龔享文 崔開旺 劉春云 陳 謙 黃玉梅 劉 輝

贛州市第五人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 贛州市呼吸病防治研究所,江西省贛州市 341000

肺塵埃沉著病是由職業(yè)因素暴露,長(zhǎng)期吸入工作中的礦物粉塵引起的以慢性肺部炎癥和進(jìn)行性肺纖維化為主要病理特征的全身性疾病,簡(jiǎn)稱塵肺病[1]。當(dāng)前臨床治療塵肺病的藥物鮮少,且價(jià)格昂貴,不良反應(yīng)多,患者難以承受。而中醫(yī)藥在治療塵肺病中具有良好的療效,在延緩塵肺病患者病情進(jìn)展、提高生活質(zhì)量和減少并發(fā)癥方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)肺溫金湯是治療塵肺病的經(jīng)驗(yàn)方,由黨參、陳皮、半夏、白術(shù)、茯苓、砂仁、木香、甘草八味中藥組成。該方具有補(bǔ)肺健脾、理氣化痰的功效,能夠緩解塵肺病患者呼吸急促,改善肢體乏力等癥狀。因此,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,篩選和挖掘補(bǔ)肺溫金湯防治肺塵病的關(guān)鍵靶標(biāo)和富集通路,并通過(guò)分子對(duì)接方法對(duì)關(guān)鍵因子進(jìn)行驗(yàn)證,以期揭示補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病的潛在機(jī)制,為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 補(bǔ)肺溫金湯有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)中逐個(gè)搜索補(bǔ)肺溫金湯有效成分。設(shè)置生物利用度(Oral bioavailability,OB)>30%,類藥性(Drug-likeness,DL)>0.18。由于甘草成分較多,加用ADME參數(shù):脂水分配系數(shù)(AlogP)<5、H鍵供體數(shù)量(Hdon)<5、H鍵受體數(shù)量(Hacc)<5、腸上皮通透性(Caco-2)≥-0.40。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)補(bǔ)肺溫金湯各個(gè)藥物的成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行靶基因Symbol校正。在TCMSP中符合篩選標(biāo)準(zhǔn)但未檢索到靶蛋白的中藥有效成分,利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction平臺(tái),預(yù)測(cè)出其活性成分的潛在靶點(diǎn)。

1.2 補(bǔ)肺溫金湯與塵肺病相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及補(bǔ)肺溫金湯與塵肺病共同靶點(diǎn) 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、Pharm GKB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得塵肺病靶點(diǎn)信息。使用Venny在線網(wǎng)站繪制韋恩圖,得到補(bǔ)肺溫金湯與塵肺病的共同靶點(diǎn),作為補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在蛋白互作平臺(tái)STRING對(duì)應(yīng)的程序接口輸入補(bǔ)肺溫金湯與塵肺病的共同預(yù)測(cè)靶點(diǎn),設(shè)置物種為“Homo sapiens”,繪制蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖,最低相互作用評(píng)分設(shè)置為“medium confidence(0.400)”,從而得到PPI蛋白互作關(guān)系圖,同時(shí)使用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化。

1.4 補(bǔ)肺溫金湯—成分—共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建“補(bǔ)肺溫金湯—化合物—共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化分析,得到各節(jié)點(diǎn)的degree值。

1.5 富集分析 將補(bǔ)肺溫金湯成分靶點(diǎn)與塵肺病共同靶點(diǎn)利用R語(yǔ)言進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。以P<0.01為篩選條件,對(duì)排名前20的信號(hào)通路以氣泡圖形式展示。為進(jìn)一步從信號(hào)通路角度分析補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病可能的調(diào)控機(jī)制,以P<0.01、富集基因數(shù)≥6為篩選條件,并排除與塵肺病物關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路,在此基礎(chǔ)上利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“有效成分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接 對(duì)補(bǔ)肺溫金湯的成分與靶點(diǎn)進(jìn)行條件篩選,將最可能發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分與其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)能夠完全擬合-LogQ 值最大的那條通路所對(duì)應(yīng)的共同靶點(diǎn),載蛋白的3D結(jié)構(gòu)在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得,同時(shí)化合物的2D結(jié)構(gòu)信息在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。再使用Autodock vina軟件對(duì)這些成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,并使用Pymol軟件進(jìn)行可視化作圖。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)肺溫金湯活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 共得到補(bǔ)肺溫金湯有效成分89個(gè),藥物潛在作用靶點(diǎn)253個(gè),按OB值從大到小排列,前20個(gè)活性成分見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)肺溫金湯活性成分

