α-淀粉酶的活性,能夠延遲淀粉消化,抑制腸道對葡萄糖的吸收,有效調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平[4]。目前,一些抑制α-淀粉酶的藥物常在臨床上被用于降糖,如阿卡波糖、二甲雙胍和瑞格列奈,但這些藥物易引發(fā)低血糖、胃腸功能紊亂和體重增加等副作用[4]。因此,研究天然有效且副作用少的α-淀粉酶抑制劑是十分必要的。

蘆丁、槲皮素和山奈酚是3種典型的黃酮類化合物,廣泛存在于多種熱帶植物中,如諾麗、番石榴和百香果等。此外,這3種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)特征相似,區(qū)別在于其B環(huán)C3’和C環(huán)上C3的官能團有所不同。本研究擬選取這3種黃酮類化合物,通過考察它們對α-淀粉酶的抑制作用,建立其抑制α-淀粉酶的構(gòu)效關(guān)系,確定黃酮類化合物發(fā)揮主要抑制作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。采用抑制動力學(xué)、熒光光譜、圓二色譜探究這些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)對黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的影響,從而更好地理解黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的機制。此外,通過分子對接技術(shù)考察黃酮類化合物和α-淀粉酶之間潛在的分子相互作用,探究黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的作用機制和構(gòu)效關(guān)系,以期為具有更高降血糖活性的黃酮類化合物功能性食品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁、槲皮素、山奈酚、阿卡波糖(質(zhì)量分數(shù)均大于98%)、豬胰腺α-淀粉酶(14 U/mg),上海源葉生物科技有限公司;可溶性淀粉,阿拉丁化工公司(上海)。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPECORD 250PLUS型紫外可見分光光度計,德國耶拿公司;F-7000型熒光分光光度計,日立高新技術(shù)公司;MOS-500型圓二色譜儀,法國Bio-Logic公司;AL104型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Cascada Ⅲ.Ⅰ10型超純水系統(tǒng),美國PALL公司;GT SONIC-T20型超聲波清洗機,廣東固特超聲股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1黃酮類化合物對α-淀粉酶抑制率的測定

根據(jù)Zhang等[11]的方法對α-淀粉酶活性進行測定,稍加修改。將500 μL不同濃度的蘆丁、槲皮素、山奈酚和阿卡波糖樣品溶液分別與250 μL的 α-淀粉酶(7 U/mL)溶液在37 ℃下孵育20 min。將500 μL糊化后的可溶性淀粉溶液(10 mg/mL)添加到反應(yīng)混合物中,在37 ℃下孵育3 min。反應(yīng)完畢后,迅速加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng),并將反應(yīng)產(chǎn)物在沸水中加熱8 min,冷卻至室溫后,用去離子水定容至25 mL,用分光光度計記錄溶液在540 nm處的吸光值。以阿卡波糖作為陽性對照。將所得結(jié)果代入式(1)計算樣品對α-淀粉酶的抑制率。用Graphpad prism 9計算IC50值。

(1)

式(1)中,A(樣品)為樣品溶液吸光值,A(樣品空白)為樣品空白溶液吸光值,A(對照)為對照溶液吸光值,A(對照空白)為對照空白溶液吸光值。

1.3.2α-淀粉酶抑制動力學(xué)參數(shù)的計算

3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制模式由1.3.1中的方法確定?？扇苄缘矸廴芤旱馁|(zhì)量濃度為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/mL。米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vmax)由Lineweaver-Burk方程確定,見式(2)。競爭性抑制常數(shù)(Kic)和非競爭性抑制常數(shù)(Kiu)根據(jù)式(3)、式(4)通過二次線性擬合計算獲得。

(2)

(3)

(4)

式(2)、(3)、(4)中,V表示初始反應(yīng)速率,mg/(mL·min);Vmax表示最大反應(yīng)速度,mg/(mL·min);Km表示米氏常數(shù),mg/mL;Kic表示競爭性抑制常數(shù),mg/mL;Kiu表示非競爭性抑制常數(shù),mg/mL;[I]表示抑制劑質(zhì)量濃度,mg/mL;α表示表觀系數(shù)。

