葉秀芬?俞容?周益琴

摘要：目的 為了確定鮑曼不動(dòng)桿菌除PmrCAB以外的多黏菌素耐藥機(jī)制。方法 收集2020年金華市人民醫(yī)院住院患者痰液標(biāo)本分離的3株鮑曼不動(dòng)桿菌（AB1、AB2和AB3）。微量肉湯稀釋法測(cè)定3株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南、美羅培南和多黏菌素的最低抑菌濃度。通過(guò)PCR明確菌株是否攜帶eptA并進(jìn)一步對(duì)操縱子pmrCAB進(jìn)行分析，明確是否存在氨基酸突變。全基因組測(cè)序分析菌株的ST型、耐藥基因以及eptA的上游結(jié)構(gòu)。使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)多黏菌素耐藥相關(guān)基因pmrB以及eptA基因的表達(dá)量。GraphPad Prism 8.0用于數(shù)據(jù)分析。結(jié)果 3株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素耐藥，MIC=16 μg/mL。根據(jù)Pasteur分型，它們都屬于ST2；根據(jù)Oxford分析，AB1和AB3屬于ST208，AB2屬于ST1806。3株鮑曼不動(dòng)桿菌都攜帶blaOXA-23碳青霉烯酶耐藥基因，但都不存在PmrCAB氨基酸突變。表達(dá)量分析顯示3株菌存在eptA過(guò)表達(dá)（P<0.01）。ISAba1的插入位點(diǎn)分別在eptA起始密碼子之前第13和18個(gè)堿基處。然而，pmrCAB表達(dá)量改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 ISAba1插入介導(dǎo)的eptA的過(guò)表達(dá)可能是新的鮑曼不動(dòng)桿菌多黏菌素耐藥機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：鮑曼不動(dòng)桿菌；耐藥；多黏菌素；eptA

中圖分類(lèi)號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on polymyxin resistance mediated by eptA overexpression in Acinetobacter baumannii clinical isolates

Ye Xiu-fen， Yu Rong， and Zhou Yi-qin

（Department of Clinical Laboratory， Jinhua Peoples Hospital， Jinhua 321000）

Abstract Objective To determine the polymyxin resistance mechanism in Acinetobacter baumannii （A. baumannii） other than PmrCAB. Methods Three A. baumannii clinical strains collected from sputum were selected in 2020. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of imipenem， meropenem and colistin were tested by the broth micro-dilution method. PCR was conducted to test whether the strains carried eptA and further analyzed the pmrCAB mutation.? The ST type， drug resistance gene， and the upstream structure of eptA of the strain were analyzed using whole-genome sequencing. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of polymyxin resistance-related genes pmrB and eptA. Experimental data were analyzed using GraphPad Prism 8.0. Results Three A. baumannii strains were resistant to polymyxin， and MICs were all 16 μg/mL. According to the Pasteur type， they all belonged to ST2; according to Oxford type， AB1 and AB3 belonged to ST208， and AB2 belonged to ST1806. Three strains all carried the blaOXA-23 carbapenemase resistance gene， but none of them had PmrCAB amino acid mutations. Expression analysis showed that the three strains had overexpression of eptA （P<0.01）. The insertion sites of ISAba1 were 13 and 18 bases before the eptA start codon， respectively. However， there was no statistically significant difference in the expression of pmrCAB （P>0.05）. Conclusion The overexpression of eptA mediated by the insertion of ISAba1 may be one of the new polymyxin resistance mechanisms in A. baumannii.

Key words Acinetobacter baumannii; Resistance; Polymyxin; eptA

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）可引起各種醫(yī)院相關(guān)感染。在過(guò)去的幾十年中，由于大多數(shù)可用抗菌藥物的耐藥菌株出現(xiàn)及擴(kuò)散已經(jīng)促使臨床醫(yī)生轉(zhuǎn)向多黏菌素作為治療的最終方案[1]。由于多黏菌素的使用量增加，導(dǎo)致其耐藥性逐漸增加，特別是碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistant A. baumannii， CRAB）[2]。因此，明確是否有除常見(jiàn)的PmrCAB氨基酸突變介導(dǎo)的多黏菌素耐藥外的新機(jī)制對(duì)臨床用藥和CRAB治療至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3株耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）（AB1，AB2和AB3）分離自2020年金華市人民醫(yī)院住院患者痰液標(biāo)本，質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922；亞胺培南（1.0 g，國(guó)藥準(zhǔn)字H20084019，大連美侖生物技術(shù)有限公司）、美羅培南（0.5 g，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093466，上海上藥新亞藥業(yè)有限公司）；多黏菌素（1.0 g，美國(guó)Sigma公司）；MH肉湯（英國(guó)Oxoid公司）；比濁儀（法國(guó)Merieux公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 碳青霉烯類(lèi)藥物和多黏菌素敏感性試驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定3株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南、美羅培南和多黏菌素的最低抑菌濃度。藥敏結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI 2020標(biāo)準(zhǔn)判讀。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 DNA擴(kuò)增檢測(cè)耐藥相關(guān)基因突變情況

