楊 玥,趙溟昱,謝旭東,王 駿

1999年,Savino等[1]最早在散發(fā)性乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)Copine 7(CPNE7)蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn),前成釉細(xì)胞條件培養(yǎng)基(preameloblast-conditioned medium,PACM)能誘導(dǎo)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞分化,具有促進(jìn)牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)形成的作用[2-4]。2011年,Lee等[2]在PACM中檢測到CPNE7蛋白,并發(fā)現(xiàn)CPNE7蛋白能顯著促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá),表明了CPNE7蛋白具有促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。基于此,學(xué)者們在牙本質(zhì)再生、牙周組織再生、骨組織再生及腫瘤領(lǐng)域?qū)PNE7開展了眾多研究[5]。

1 CPNE7介紹

CPNE蛋白家族是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族,其普遍特征為N端包含兩個(gè)C2結(jié)構(gòu)域,C端包含一個(gè)von Willebrand因子A型結(jié)構(gòu)域[2, 6]。其中N端的兩個(gè)C2結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為與鈣離子流入有關(guān)[7],von Willebrand結(jié)構(gòu)域參與蛋白間相互作用[8]。目前CPNE蛋白家族包含9個(gè)成員(CPNE1～9)。在CPNE2、CPNE6和CPNE7蛋白中,第2個(gè)C2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)鈣依賴性膜結(jié)合,均表現(xiàn)出高鈣離子親和力。CPNE7蛋白通過與成牙本質(zhì)細(xì)胞表面的核仁素蛋白結(jié)合[9],介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用,上調(diào)牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和纖毛體成分的含量,促進(jìn)牙周組織和牙本質(zhì)的形成[10]。

2 CPNE7的時(shí)空表達(dá)

2.1 CPNE7在空間上的表達(dá)

有學(xué)者利用小鼠模型,分析了CPNE7蛋白在胚胎期和出生后的時(shí)空表達(dá)特征,動(dòng)態(tài)觀察了CPNE7在牙齒發(fā)育過程中的表達(dá)模式[10]。CPNE7蛋白在前成釉細(xì)胞分化為成釉細(xì)胞的過程中合成,并在合成后不久分泌至外胚層間充質(zhì)中,促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞先分化為前成牙本質(zhì)細(xì)胞,再分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞(圖1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CPNE7蛋白和mRNA同時(shí)在牙乳頭和牙源性上皮細(xì)胞上表達(dá),證實(shí)了牙源性上皮細(xì)胞分泌的CPNE7通過上皮-間充質(zhì)相互作用向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移,并促進(jìn)其分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞(圖2)。該研究發(fā)現(xiàn),CPNE7在成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙本質(zhì)和前期牙本質(zhì)中分布均勻,而在成釉細(xì)胞中少量表達(dá)。

小鼠牙冠形成過程中,CPNE7蛋白在成釉細(xì)胞中合成并分泌至間充質(zhì),促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。牙冠發(fā)育后期,牙本質(zhì)礦物質(zhì)沉積,CPNE7蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞中弱表達(dá)圖1 CPNE7牙冠發(fā)育過程中的作用模式圖Fig.1 Action pattern diagram of CPNE7′s role during odontogenesis

CPNE7蛋白最初在蕾狀期的上皮細(xì)胞中表達(dá),帽狀期也可見于牙囊細(xì)胞。在鐘狀期,CPNE7蛋白見于整個(gè)成釉器中,同時(shí)在牙乳頭也有少量表達(dá)。在鐘狀期末期,CPNE7蛋白在前成釉細(xì)胞和前成牙本質(zhì)細(xì)胞中分泌圖2 CPNE7在小鼠牙齒發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig.2 Expression of CPNE7 during mouse tooth development