1.3.3熒光光譜分析

1.3.3.1 二維熒光光譜分析

采用熒光分光光度計測定3種黃酮類化合物與α-淀粉酶的熒光淬滅光譜。將0.2 mL不同濃度的樣品溶液與3 mL α-淀粉酶溶液混合,分別在溫度為298、304、310 K下反應(yīng)20 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替樣品作為對照組,激發(fā)波長280 nm,發(fā)射波長290～500 nm,狹縫寬度5 nm。采用Stern-Volmer方程研究熒光淬滅類型,見式(5)。

(5)

式(5)中,F0和F分別表示存在和不存在黃酮類化合物時的熒光強度;Kq表示熒光淬滅速率常數(shù),L/(mol·s);τ0表示熒光團的壽命,2.97 ns;Ksv表示Stern-Volmer淬滅常數(shù),L/mol;[Q]表示淬滅劑的濃度,mol/L。

1.3.3.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的計算

為進一步確定黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制機制,參考Yang等[12]的方法,根據(jù)式(6)計算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。

(6)

式(6)中,Ka表示樣品與α-淀粉酶的結(jié)合常數(shù),L/mol;n是結(jié)合位點數(shù);[Q]表示淬滅劑的濃度,mol/L。

1.3.3.3 熱力學(xué)參數(shù)的計算

通過van’t Hoff方程[式(7)和式(8)]計算與結(jié)合相互作用相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù),以表征抑制劑與α-淀粉酶結(jié)合的主要相互作用力。

(7)

ΔG=ΔH-TΔS。

(8)

式(7)、(8)中,ΔH表示焓變,kJ/mol;ΔS表示熵變,kJ/(mol·K);ΔG表示自由能變化,kJ/mol;R表示氣體常數(shù),8.314 J/(mol·K);T表示測試溫度,K。

1.3.3.4 α-淀粉酶構(gòu)象分析

采用熒光分光光度計檢測3種黃酮類化合物與α-淀粉酶三維熒光光譜。將3種黃酮類化合物和α-淀粉酶溶液分別混合并孵育20 min。激發(fā)波長(λex)為200～350 nm,發(fā)射波長(λem)為200～400 nm,激發(fā)和發(fā)射間隔為10 nm。

1.3.4α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)分析

采用圓二色譜儀分析3種黃酮類化合物對α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響。將0.5 mL的樣品溶液與0.5 mL α-淀粉酶溶液混合,在37 ℃下反應(yīng)20 min。用PBS代替黃酮類化合物作為對照組。測定參數(shù):路徑長度為0.1 cm,步長為1 nm,波長為190～260 nm。在DichroWeb在線網(wǎng)站(http:∥dichroweb.cryst.bbk.ac.uk)上分析測試結(jié)果[12]。

1.3.5分子對接

采用AutoDock4.2軟件對3種黃酮類化合物與α-淀粉酶進行分子對接,并得到結(jié)合能。α-淀粉酶(PDB ID:1OSE)的模型通過RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.rcsb.org/pdb)獲得。蘆丁、槲皮素和山奈酚的結(jié)構(gòu)從ZINC數(shù)據(jù)庫中下載。通過去除水分子、添加極性氫和Kollman聯(lián)合原子電荷來處理黃酮類化合物和α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)以獲得PDB文件。采用拉馬克遺傳算法進行計算,搜索次數(shù)為100次。最后通過PyMOL和Dicscover Studio軟件進行可視化分析,根據(jù)對接結(jié)果得到對接參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS 21.0.1軟件對實驗結(jié)果進行顯著性分析(P< 0.05為差異顯著)。采用Origin 2022軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制效果

半數(shù)抑制濃度(IC50)通常被作為評價抑制劑對α-淀粉酶的抑制活性的指標。3種黃酮類化合物和阿卡波糖對α-淀粉酶抑制率測定結(jié)果見圖1,3種黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)見圖2,IC50值的計算結(jié)果見表1。

表1 3種黃酮類化合物和阿卡波糖抑制α-淀粉酶的IC50值

不同小寫字母代表同一指標差異顯著(P< 0.05)。

圖2 3種黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)