用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。對(duì)eptA基因進(jìn)行PCR，引物序列如表1所示[3-4]，主要步驟如下：配置PCR反應(yīng)體系（10×PCR Buffer，Mg2+，dNTP Mixture，上游引物，下游引物，rTaq酶，無(wú)菌雙蒸水，DNA模板）。PCR反應(yīng)過(guò)程如下：預(yù)變性（94℃，5 min），變性（94℃，30 s），退火（55℃，30 s），延伸（根據(jù)引物長(zhǎng)度，1000 bp/min），最后延伸（72℃，7 min），同時(shí)設(shè)置1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照、一個(gè)陰性對(duì)照以及不加DNA的空白對(duì)照。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及觀察。選取與目的大小片段相符的陽(yáng)性產(chǎn)物送上海華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果再在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析。

1.4 全基因組測(cè)序以及eptA基因上游結(jié)構(gòu)分析

對(duì)3株CRAB進(jìn)行全基因組測(cè)序。首先，使用試劑盒提取細(xì)菌總DNA后送公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)使用CLC Genomics Workbench 10.1.1對(duì)序列進(jìn)行拼接，并通過(guò)序列比對(duì)分析eptA基因的上游結(jié)構(gòu)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)多黏菌素耐藥相關(guān)基因表達(dá)量的變化

使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)多黏菌素耐藥相關(guān)基因pmrB以及eptA基因的表達(dá)量。所用引物詳見(jiàn)表2[5]。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法，菌株ATCC19606為參考菌株，rpoB為內(nèi)參基因。以eptA基因?yàn)槔缦滤荆害t（試驗(yàn)樣本）=Ct（試驗(yàn)樣本eptA基因）-Ct（試驗(yàn)樣本rpoB基因），ΔCt（校準(zhǔn)樣本）=Ct（ATCC19606 eptA基因）-Ct（ATCC19606 rpoB基因），-ΔΔCt=ΔCt（校準(zhǔn)樣本）-ΔCt（試驗(yàn)樣本），2-ΔΔCt即為eptA的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

GraphPad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖片繪制，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

AB1，AB2，AB3對(duì)亞胺培南和美羅培南均耐藥，MIC均≥64 μg/mL，且均對(duì)多黏菌素耐藥，MIC=16 μg/mL，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 ST型、耐藥基因以及常見(jiàn)多黏菌素耐藥基因突變情況

通過(guò)分析3株菌的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)這3株菌都攜帶blaOXA-23碳青霉烯酶耐藥基因，此外還攜帶β-內(nèi)酰胺類(lèi)（blaADC-52，blaADC-176和blaOXA-51）、氨基糖苷類(lèi)（armA，aph（3）-VI）以及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)[msr（E），mph（E）]耐藥基因。根據(jù)Pasteur分型，它們都屬于ST2；根據(jù)Oxford分析，AB1和AB3屬于ST208，AB2屬于ST1806。此外，與多黏菌素耐藥相關(guān)的基因pmrA、pmrB和pmrC沒(méi)有氨基酸突變（表4）。

2.3 eptA基因上游結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)全基因組測(cè)序進(jìn)一步分析eptA基因上游結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：AB1和AB2在上游13個(gè)堿基處有一個(gè)ISAba1，而AB3在上游18個(gè)堿基處有一個(gè)ISAba1。其余的結(jié)構(gòu)相同。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 多黏菌素耐藥相關(guān)基因表達(dá)量變化

進(jìn)一步對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌多黏菌素耐藥相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，eptA的表達(dá)量可增加4～7倍，差異具有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。然而，染色體上的其他多黏菌素耐藥相關(guān)基因pmrB和pmrC的表達(dá)量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

3討論

CRAB對(duì)多黏菌素的耐藥率越來(lái)越高，已成為許多臨床醫(yī)生面臨的主要挑戰(zhàn)[6-7]。研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素的耐藥性主要依賴于LOS促修飾酶，從而使抗菌藥物與細(xì)菌初次接觸后，細(xì)菌表面的凈負(fù)電荷減少，雙組分系統(tǒng)PmrAB的突變激活是主要的多黏菌素耐藥機(jī)制，其可導(dǎo)致磷酸乙醇胺（pEtN）轉(zhuǎn)移酶PmrC過(guò)表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致多黏菌素耐藥[8-9]。PmrCAB介導(dǎo)的多黏菌素耐藥機(jī)制已經(jīng)完全明確，而是否存在新的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