2.2 CPNE7在時(shí)間上的表達(dá)

Park等[11]通過免疫組化檢測和原位雜交技術(shù),確定了CPNE7在小鼠牙齒發(fā)育過程中的定位。在蕾狀期,CPNE7蛋白在口腔上皮細(xì)胞中表達(dá),而未在牙源性間充質(zhì)中表達(dá)。在帽狀期,CPNE7蛋白除在牙源性上皮細(xì)胞表達(dá)外,也有少量在牙囊中表達(dá),但仍未在其他間充質(zhì)結(jié)構(gòu)中表達(dá)。在鐘狀期,CPNE7蛋白在整個(gè)成釉器中都有表達(dá),同時(shí)在牙源性間充質(zhì)中少量分泌。在鐘狀期末期,CPNE7蛋白同時(shí)在前成釉細(xì)胞和前成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)(圖2)。

在出生后的牙冠形成時(shí)期,CPNE7蛋白定位于成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙本質(zhì)和前期牙本質(zhì)中,但在成熟成釉細(xì)胞和赫特維希上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath,HERS)中弱表達(dá)[11](圖2)。在此期間CPNE7蛋白的不連續(xù)表達(dá)可能有助于牙本質(zhì)初始礦物沉積。在HERS和根部牙本質(zhì)形成過程中,CPNE7蛋白在與上皮細(xì)胞基底膜接觸的前成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。總體來看,CPNE7蛋白的表達(dá)水平在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化早期上升,在晚期下降,顯示其與早期牙齒發(fā)育有關(guān)。

3 CPNE7對牙本質(zhì)、牙周組織修復(fù)與再生的影響

3.1 CPNE7可以促進(jìn)牙本質(zhì)的形成

3.1.1 誘導(dǎo)牙本質(zhì)小管空間封閉

CPNE7蛋白可以促進(jìn)牙本質(zhì)小管內(nèi)礦物沉積和牙本質(zhì)小管空間封閉,進(jìn)而促進(jìn)第三期牙本質(zhì)再生。Park等[12]將CPNE7蛋白應(yīng)用于牙本質(zhì)過敏癥模型,并在之后觀察第三期牙本質(zhì)形成狀況和牙本質(zhì)小管封閉情況,損傷的牙本質(zhì)在使用CPNE7蛋白處理后與對照組相比通透性明顯降低。堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)是細(xì)胞礦化中的特征分子,成牙本質(zhì)細(xì)胞在CPNE7處理后ALP啟動(dòng)子活性升高,此外,CPNE7處理犬牙間接蓋髓模型后在電鏡下觀察到牙本質(zhì)小管被礦物沉淀所阻斷,表明CPNE7對牙本質(zhì)小管內(nèi)礦物沉積有促進(jìn)作用[3]。

3.1.2 自噬誘導(dǎo)作用

CPNE7能通過自噬誘導(dǎo)促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和第三期牙本質(zhì)的形成,且新形成的牙本質(zhì)保留原發(fā)性牙本質(zhì)特征。Lee等[2]發(fā)現(xiàn),CPNE7不僅能通過調(diào)控纖毛細(xì)胞控制DSPP的表達(dá),促進(jìn)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成牙本質(zhì)細(xì)胞,還能誘導(dǎo)非牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞分化后呈現(xiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞特征,表明CPNE7在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Park等[12]將CPNE7蛋白應(yīng)用于牙本質(zhì)過敏癥模型中,損傷的牙本質(zhì)在使用CPNE7蛋白處理后有新的第三期牙本質(zhì)形成,并檢測到新生牙本質(zhì)表達(dá)牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和神經(jīng)巢蛋白(NESTIN)。DSP和NESTIN是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的重要標(biāo)志物,表明CPNE7蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的硬組織保留了原發(fā)性牙本質(zhì)的特征[13-15]。在比格犬牙的活體間接蓋髓術(shù)模型中,CPNE7組剩余牙本質(zhì)下明顯能觀察到再生的牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)[3]。盡管成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞對外部刺激的反應(yīng)能力較弱,但CPNE7可能會增強(qiáng)其細(xì)胞功能并導(dǎo)致管狀牙本質(zhì)再生。

