馮澤華,邱 爽,徐萱雯,鄭 凱,徐 艷

牙周炎是目前全球成人失牙的主要原因,多表現(xiàn)為牙齦紅腫出血、牙齒松動、牙周軟硬組織缺損[1]。目前恢復(fù)牙周組織缺損的主要方法為引導(dǎo)性組織再生(guided tissue regeneration,GTR),有時還需要配合骨組織支架以維持其空間及形態(tài)[2]。骨組織工程支架可模擬細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),形成適合細胞接種和培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)與環(huán)境,促進干細胞的成骨向分化,從而促進牙周骨再生[3]。

植入物移植后往往會導(dǎo)致局部異物反應(yīng)(foreign body response,FBR),局部過度炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致植入失敗。髓系細胞(包括巨噬細胞、中性粒細胞和單核細胞),尤其是巨噬細胞,在生物材料的FBR和降解中起著關(guān)鍵作用[4]。同時巨噬細胞還可通過分泌細胞因子影響骨再生微環(huán)境,如M1型(促炎型)巨噬細胞釋放TNF-α和IL-1β,不僅抑制成骨細胞合成分泌堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),還對細胞外骨基質(zhì)的分泌和鈣化產(chǎn)生負面影響,而M2型(抑炎型)巨噬細胞則可促進組織修復(fù)[5]。因此,目前合成制備能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的植入支架材料已成為組織再生工程的研究熱點。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

PCL(Mn 80000)、明膠、羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)、乙酸(純度99%)、甲酸(純度99%)、來自牙齦卟啉單胞菌的細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma,美國),叔丁醇、十六烷基三甲基溴化銨(cetrimonium bromide,CTAB)、乙酸乙酯(ethyl acetate,EA)、飽和氨水、正硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS)、無水乙醇、二水合氯化鈣(麥克林,中國),RAW 264.7細胞系(中國科學(xué)院,中國),CCK-8試劑盒、Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒(碧云天,中國),鼠抗F4/80 Percp-cy5.5、鼠抗CD86(B7-2)FITC、鼠抗CD206 PE(Abcam,英國),PBS-牛血清白蛋白溶液(0.1%BSA,源葉,中國),小鼠 Fc 受體阻斷劑(愛必信,中國),通用內(nèi)參抗體雞尾酒套裝(Abbkine,中國),流式染色緩沖液(Biosharp,中國),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日本),SYBR Green PCR matter mix(諾唯贊,中國)。

桌面型靜電紡絲機(納儀儀器,中國),高速均質(zhì)機(基銘儀器,中國),離子濺射鍍膜儀(Emitech,英國),熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡及X射線能譜儀(energy dispersive spectrometer,EDS)(FEI,美國),全波長酶標儀(MD,美國),數(shù)碼相機(佳能,日本),CO2細胞培養(yǎng)箱(Heraeus,美國),超凈工作臺(Baker,美國),流式細胞儀(BD,美國),體視顯微鏡(Nikon,日本),倒置熒光顯微鏡(Leica,德國),掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)(Philips,荷蘭),熒光定量PCR儀(ABI,美國),離心機、超微量紫外分光光度計、細胞計數(shù)儀(賽默飛,美國),噴金設(shè)備(Quorum,英國)。

1.2 支架制備

所有制備過程都在室溫和50%～60%的相對濕度條件下進行。

1.2.1 靜電紡絲 將PCL(Mn 80000)溶解在乙酸和甲酸(體積比1∶1)中配制成質(zhì)量分數(shù)為15%的PCL溶液,在室溫下磁力攪拌6 h直至充分溶解。將該溶液加入到10 mL注射器,連接21G針頭(內(nèi)徑為0.51 mm),用注射泵控制溶液流速為0.4 mL/h。一塊鋁箔被固定在接地的滾筒收集器上,與針尖距離為15 cm,收集器轉(zhuǎn)速為400 r/min。高壓電源通過一金屬夾加載于針頭上,施加的電壓固定為14 kV。穩(wěn)定紡絲6 h后收集鋁箔表面的電紡膜。

1.2.2 PCL納米纖維的制備 將PCL電紡膜切割成約1 cm×1 cm的纖維膜,分散在75%乙醇中,使用帶有11.5 mm直徑刀頭的FSH-2A高速均質(zhì)機粉碎成納米纖維懸濁液。均質(zhì)機在2 min內(nèi)勻速加速到20 000 r/min,高速工作5 min后,使用1 mm孔徑的過濾網(wǎng)過濾懸濁液,濾網(wǎng)上的剩余物質(zhì)被反復(fù)均質(zhì)和過濾。之后,納米纖維懸濁液經(jīng)歷離心和48 h的冷凍干燥,獲得PCL納米短纖維。

1.2.3 PCL海綿的制備 稱量30 mg PCL納米短纖維,轉(zhuǎn)移到含2 mL 20%(體積分數(shù))叔丁醇的5 mL燒杯中。充分混合后,再加入750 μL去離子水,靜置20 min,等待PCL納米短纖維浮起。然后沿瓶壁緩慢加入750 μL 0.1 g/mL明膠溶液,靜置20 min,48 ℃水浴5 min,獲得PCL海綿。去離子水清洗海綿3次,去除多余的明膠,37 ℃烘干24 h。

對坡腳進行垂直切坡處理后，斜馬道寬度拓展為4.85 m，即上壩道路初期壩下游壩面段實際寬度達到4.85 m，增強了道路的安全通行條件。

1.2.4 MBGN的合成 MBGN采用基于微乳化的溶膠-凝膠法合成。2.8 g的十六烷基三甲基溴化銨溶解在132 mL的去離子水中。在35 ℃下持續(xù)磁力攪拌直至溶液澄清透明后,加入40 mL乙酸乙酯,25 ℃水浴磁力攪拌30 min,加入28 mL 1 mol/L氨水溶液,攪拌15 min后向上述混合物中加入144 mL正硅酸四乙酯,攪拌30 min后再加入4.06 g CaCl2·2H2O,攪拌4 h。離心收集形成的白色沉淀,用去離子水和無水乙醇各清洗1次,在60 ℃下干燥過夜,然后以2 ℃/min的加熱速度在700 ℃下煅燒3 h。

