饒劍花 龍國(guó)斌 曾韻夏

廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 清遠(yuǎn) 511500

因上呼吸道感染、肺炎、支氣管炎等疾病引起的咳嗽患兒占我院兒科收治患兒數(shù)60%以上，兒咳一號(hào)方是我院多年應(yīng)用于兒科治療肺熱咳嗽的協(xié)定方，其組成主要有桑葉、菊花、連翹、蟬蛻、桔梗、僵蠶、苦杏仁、甜葉菊等，針對(duì)風(fēng)熱咳嗽具有良好的療效。中醫(yī)及現(xiàn)代藥理研究也顯示，桑葉[1]、菊花[2]、連翹[3]、蟬蛻[4]等具有疏散風(fēng)熱、清熱等功效，常用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛等?；谥兴帨珓┘逯?、口感等原因，同時(shí)兒童專(zhuān)科劑型匱乏，依據(jù)《關(guān)于保障兒童用藥的若干意見(jiàn)》[5]《關(guān)于深化藥品審評(píng)審批改革進(jìn)一步鼓勵(lì)創(chuàng)新的意見(jiàn)》[6]等文件精神都鼓勵(lì)開(kāi)發(fā)兒童用藥。由于顆粒劑具有體積小，服用、存儲(chǔ)及運(yùn)輸方便，具有“三效” “三小”“五便”優(yōu)點(diǎn)[7-9]，同時(shí)又擁有湯劑作用迅速的特點(diǎn)，故將兒咳一號(hào)方開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑(顆粒劑)以滿(mǎn)足臨床和患兒需求。現(xiàn)代中藥顆粒制藥過(guò)程包括提取、濃縮、干燥、制粒等多個(gè)工藝步驟[10]，所以本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)復(fù)方兒咳顆粒劑進(jìn)行提取和制備工藝研究，發(fā)展院內(nèi)制劑。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑 桑葉、菊花、連翹、蘆根、蟬蛻、桔梗、僵蠶、苦杏仁、浙貝母、甘草、甜葉菊均購(gòu)自廣州市志寧藥業(yè)有限公司。連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司、中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)：MUST-20060811，含量為99.48%)；甲醇、乙醇均為分析純；乙腈(色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司)

1.2 主要儀器 Waters 2695-2489高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；依利特色譜柱SuperSil E2913576 (4.6 mm×150 mm，5μm)；METILER TOLEDO XS205 十萬(wàn)分之一電子分析天平；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋(北京永光明)；DHG-9023A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏科學(xué)儀器公司)；SP-100A超聲波清洗器(東莞潔康超聲儀器公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取工藝研究

2.1.1 實(shí)驗(yàn)因素水平 用正交試驗(yàn)法優(yōu)選兒咳一號(hào)方的提取工藝，以連翹苷含量和浸膏得率為指標(biāo)，選定煎煮時(shí)間(A)、加水量(B)、煎煮次數(shù)(C)3因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 水煎煮因素水平表

2.1.2 浸膏得率測(cè)定 按處方比例稱(chēng)取處方藥材按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)進(jìn)行水提，將各次水煎液分別混合，濃縮，水浴蒸干溶劑，冷卻后得各組干浸膏。稱(chēng)重，計(jì)算收膏率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水煎煮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 連翹苷含量測(cè)定

2.1.3.1 色譜條件[11]色譜柱：SuperSil E2913576 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(25∶75)溶液；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取連翹苷對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加乙腈定容，搖勻。

2.1.3.3 供試品溶液的制備 按2.1.2項(xiàng)下方法操作得到浸膏粉末。精密稱(chēng)取浸膏粉末適量置于25 mL容量瓶中，加乙腈適量，溶液超聲30 min，冷卻，加乙腈定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3.4 含量測(cè)定 取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，液相圖譜結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1 連翹苷對(duì)照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖(A2B3C2工藝)

圖3 陰性對(duì)照品HPLC圖(A2B3C2工藝)

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，連翹苷含量和浸膏得率結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表3 方差分析

根據(jù)上述表中結(jié)果，由連翹苷含量和得膏率這二項(xiàng)指標(biāo)可以看出，三因素的影響大小依次為A>C>B，A因素影響具有顯著性差異(P﹤0.05)。C因素在連翹苷含量方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B因素在得膏率方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故優(yōu)選提取工藝為：A2B3C2，即加10倍水，提取2次，每次45min。

2.1.5 優(yōu)選提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選工藝重復(fù)驗(yàn)證3次，測(cè)得連翹苷含量為0.161%、0.166%、0.159%，RSD=2.22%(n=3)；得膏率為26.59%、27.11%、26.38%，RSD=1.40%(n=3)；證明優(yōu)選工藝可靠。