為了進(jìn)一步探究CPNE7促進(jìn)第三期牙本質(zhì)形成的機(jī)制,Choung等[3]將CPNE7重組蛋白(recombinant CPNE7,rCPNE7)應(yīng)用于暴露的牙本質(zhì),以探究該蛋白在體內(nèi)是否能滲透通過牙本質(zhì)小管。結(jié)果表明,rCPNE7能很好地通過狹窄的牙本質(zhì)小管快速滲透并擴(kuò)散到牙本質(zhì)液中。CPNE7蛋白可能通過刺激小管中的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,從而促進(jìn)第三期牙本質(zhì)的形成。Park等[16]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)在成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中表現(xiàn)出與CPNE7相似的表達(dá)模式,CPNE7處理增強(qiáng)了LC3-Ⅱ表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CPNE7不但通過誘導(dǎo)自噬上調(diào)DSP和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)激活成熟牙本質(zhì)細(xì)胞活性,還上調(diào)成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的NESTIN和微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein tau,TAU),并可能參與細(xì)胞重塑,刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞突伸長。此外,經(jīng)過CPNE7蛋白處理的成牙本質(zhì)細(xì)胞中脂褐質(zhì)減少,表明CPNE7介導(dǎo)的自噬作用可能通過清除細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,幫助恢復(fù)細(xì)胞功能。

3.2 CPNE7可以促進(jìn)牙周組織的再生

多項(xiàng)研究表明,CPNE7在促進(jìn)牙周組織再生方面有重要作用。Yu等[4]將比格犬前磨牙進(jìn)行完全脫位和延遲再植處理,并徹底刮除其牙根表面的牙周膜和牙骨質(zhì)以探究牙周組織缺損時(shí),CPNE7蛋白在促進(jìn)其再生方面的作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置CPNE7蛋白處理組、PACM培養(yǎng)基處理組、CPNE7蛋白滅活處理組,并設(shè)置牙周膜和牙骨質(zhì)刮除的陰性和陽性對照。結(jié)果顯示,CPNE7蛋白處理組與其他實(shí)驗(yàn)組相比,牙周膜纖維垂直于根面埋入牙槽嵴中,與天然牙類似,但其新生牙周膜的質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在CPNE7蛋白滅活處理組中,牙骨質(zhì)形成明顯減少,但仍然高于陰性對照組,表明CPNE7蛋白雖與牙周膜再生無明顯關(guān)系,但可能參與牙骨質(zhì)再生,在牙周組織修復(fù)中有積極作用。Choung等[17]在體外評價(jià)CPNE7對牙囊細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)CPNE7可能通過調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞在骨質(zhì)上的附著和促進(jìn)牙周膜纖維垂直排列于新形成的牙骨質(zhì)和牙槽骨,而在牙周再生中發(fā)揮功能性作用。

最新的研究證實(shí),CPNE7促進(jìn)牙周組織再生的機(jī)制可能與TAU蛋白有關(guān)。TAU能通過重組肌動(dòng)蛋白-微管網(wǎng)絡(luò)與微管的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域結(jié)合,在細(xì)胞骨架的形成與穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[18]。Bai等[18]在體外研究中發(fā)現(xiàn),CPNE7在細(xì)胞中與TAU空間表達(dá)的定位相同,并能誘導(dǎo)TAU的表達(dá)。隨后在小鼠和比格犬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明,CPNE7能通過調(diào)節(jié)TAU與牙骨質(zhì)附著蛋白,介導(dǎo)細(xì)胞骨架重組,影響牙周膜在牙槽骨上的附著,使錯(cuò)位的牙周膜纖維重排整齊,從而有助于牙周膜再生。