2.2 塵肺病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 共獲得塵肺病相關(guān)基因191個(gè)。利用Venny圖獲得補(bǔ)肺溫金湯藥物靶點(diǎn)和塵肺病靶點(diǎn)共24個(gè)共同預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.3 補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白互作信息。使用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化(見(jiàn)圖1),由圖1可知補(bǔ)肺溫金湯—疾病核心靶點(diǎn)按連接節(jié)點(diǎn)數(shù)由多到少依次為:IL6、TNF、PTGS2、JUN、ICAM1、CASP3、IL10、IFNG、IL2、IL4等。

圖1 蛋白互作圖

2.4 補(bǔ)肺溫金湯—成分—共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 擁有交互基因的有效成分共有51個(gè),使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建補(bǔ)肺溫金湯—成分—共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析圖(見(jiàn)圖2)。根據(jù)degree值,在網(wǎng)絡(luò)中擁有最多交互基因的有效成分主要有:MOL000006(luteolin)、MOL000449(Stigmasterol)、MOL004932(glycyrrhizic acid)、MOL000358(beta-sitosterol)、MOL003896(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)等。

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析 24個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析共1 260條目,其中生物過(guò)程(Biological process,BP)1 218條目,選出前20條(圖3列出前20條,P<0.05),主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、活性氧生物合成過(guò)程、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)抗生素的反應(yīng)、活性氧反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖等過(guò)程。

KEGG通路共98條目,以P<0.01為篩選條件,列出前20條KEGG通路,繪制氣泡圖,見(jiàn)圖4。前10條為:C-type lectin receptor signaling pathway(C型凝集素受體信號(hào)通路)、IL-17 signaling pathway(IL-17信號(hào)通路)、Inflammatory bowel disease(炎癥性腸病)、T cell receptor signaling pathway(T細(xì)胞受體信號(hào)通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1信號(hào)通路)、TNF signaling pathway(TNF信號(hào)通路)、Tuberculosis(肺結(jié)核)、Allograft rejection(同種異體移植排斥反應(yīng))、Malaria(瘧疾)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路)。

圖4 KEGG分析圖

2.6 有效成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖 根據(jù)補(bǔ)肺溫金湯有效成分、共同靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的聯(lián)系,構(gòu)建有效成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖5。luteolin為與網(wǎng)絡(luò)中擁有最多交互通路的有效成分,與成分—共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果相符。

圖5 補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病的有效成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果 在2.4及2.6篩選出來(lái)的核心活性成分luteolin與2.3中的前兩個(gè)核心靶點(diǎn)IL-6、TNF輸入Autodock vina軟件中進(jìn)行半柔性分子對(duì)接。用Pymol軟件進(jìn)行可視化。對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表2、圖6。木犀草素成分與IL-6、TNF對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為-30.56、-31.39kcal/mol,木犀草素與核心靶點(diǎn)對(duì)接較穩(wěn)定。

圖6 Luteolin與IL-6、TNF分子對(duì)接圖

表2 對(duì)接分?jǐn)?shù)(kcal/mol)

3 討論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)塵肺病咳、痰、喘、胸悶痛等一般臨床癥狀,可將塵肺病歸入中醫(yī)學(xué)“肺痹”“肺痿”“肺脹”等范疇[2]。患者受金石之邪,邪氣入肺,留滯于內(nèi),阻滯氣機(jī),肺宣降失常,日久致氣、痰、濕瘀滯凝積成結(jié)節(jié),損傷肺絡(luò),最終導(dǎo)致機(jī)體陰陽(yáng)失衡,臟腑功能受損,病位在主要肺,病久影響脾、腎。補(bǔ)肺溫金湯組方中黨參、茯苓、白術(shù)補(bǔ)脾肺氣,可增強(qiáng)機(jī)體自我修復(fù)能力;陳皮健脾燥濕、理氣化痰,為治痰要藥;半夏燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié),與陳皮、茯苓合用,可增強(qiáng)健脾化痰之效;砂仁化濕醒脾、溫中行氣,為醒脾調(diào)胃要藥;木香行氣調(diào)中、通暢氣機(jī);炙甘草甘溫,健脾補(bǔ)氣、調(diào)和諸藥;諸藥合用可達(dá)補(bǔ)肺健脾、理氣化痰之效,同時(shí)寓有培土生金之意。