2.2 顆粒劑成型工藝研究

2.2.1 輔料的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用濕法制粒，參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-16]，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇輔料。單因素考察乳糖、淀粉和糊精，稱(chēng)取浸膏粉與輔料以1∶1混勻，以80%乙醇為潤(rùn)濕劑制粒。60 ℃干燥24 h，以成型率和吸濕性為考察指標(biāo)選擇輔料。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 輔料的考察結(jié)果

結(jié)果表明，糊精吸濕率低、成型性較好、價(jià)格低廉，故選用糊精為輔料。

2.2.2 顆粒成型工藝優(yōu)選 采用L9(34)正交試驗(yàn)，以成型率、24 h吸濕百分率為指標(biāo)，選定藥粉與輔料的比例、乙醇濃度和乙醇用量3因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平。見(jiàn)表5。

表5 成型工藝因素水平表

2.2.3 制備方法 取適量藥粉，按正交試驗(yàn)加入輔料，并制成軟材。軟材過(guò)14目篩，60 ℃干燥24 h，用1號(hào)篩和5號(hào)篩雙篩分取，即得兒咳顆粒。

2.2.4 成型率 參照《中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)》[17-18]四部制劑中顆粒劑粒度測(cè)定法(通則0982第二法雙篩分法)測(cè)定，即不能通過(guò)1號(hào)篩與能通過(guò)5號(hào)篩的總和不得超過(guò)15%。成型率=通過(guò)1號(hào)篩而不能5號(hào)篩的顆粒質(zhì)量/樣品顆粒質(zhì)量×100%。見(jiàn)表6。

表6 顆粒成型工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 吸濕百分率 精密稱(chēng)取適量顆粒，置已恒重的稱(chēng)量瓶中(顆粒厚度約2 mm)，將稱(chēng)量瓶敞開(kāi)放入盛有氯化鈉過(guò)飽和液的干燥器中，靜置24 h后，再次稱(chēng)重。顆粒的吸濕百分率為兩次稱(chēng)量之差所占顆粒質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按L9(34)正交設(shè)試驗(yàn)，顆粒的成型率、24 h吸濕百分率，結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。

表7 方差分析

根據(jù)直觀分析和方差分析結(jié)果，顆粒的最佳成型工藝為A2B3C2，即藥粉和糊精為1∶1，加25%藥粉量的90%乙醇制成軟材，濕法制粒，即得兒咳顆粒。

2.2.7 正交驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)成型工藝A2B3C2進(jìn)行3次正交驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果為成型率90.12%、89.89%、90.06%，RSD=0.13%(n=3)；吸濕百分率為8.1%、8.21%、8.16%，RSD=0.67%(n=3)。說(shuō)明重現(xiàn)性良好，確定為最佳工藝。

3 討論與小結(jié)

3.1 提取工藝選擇 本文建立了高效液相色譜法測(cè)定兒咳顆粒中連翹苷的含量和浸膏得率來(lái)篩選提取工藝，結(jié)果提示加10倍水，煎煮2次，每次45 min，連翹苷的含量和浸膏得率達(dá)到較優(yōu)水平。目前提取連翹中不同部位的連翹苷較常用的溶劑是乙醇、甲醇、正丁醇等，本實(shí)驗(yàn)從標(biāo)準(zhǔn)湯劑出發(fā)，結(jié)合臨床實(shí)際，故采用水提。研究表明煎煮時(shí)間對(duì)浸膏率有顯著影響，煎煮時(shí)間為45 min較優(yōu)，與臨床實(shí)際的煎煮時(shí)間有差異，考慮可能是該方中未有主要成分為揮發(fā)油的藥材，后續(xù)顆粒劑用于臨床時(shí)將考察其與水煎液的臨床療效差異。

3.2 顆粒成型工藝選擇 在對(duì)輔料篩選表明糊精和乳糖的成型率較可溶性淀粉的高，但糊精的抗吸濕性更好，同時(shí)考慮成本，故選擇了糊精。本研究以濕法制粒初步探索了顆粒成型工藝，其工藝基本可行。今后將嘗試更多制粒方法(如噴霧干燥法)等進(jìn)行對(duì)比，為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和顆粒開(kāi)發(fā)研究提供參考依據(jù)。

3.3 液相條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定連翹苷含量的液相條件為乙腈-水(25∶75)溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm，與2020版藥典一致；有研究表明用乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等為流動(dòng)相測(cè)定時(shí)液相結(jié)果良好。本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)有采用乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，但最后結(jié)果顯示乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)結(jié)果較優(yōu)。

兒咳一號(hào)方是我院用于治療肺熱咳嗽的協(xié)定方，在兒科臨床應(yīng)用多年，并有良好的臨床療效，具備開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑的基礎(chǔ)。但中藥飲片質(zhì)量參差不齊，中藥制劑在選用藥材和制備過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格把關(guān)，確保藥品質(zhì)量，更好地保證兒童用藥安全與有效。