4 CPNE7的衍生物

4.1 CDP4

Lee等[19]根據(jù)CPNE7蛋白序列結(jié)構(gòu)分析,從CPNE7蛋白序列C2結(jié)構(gòu)域的C端到von Willebrand因子A型結(jié)構(gòu)域選擇出6條短肽CDP1～6,集中在CPNE7蛋白的321～360位。其中CDP4(氨基酸序列為VNPKYKQKRR,相對分子質(zhì)量為1 315)表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性、較好的細(xì)胞滲透性和成骨能力。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),CDP4能顯著提高體外人牙髓干細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物pSmad/Smad蛋白、骨鈣蛋白、堿性磷酸酶、RUNX2蛋白表達(dá)[15,20],且效果接近完整的CPNE7蛋白。茜素紅染色結(jié)果顯示,CDP4提高鈣沉積水平效果甚至高于CPNE7蛋白。以上研究提示CDP4序列可能是CPNE7蛋白中與細(xì)胞滲透性和成骨分化有關(guān)的關(guān)鍵序列。體內(nèi)外研究數(shù)據(jù)都支持,CDP4的促成骨作用與目前最有效的促成骨藥物骨形成蛋白2(bone morphogene-tic protein 2,BMP-2)相近,有潛力作為BMP-2的替代藥品應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域。

與完整蛋白相比,合成肽在再生治療中能有效避免免疫原性、體內(nèi)降解、致癌等不良反應(yīng),具有成骨效率高、選擇性高、累積風(fēng)險(xiǎn)低和交叉反應(yīng)性高等優(yōu)勢。此外,CDP4在工業(yè)生產(chǎn)中更易合成、優(yōu)化和處理,具有更高的商業(yè)潛力。

4.2 CPNE7-DP

Lee等[21]設(shè)計(jì)并合成了一種穩(wěn)定、成本低且易操縱的功能性肽CPNE7-DP(包含對應(yīng)于CPNE7蛋白344～353位的一段合成肽,氨基酸序列為KYKQKRRSYK),可模仿CPNE7蛋白的功能。在Lee等設(shè)計(jì)的比格犬前磨牙牙本質(zhì)暴露模型中,CPNE7-DP對不同程度的牙本質(zhì)暴露都表現(xiàn)出促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成和牙本質(zhì)小管封閉的作用,且新生的硬組織表現(xiàn)出原發(fā)性牙本質(zhì)的特征,表明其不僅促進(jìn)新生成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,還能重新激活休眠狀態(tài)的成牙本質(zhì)細(xì)胞,使其分泌牙本質(zhì)基質(zhì)。而在Bai等[18]的體外研究中發(fā)現(xiàn),CPNE7-DP等能直接上調(diào)骨質(zhì)附著蛋白的表達(dá)水平,并在犬類三壁骨缺損模型中修復(fù)牙周膜的結(jié)構(gòu)與功能,在牙周組織的修復(fù)方面也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。此外,CPNE7是通過核仁素介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,而CPNE7-DP可以直接穿過細(xì)胞膜。CPNE7-DP在多種條件下保持穩(wěn)定,是一種更為穩(wěn)定的細(xì)胞穿透肽。

5 CPNE7及其衍生物的臨床應(yīng)用前景

多項(xiàng)研究證實(shí)CPNE7蛋白能顯著降低牙本質(zhì)通透性,在牙本質(zhì)敏感癥(dentin hypersensitivity,DHS)的治療中顯示出重要的應(yīng)用潛能。DHS是暴露的牙本質(zhì)對外界刺激產(chǎn)生的酸痛不適感,難以預(yù)防,且治療過程痛苦[22]。基于液體動(dòng)力學(xué)理論[23-24],目前臨床上減輕DHS疼痛的主要方法是通過阻塞牙本質(zhì)小管內(nèi)液體流動(dòng),從而阻斷各種刺激的侵入[25],但是傳統(tǒng)的治療方法并不理想[26]。在Park等[12]構(gòu)建的牙本質(zhì)暴露模型中,CPNE7蛋白能誘導(dǎo)第三期牙本質(zhì)的再生,促進(jìn)牙本質(zhì)小管封閉并顯著降低牙本質(zhì)通透性,能有效減輕DSH的癥狀,顯示了CPNE7蛋白在DSH的治療中的重要潛力。對于牙本質(zhì)小管封閉的原因,目前有兩種可能的解釋[3]:一種是成牙本質(zhì)細(xì)胞在CPNE7蛋白的刺激下在牙本質(zhì)小管內(nèi)礦化;另一種是CPNE7蛋白因其高鈣離子結(jié)合能力與牙本質(zhì)液中的鈣離子直接反應(yīng)。