由圖1可知,隨著黃酮類化合物質(zhì)量濃度的增加,其對α-淀粉酶的抑制能力逐漸增強。由表1可知,3種黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的IC50值的順序由小到大依次為山奈酚、槲皮素、蘆丁。由圖2 可知,山奈酚對α-淀粉酶的抑制作用最強,這可能與其B環(huán)上C3’處的去羥基化有關(guān)。槲皮素C環(huán)上C3處的羥基糖基化后轉(zhuǎn)變?yōu)樘J丁,槲皮素抑制α-淀粉酶的能力強于蘆丁,可能與二者在此位置的基團不同有關(guān)。Wang等[13]報道,從番石榴葉中分離出的槲皮素對α-淀粉酶的抑制能力優(yōu)于其糖苷,與本實驗結(jié)果一致。雖然3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制能力低于阿卡波糖,但其天然特性和酶抑制作用結(jié)果仍表明,黃酮類化合物可替代一部分阿卡波糖,進而減少降糖藥物的用量。顯然,黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制作用與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān),其中B環(huán)C3’處的羥基和C環(huán)C3處的糖基的有無對α-淀粉酶的抑制作用十分重要。

2.2 3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制類型分析

酶抑制動力學(xué)的類型分為競爭型、非競爭型和混合型[14],通過Lineweaver-Burk圖可以確定3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制類型和動力學(xué)參數(shù),以更好地了解其抑制機制。3種黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的Lineweaver-Burk圖見圖3,動力學(xué)參數(shù)的計算結(jié)果見表2。

表2 3種黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的動力學(xué)參數(shù)

圖3 3種黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

由圖3 (a)可見,不同濃度的蘆丁對α-淀粉酶的抑制曲線都呈線性擬合并相交于第二象限。同時,由表2可知,隨著蘆丁濃度的增加,Vmax值降低(P<0.05),Km值增加(P< 0.05),表明蘆丁誘導(dǎo)了混合型抑制的產(chǎn)生。槲皮素對α-淀粉酶抑制類型亦為混合型抑制[圖3(b)],另一項研究報道,槲皮素是α-淀粉酶的競爭性抑制劑[8],這種相反的結(jié)論,可能源于實驗條件,特別是抑制劑濃度和酶純度的差異[15]。另外,由圖3 (c)可知,隨山奈酚濃度的增加,Vmax基本不變(P>0.05),但Km值隨著山奈酚濃度的增加而增加(P<0.05),這表明山奈酚以競爭方式抑制α-淀粉酶,意味著其可以與α-淀粉酶的活性位點結(jié)合,與底物競爭。

抑制常數(shù)(Ki)是評估α-淀粉酶與抑制劑結(jié)合能力的重要參數(shù)[3],1/Ki值越高表明抑制劑與α-淀粉酶的結(jié)合親和力越強。由表2可知,蘆丁的Kic值和Kiu值分別為(9.31±1.01 )mg/mL和(15.90±0.88)mg/mL,Kic/Kiu的值低于1,且Kic值低于Kiu值,表明在混合型抑制中競爭型抑制占主導(dǎo)地位,意味著蘆丁-α-淀粉酶復(fù)合物的結(jié)合能力高于蘆丁-α-淀粉酶-底物。對于槲皮素而言,也可以得到相同的結(jié)論。由表2可知,蘆丁的Kic值遠高于槲皮素,可能是其C環(huán)C3處的糖基增加了蘆丁進入α-淀粉酶活性腔時的空間位阻,阻礙了蘆丁與α-淀粉酶關(guān)鍵活性殘基的結(jié)合,顯著降低了蘆丁與α-淀粉酶的結(jié)合強度。山奈酚與α-淀粉酶的結(jié)合親和力[Kic值為(0.63±0.08) mg/mL]高于槲皮素[Kic值為(5.42±0.97)mg/mL],這是由于其B環(huán)上C3’的去羥基化形成了競爭型抑制,導(dǎo)致山奈酚與α-淀粉酶的結(jié)合更緊密。Lim等[16]也報道了類似的結(jié)果,木樨草素(Kic值為29.49 μmol·L-1)對α-淀粉酶的結(jié)合親和力高于3′,4′-二羥基黃酮醇(Kic值為399.92 μmol·L-1)。