如本研究所示,補(bǔ)肺溫金湯治療塵肺病的核心成分有89個(gè),其中木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)被確定補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病的關(guān)鍵有效成分。已有研究表明,木犀草素、豆甾醇、甘草酸、β-谷甾醇通過(guò)調(diào)節(jié)多種因子和信號(hào)通路(如Fn-EDA、TGF-β1、TGF-β1/Smads、p38MAPK信號(hào)通路),促進(jìn)肺組織自愈、平衡肺組織氧化還原反應(yīng)、抑制氣道局部炎癥、減少膠原沉積,抑制由博來(lái)霉素或二氧化硅引起的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化,抑制細(xì)胞外基質(zhì)重塑,改善肺功能,從而達(dá)到改善肺纖維化的作用[3-4]。

GO富集分析和KEGG富集分析顯示補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病涉及C型凝集素受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等多個(gè)通路。C型凝集素樣受體(CTLR)是一種基于免疫受體酪氨酸基序的受體,通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞因子激活,調(diào)節(jié)促進(jìn)纖維化[5]。IL-17可通過(guò)激活NF-κB、JNK等多條信號(hào)通路,直接或間接地參與調(diào)控多種炎癥反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)性疾病[6]。AGE及其受體 (RAGE) 已被證明與肺泡穩(wěn)態(tài)以及肺纖維化有關(guān)[7]。肺纖維化中AGE/RAGEs 比例升高導(dǎo)致肺持續(xù)纖維化以及肺上皮間質(zhì)修復(fù)功能下降[8]。HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路對(duì)免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等病理生理過(guò)程具有重要的調(diào)控作用[9-10]。以上表明,補(bǔ)肺溫金湯通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)等信通路,發(fā)揮防治塵肺病的作用。

白細(xì)胞介素(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素G/H合酶 2(PTGS2)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)、胱天蛋白酶1(CASP3)、白介素10(IL-10)、干擾素γ(IFNG)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)是PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出來(lái)的關(guān)鍵基因。分子對(duì)接結(jié)果表明,核心成分木犀草素與IL-6、TNF、PTGS2、JUN、ICAM1對(duì)接良好,驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)補(bǔ)肺溫金湯防治塵肺病預(yù)測(cè)機(jī)制的準(zhǔn)確性。近年研究發(fā)現(xiàn),在塵肺病發(fā)病過(guò)程中,巨噬細(xì)胞會(huì)激活I(lǐng)L-6、TNF等炎癥因子,誘發(fā)肺纖維化炎癥反應(yīng)[11]。IL-6是M2型巨噬細(xì)胞選擇性激活的重要因子,可調(diào)控巨噬細(xì)胞向促炎型細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化[12]。TNF信號(hào)通路與肺纖維化發(fā)展過(guò)程密切相關(guān),已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,在二氧化硅誘發(fā)的肺纖維化過(guò)程中,血清中TGF-β、TNF-α、FGF含量隨著二氧化硅濃度的增加而增加,表明TGF-β、TNF-α、FGF是治療肺纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)[13]。JUN是IL-17信號(hào)通路的下游基因,協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、自我更新、新陳代謝和存活等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖至關(guān)重要的基因的轉(zhuǎn)錄,參與炎癥通路的激活。同時(shí),JUN可阻斷白細(xì)胞(CD45)、上皮細(xì)胞(CK7)和內(nèi)皮細(xì)胞(CD31)的表達(dá),增加促纖維化成纖維細(xì)胞的吞噬作用和消除對(duì)適應(yīng)性免疫的抑制作用[14]。IL-10的抑制作用主要通過(guò)抑制IFN、TNF、IL-1、IL-2、IL-6和粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、趨化因子等炎性細(xì)胞因子的分泌來(lái)發(fā)揮抗炎作用[15]。近年來(lái)的研究表明,IL-10在組織纖維化的作用已逐漸被知曉,如IL-10通過(guò)抑制體內(nèi)和體外肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1抑制肺纖維化的發(fā)展[16]。

綜上所述,本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度闡釋了補(bǔ)肺溫金湯多成分、多靶點(diǎn)和多通路的調(diào)控機(jī)制。組方可能通過(guò)木犀草素、豆甾醇、甘草酸、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等關(guān)鍵成分,作用于IL6、TNF、PTGS2、JUN、IL10等多個(gè)靶點(diǎn),調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過(guò)程,干預(yù)C型凝集素受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等多個(gè)通路,改善塵肺病的肺纖維化損傷。