目前已有大量有關(guān)生物牙本質(zhì)再生方面的研究,其中大部分研究表明:第三期牙本質(zhì)表現(xiàn)出骨樣牙本質(zhì)特征,成牙本質(zhì)細(xì)胞包埋于形成很快的間質(zhì)中,細(xì)胞變性后在該處遺留一空隙[27]。骨樣牙本質(zhì)礦物密度低于管樣牙本質(zhì),無法起穩(wěn)固的支持保護(hù)作用[28]。此外,骨樣牙本質(zhì)中牙本質(zhì)小管數(shù)目明顯少于正常牙本質(zhì),而多項(xiàng)研究表明牙本質(zhì)小管在牙齒防御機(jī)制中起重要作用[29-31]。CPNE7誘導(dǎo)產(chǎn)生的牙本質(zhì)具有管樣牙本質(zhì)特征,新生牙本質(zhì)中DSP和神經(jīng)巢蛋白具有良好的生理活性。同時(shí)CPNE7蛋白能促進(jìn)牙本質(zhì)小管內(nèi)的礦物沉積,降低牙本質(zhì)通透性,在治療牙本質(zhì)缺失方面有重要的臨床應(yīng)用前景。

牙周組織再生是通過修復(fù)因牙周疾病或外傷受損的牙周組織,還原其原始狀態(tài),獲得牙周組織結(jié)構(gòu)和功能的重建[32]。體外研究證實(shí)CPNE7可通過調(diào)節(jié)牙周膜纖維的排列促進(jìn)牙骨質(zhì)形成,在牙周組織修復(fù)中具有一定的應(yīng)用前景,但具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[4,16-17]。

除在牙、牙本質(zhì)修復(fù)方面的作用外,最新的研究指出CPNE7可促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,MSCs與腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的相互作用在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用[33-34]。越來越多的研究證明,MSC通過分泌特定的細(xì)胞因子影響腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)程[35]。Ji等[36]通過實(shí)驗(yàn)證明,CPNE7可以與口腔鱗狀細(xì)胞癌間充質(zhì)細(xì)胞表面的核仁蛋白、Iκ?α蛋白結(jié)合,激活NF-κB通路,促進(jìn)p65的胞內(nèi)轉(zhuǎn)移和IκBa磷酸化,調(diào)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞分泌CXCL8,促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此,間充質(zhì)干細(xì)胞中的CPNE7可能成為口腔鱗癌的潛在治療靶點(diǎn)。

6 總 結(jié)

綜上所述,CPNE7蛋白在促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化、成牙本質(zhì)細(xì)胞形成、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)再生的過程中均發(fā)揮重要的作用,顯示其在牙本質(zhì)損傷和牙周缺損的臨床治療中可能的應(yīng)用潛力。然而,CPNE7蛋白促進(jìn)牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)修復(fù)的具體作用機(jī)制尚未明確。

目前研究主要關(guān)注CPNE7蛋白對牙本質(zhì)的作用及其機(jī)制,而關(guān)于其在牙周組織再生中的作用及機(jī)制的研究較少,有少量文獻(xiàn)揭示其與口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系,但CPNE7的細(xì)胞毒性和致癌作用仍有待進(jìn)一步的研究。另一方面,大多數(shù)研究僅僅對CPNE7蛋白的作用作出定性的探討,未對其使用量、作用方式和作用時(shí)間做進(jìn)一步的拓展。

由于CPNE7蛋白成本高昂、分子量較大等限制,具有易于合成、性能更佳優(yōu)勢的CPNE7蛋白衍生物更具有臨床應(yīng)用潛力?；贑PNE7蛋白衍生的功能肽因其各方面性能的不同,可能將滿足多樣化的臨床促牙本質(zhì)和牙周組織再生需求。