2.3 3種黃酮類化合物對α-淀粉酶熒光淬滅光譜的影響

2.3.1淬滅類型分析

利用熒光淬滅光譜可以探究分子間的物理化學(xué)相互作用,例如碰撞淬滅、能量轉(zhuǎn)移和基態(tài)復(fù)合物的形成等[17]。3種黃酮類化合物與α-淀粉酶相互作用的二維熒光光譜及Stern-Volmer圖見圖4,熒光淬滅參數(shù)的計算結(jié)果見表3。

表3 不同溫度下3種黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的熒光淬滅參數(shù)和結(jié)合常數(shù)

圖4 3種黃酮類化合物與α-淀粉酶相互作用的熒光光譜及298 K下3種黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的Stern-Volmer圖

由圖4 (a)、(b)和(c)可知,當激發(fā)波長位于280 nm時,在342 nm處出現(xiàn)α-淀粉酶的最大發(fā)射峰。同時,最大發(fā)射峰的強度隨著黃酮類化合物濃度的增加而降低,且最大發(fā)射波長出現(xiàn)藍移。這表明,3種黃酮類化合物可以通過與α-淀粉酶結(jié)合來淬滅酶的固有熒光,并改變酶的構(gòu)象和疏水微環(huán)境。橡子仁多酚對α-葡萄糖苷酶的熒光發(fā)射光譜也顯示了類似的影響,即微弱的藍移表明α-葡萄糖苷酶熒光團周圍微環(huán)境的極性降低[18]。

由圖4 (d)可知,3種黃酮類化合物誘導(dǎo)的α-淀粉酶的Stern-Volmer曲線都隨著其濃度的增加呈現(xiàn)線性擬合,且3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的KSV值與溫度之間呈顯著負相關(guān)(P<0.05)(表3),這說明3種黃酮類化合物淬滅α-淀粉酶的熒光過程中存在單一的淬滅機制。由表3可知,3種黃酮類化合物的Kq值高于最大散射碰撞淬滅常數(shù)(2.0×1010L/mol·s)(P<0.05),這進一步表明淬滅機制是靜態(tài)淬滅而不是動態(tài)淬滅。此外,隨著溫度的升高,KSV值降低,表明較高的溫度不利于黃酮類化合物與α-淀粉酶結(jié)合,黃酮類化合物淬滅α-淀粉酶的過程為放熱反應(yīng)過程。

2.3.2結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點分析

為了進一步確定3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制機制,分別計算了3種溫度下3種黃酮類化合物對α-淀粉酶熒光淬滅的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n(表3)。根據(jù)Zheng等[19]的研究,Ka值代表抑制劑與酶的淬滅親和力,Ka值越大,抑制劑對酶的淬滅親和力越強,抑制能力便越高。從表3可以看出,槲皮素的Ka值低于山奈酚,但其IC50值高于山奈酚(表1),該結(jié)果與Zheng等[19]的研究結(jié)論一致;相反,與槲皮素和山奈酚相比,蘆丁的Ka值是最高的,但其對α-淀粉酶的抑制能力卻是最弱的。據(jù)Soares等[20]的研究,可能是蘆丁的C環(huán)上C3處的糖基可以與α-淀粉酶上更多的氨基酸殘基結(jié)合,從而具有更高的Ka值,但蘆丁與α-淀粉酶的活性位點上的關(guān)鍵氨基酸殘基的結(jié)合少于槲皮素和山奈酚,導(dǎo)致蘆丁對α-淀粉酶沒有表現(xiàn)出強的抑制能力。此外,在3個溫度下的n值都近似等于1,這表明3種黃酮類化合物和α-淀粉酶之間只有一個主要的結(jié)合位點[21]。

2.3.3熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合力分析

不同溫度下3種黃酮類化合物與α-淀粉酶相互作用的熱力學(xué)參數(shù)計算結(jié)果見表4。

表4 不同溫度下3種黃酮類化合物抑制α-淀粉酶的熱力學(xué)參數(shù)

由表4可知,在不同溫度下,蘆丁、槲皮素和山奈酚的ΔG值均為負值,表明了3種黃酮類化合物與α-淀粉酶的相互作用是一個自發(fā)的過程。根據(jù)Ross等[22]的研究,ΔH<0和ΔS<0表明黃酮類化合物和α-淀粉酶的主要結(jié)合力為氫鍵。ΔG和ΔS皆為負值表明結(jié)合反應(yīng)主要是由焓驅(qū)動的放熱反應(yīng)過程,這與KSV值隨溫度變化的結(jié)果一致。Yang等[12]也報道了類似的結(jié)果,即紫甘薯中的二酰化花青素和α-淀粉酶之間的結(jié)合反應(yīng)是放熱且由焓驅(qū)動的。