最近有研究發(fā)現(xiàn)在編碼H-NS相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基因中插入ISAba125元件有助于鮑曼不動(dòng)桿菌臨床菌株產(chǎn)生高水平多黏菌素耐藥性[10]。這種插入觸發(fā)了遠(yuǎn)端基因的表達(dá)，該基因?yàn)閑ptA，其產(chǎn)物與PmrC具有93%的同源性，且與PmrC一樣可介導(dǎo)pEtN轉(zhuǎn)移酶活性[11]。因此，研究eptA基因是否可以介導(dǎo)多黏菌素耐藥意義重大。

eptA基因在鮑曼不動(dòng)桿菌分離株中很常見(jiàn)。在法國(guó)NRC-AR分析的32株黏菌素敏感菌株中，27株（84%）分離株eptA陽(yáng)性，但它們都沒(méi)有攜帶基因上游的ISAba1序列[12-13]。Lesho等[10]在116株鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中檢測(cè)到20%菌株除pmrC外還存在eptA同源物。本研究中，發(fā)現(xiàn)3株多黏菌素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌存在pmrC同系物eptA過(guò)表達(dá)，這可能是由于上游插入ISAba1導(dǎo)致。ISAba1是一種在鮑曼不動(dòng)桿菌基因組中普遍存在的遺傳元件[14-15]，它可以為下游基因提供一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子，進(jìn)而使下游基因表達(dá)量增加，從而導(dǎo)致多黏菌素耐藥，對(duì)eptA表達(dá)量的分析結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。在研究的分離株中，通過(guò)不同的遺傳事件，ISAba1的插入發(fā)生在eptA上游的不同位置（13和18 bp）。然而，eptA的表達(dá)水平與ISAba1和eptA轉(zhuǎn)錄起始之間的距離無(wú)關(guān)。在此次研究菌株中，在eptA上游插入ISAba1構(gòu)成了一種更直接的eptA激活方式，其導(dǎo)致的多黏菌素MIC可以直接達(dá)到耐藥水平。由于鮑曼不動(dòng)桿菌中ISAba1和eptA基因相當(dāng)普遍，因此在反復(fù)進(jìn)行多黏菌素治療的壓力下，由隨機(jī)插入事件引起多黏菌素耐藥的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生。

總之，本研究表明CRAB對(duì)多黏菌素耐藥機(jī)制的復(fù)雜性和多樣性，提出了ISAba1和eptA共同作用下介導(dǎo)的多黏菌素耐藥機(jī)制，為進(jìn)一步研究CRAB對(duì)多黏菌素耐藥提供依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

Carrasco L D M， Dabul A N G， Boralli C， et al. Polymyxin resistance among XDR ST1 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clone expanding in a teaching hospital[J]. Front Microbiol， 2021， 12： 622704.

Trebosc V， Gartenmann S， Totzl M， et al. Dissecting colistin resistance mechanisms in extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates[J]. mBio， 2019， 10（4）： e01083-19.

Xu F， Hinenoya A， Zeng X， et al. Critical role of 3'-downstream region of pmrB in polymyxin resistance in Escherichia coli BL21（DE3）[J]. Microorganisms， 2021， 9（3）： 655.

Ilsan N A， Lee Y J， Kuo S C， et al. Antimicrobial resistance mechanisms and virulence of colistin-and carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated from a teaching hospital in Taiwan[J]. Microorganisms， 2021， 9（6）：1295.

Kim M， Park J， Park W. Genomic and phenotypic analyses of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii NCCP 16007 isolated from a patient with a urinary tract infection[J]. Virulence 2021， 12（1）： 150-164.

Yoon E J， Kim H S， Woo H， et al. Trajectory of genetic alterations associated with colistin resistance in Acinetobacter baumannii during an in-hospital outbreak of infection[J]. J Antimicrob Chemother， 2021， 77（1）： 69-73.

Piperaki E T， Tzouvelekis L S， Miriagou V， et al. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii： In pursuit of an effective treatment[J]. Clin Microbiol Infect， 2019， 25（8）：951-957.

Nodari C S， Fuchs S A， Xanthopoulou K， et al. pmrCAB recombination events among colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates belonging to international clone 7[J]. mSphere， 2021： e0074621.

Lima W G， Alves M C， Cruz W S， et al. Chromosomally encoded and plasmid-mediated polymyxins resistance in Acinetobacter baumannii： A huge public health threat[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2018， 37（6）：1009-1019.

Lesho E， Yoon E J， McGann P， et al. Emergence of colistin-resistance in extremely drug-resistant Acinetobacter baumannii containing a novel pmrCAB operon during colistin therapy of wound infections[J]. J Infect Dis， 2013， 208（7）： 1142-1151.

Deveson L D， Crane B， Wright A， et al. Emergence of high-level colistin resistance in an Acinetobacter baumannii clinical isolate mediated by inactivation of the global regulator H-NS[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2018， 62（7）： e02442-17.

Gerson S， Lucassen K， Wille J， et al. Diversity of amino acid substitutions in PmrCAB associated with colistin resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J]. Int J Antimicrob Agents， 2020， 55（3）： 105862.

Gerson S， Betts JW， Luca?en K， et al. Investigation of novel pmrB and eptA mutations in isogenic Acinetobacter baumannii isolates associated with colistin resistance and increased virulence In vivo[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2019， 63（3）： e01586-18.

Agoba E E， Govinden U， Peer A K C， et al. ISAba1 regulated OXA-23 carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii strains in durban， South Africa[J]. Microb Drug Resis， 2018， 24（9）： 1289-1295.

付啟云， 鄭紹同， 連建春， 等. 耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株耐藥元件基因比較研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2019， 44（5）： 595-599.