2.3.43種黃酮類化合物對α-淀粉酶構(gòu)象的影響

三維熒光光譜可用于進一步了解抑制劑與α-淀粉酶結(jié)合所引起的酶構(gòu)象的變化。3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的三維熒光光譜和熒光特征參數(shù)分別見圖5和表5。

表5 3種黃酮類化合物與α-淀粉酶相互作用的三維熒光特征參數(shù)

峰a為瑞利散射峰,峰1、2為主要熒光特征峰。

2.4 3種黃酮類化合物對α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜可用于探究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。有無黃酮類化合物時,α-淀粉酶的圓二色譜見圖6,二級結(jié)構(gòu)的變化見表6。

表6 3種黃酮類化合物對α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響

圖6 黃酮類化合物與α-淀粉酶相互作用的圓二色譜

由圖6可知,α-淀粉酶在210、229 nm波長處有兩個負峰。隨著黃酮類化合物的加入,兩個負峰的強度顯著降低,表明α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。由表6可知,蘆丁和山奈酚的加入降低了α-螺旋和無規(guī)則卷曲的比例,增加了β-轉(zhuǎn)角的比例。槲皮素的加入降低了α-螺旋和β-折疊的比例,增加了β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的比例。這表明3種黃酮類化合物誘導(dǎo)了α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)的變化,改變了酶的空間構(gòu)象,從而影響了底物與酶活性位點的結(jié)合。Dai等[28]也報道了類似的結(jié)果,即表沒食子兒茶素沒食子酸酯改變了α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)。

2.5 3種黃酮類化合物與α-淀粉酶相互作用的可視化分析

分子對接是一種可視化小分子與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合力、結(jié)合位點和結(jié)合能的新型研究手段。圖7是3種黃酮類化合物與α-淀粉酶的對接結(jié)果。

圖7 3種黃酮類化合物與α-淀粉酶的分子對接結(jié)果

由圖7可知,蘆丁、槲皮素和山奈酚均能與α-淀粉酶的活性位點1結(jié)合,該位點由氨基酸殘基Glu-233、Ile-235、Leu-162、Lys-200、Tyr-151、Lie-148、Val-163、Gly-306、His-201、Ala-198、His-305,Tyr-62、Asp-300、Leu-165、Asp-197、His-299、Arg-195和Trp-59構(gòu)建。據(jù)報道,Asp-197、Glu-233和Asp-300是α-淀粉酶上的關(guān)鍵氨基酸殘基,其在催化機制中起重要作用[29]。由此推斷,3種黃酮類化合物通過占據(jù)α-淀粉酶上的主要活性位點,競爭性地阻礙底物進入主要活性位點,進而導(dǎo)致酶的催化活性降低。同時,蘆丁、槲皮素和山奈酚的最低結(jié)合能分別為-5.37、-6.68、-7.06 kcal/mol,該順序與IC50值和Kic值的順序一致(表1和表2)。此外,由圖7 (b)和(c)可知,蘆丁和槲皮素也能插入到位點2和位點3中,最低結(jié)合能分別為-4.02、-4.28 kcal/mol,表明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶結(jié)合也表現(xiàn)出非競爭性行為。根據(jù)Dai等[30]的報道,小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合能越低,結(jié)合結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。蘆丁和槲皮素在競爭性模式下的結(jié)合能低于非競爭模式,說明兩者主要以競爭性的方式抑制α-淀粉酶,這與抑制動力學(xué)中抑制類型的結(jié)果一致。

圖7 (b)可知,蘆丁主要被10個氨基酸殘基包圍,結(jié)合力主要為氫鍵和疏水作用。蘆丁C環(huán)上C3處的糖基與Tyr-151、Val-163和Gly-306形成了3個氫鍵;與Tyr-151產(chǎn)生了1個π-烷基;與Leu-162和Lie-148產(chǎn)生了2個烷基。與槲皮素和山奈酚相比,蘆丁C環(huán)上C3處的糖基擴大了共軛體系,能夠結(jié)合活性位點周圍更多的氨基酸殘基,進而產(chǎn)生最強的結(jié)合親和力,即Ka值最高(表3)。

由圖7 (c)可知,槲皮素主要被7個氨基酸殘基包圍,包括Val-163、Trp-59、Leu-165、Tyr-62、Asp-197、Asp-300和His-305。Asp-300和Asp-197分別與B環(huán)上C 3’和C 4’處的羥基形成氫鍵;與Tyr-62形成π-π堆積。Yang等[9]的報道表明,抑制劑的抑制能力隨著分子骨架上氫原子的羥基化而增加,但在本研究中,B環(huán)上C3’處的羥基化削弱了槲皮素抑制α-淀粉酶的能力,可能是由于槲皮素只能與關(guān)鍵活性位點殘基Asp-197和Asp-300相互作用,進而造成其抑制α-淀粉酶的能力強于蘆丁(僅與Glu-233相互作用),弱于山奈酚(與Asp-197、Glu-233和Asp-300相互作用)。Liao等[31]也報道了相似的結(jié)果,他們發(fā)現(xiàn)芹菜素(無C3’羥基)對α-淀粉酶的抑制作用強于木樨草素(有C3’羥基)。

由圖7(d)可知,山奈酚和氨基酸殘基(Glu-233、Asp-300、His-299和Arg-195)之間形成4個氫鍵。此外,還可以觀察到2種疏水作用,包括Leu-165和Ala-198通過2個π-烷基與山奈酚相互作用;Trp-59、Tyr-62通過4個π-π堆積與山奈酚相互作用。研究證實,氫鍵會影響抑制劑的構(gòu)象,進而影響抑制劑與固有熒光殘基(Trp、Tyr和Phe)的相互作用[32-33]。由圖7 (c)和(d)可知,相對于槲皮素,山奈酚B環(huán)上C3’處的去羥基化阻礙了B環(huán)上氫鍵的形成(Asp-300和Asp-197),使得山奈酚B環(huán)的旋轉(zhuǎn)度大于槲皮素,進而增強了山奈酚B環(huán)的空間自由度。這種空間構(gòu)型更有利于山奈酚與熒光殘基(Trp-59和Tyr-62)產(chǎn)生π-π堆積,表現(xiàn)出更強的熒光淬滅效果,即Ka值大于槲皮素(表3)。

3 結(jié) 論

研究了3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制機制和構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明,三者均以濃度依賴性方式抑制α-淀粉酶的活性,對α-淀粉酶的抑制能力順序由大到小依次為山奈酚、槲皮素、蘆丁,其中,山奈酚競爭性地抑制α-淀粉酶,蘆丁和槲皮素則表現(xiàn)出混合抑制作用。3種黃酮類化合物對α-淀粉酶的抑制作用與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。C環(huán)上C3處的糖基化削弱了蘆丁對α-淀粉酶的抑制能力,增強了淬滅親和力;B環(huán)上C3’處的羥基化降低了槲皮素對α-淀粉酶的抑制能力和淬滅親和力。熒光淬滅結(jié)果表明,黃酮類化合物通過單一的靜態(tài)機制有效地淬滅α-淀粉酶的固有熒光。結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)進一步揭示了α-淀粉酶上存在單個高親和力結(jié)合位點,黃酮類化合物與α-淀粉酶的結(jié)合是自發(fā)的由焓驅(qū)動的放熱反應(yīng)。三維熒光光譜研究表明,3種黃酮類化合物誘導(dǎo)了α-淀粉酶構(gòu)象的變化,部分氨基酸殘基的疏水微環(huán)境受到二者結(jié)合的調(diào)控。圓二色譜分析結(jié)果表明,黃酮類化合物的加入改變了α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)。此外,通過分子對接觀察了3種黃酮類化合物與α-淀粉酶結(jié)合的可能構(gòu)象,表明黃酮類化合物B環(huán)上C3’的羥基和C環(huán)上C3處的糖基與結(jié)合穩(wěn)定性密切相關(guān)。研究結(jié)果旨在為黃酮類物質(zhì)的改性和預(yù)防高血糖功能食品的開發(fā)等提供一定的理論參考。