1.2.5 PCL@MBGN的合成 去離子水配制質(zhì)量分數(shù)為5%的CMCS溶液。根據(jù)加入MBGN相對于CMCS的質(zhì)量分數(shù)(0%、100%、150%),這些溶液分別被命名為0%MBGN、100%MBGN、150%MBGN。分別將250 μL上述溶液均勻地滴在PCL海綿的表面,37 ℃烘干2 d,得到的支架分別被命名為PCL@0MBGN,PCL@100MBGN,PCL@150MBGN。

1.3 MBGN、PCL電紡膜和PCL@MBGN支架的表征

用SEM觀察MBGN、PCL電紡膜的形態(tài)和PCL@MBGN的橫截面,同時采用EDS檢測其元素組成。在用SEM觀察之前,試樣通過噴金設(shè)備噴金。

1.4 體外細胞毒性

1.4.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞系在DMEM完全培養(yǎng)基(含100U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清)中傳代,5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),傳至3～4代后開始使用。

1.4.2 細胞毒性 根據(jù)試劑盒說明書,使用CCK-8法進行PCL@0MBGN、PCL@100MBGN、PCL@150MBGN的細胞毒性檢測。將支架在DMEM培養(yǎng)液中浸泡24 h,支架DMEM浸提液的終濃度為1 g/L,用0.22 μm的過濾器過濾浸提液。將RAW 264.7以每孔3 000個細胞接種在96孔板中,貼壁培養(yǎng)12 h后,將細胞培養(yǎng)基換成條件培養(yǎng)基(PCL@MBGN浸提液、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清),空白對照組使用DMEM完全培養(yǎng)基換液。培養(yǎng)24、48 h后,分別在96孔培養(yǎng)板中加入CCK-8試劑,并在37 ℃下培養(yǎng)2 h,酶標儀檢測獲得各孔在450 nm處的吸光度。活死細胞染色也同時按Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒說明書進行,在24、48 h使用倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 體外抗炎能力

1.5.1 細胞處理 調(diào)整RAW 264.7細胞懸液密度為5×105個/mL,流式細胞術(shù)檢測所用接種于培養(yǎng)皿中,qRT-PCR所用細胞接種于6孔板中,貼壁培養(yǎng)12 h后,除空白對照組外均加入100 ng/mL LPS刺激細胞12 h,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)后,PCL@MBGN處理組予以浸提液處理48 h。

1.5.2 流式細胞術(shù)檢測極化水平 浸提液刺激結(jié)束后,消化、收集細胞,4 ℃條件下650×g離心4 min,于100 μL染色緩沖液(1% PBS-BSA)中重懸,加入2 μL FcR阻斷劑,4 ℃避光孵育10 min,渦旋混勻。加入相應(yīng)流式抗體(F4/80、10 μL CD86,40 μL CD206)和100 μL antibody cocktail進行表面染色,4 ℃避光孵育60 min,700 μL染色緩沖液洗滌2次,離心,300 μL染色緩沖液重懸細胞,上機檢測。

1.5.3 qRT-PCR檢測相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 Trizol法提取細胞總RNA,取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列見表1。按照SYBR Green PCR matter mix說明書進行real-time PCR檢測,反應(yīng)條件為95 ℃,30 s預(yù)變性;5 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。重復(fù)3次,數(shù)據(jù)按2-ΔΔCt的方法分析炎性相關(guān)細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOs)的mRNA相對濃度。

表1 引物設(shè)計Tab.1 Primer designs

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 支架制備與形貌

本研究選用“良性溶劑”甲酸和乙酸作為PCL的溶劑,通過靜電紡絲獲得了質(zhì)量分數(shù)為15%的PCL靜電紡絲膜。在SEM下觀察,靜電紡絲纖維分布均勻、無明顯液滴,纖維的平均直徑為(261±76)nm(圖1E)。通過分散、均質(zhì)化、篩選和凍干可以獲得PCL納米短纖維(圖1B),再利用明膠的熱自組裝和烘干,合成PCL納米纖維海綿。PCL納米纖維海綿呈白色,表面疏松多孔。

A:PCL靜電紡絲纖維膜數(shù)碼照片圖;B:PCL短纖維數(shù)碼照片圖;C:PCL@MBGN在吊蘭葉片上數(shù)碼照片圖;D:MBGN與PCL@150MBGN的EDS結(jié)果;E:PCL電紡纖維膜SEM圖;F:MBGN的SEM圖;G:PCL@0MBGN的橫截面SEM圖;H:PCL@100MBGN的橫截面SEM圖;I:PCL@150MBGN的橫截面SEM圖圖1 PCL@MBGN支架材料的制備與性能Fig.1 Preparation and morphology of PCL@MBGN scaffolds

通過溶膠-凝膠法合成的MBGN,SEM下呈均勻的球形顆粒,粒徑在100～200 nm(圖1F)。CMCS具有黏性作為粘接介質(zhì),可以將MBGN粘接于PCL納米纖維表面(圖1H、I)。將含有不同濃度MBGN的CMCS溶液滴加于PCL海綿上,利用重力和海綿的吸水性使其分布于海綿表面及內(nèi)部,再烘干以獲得MBGN增強的PCL海綿(PCL@MBGN),此時的PCL@MBGN由于CMCS的添加呈淡黃色(圖1C),各組間的宏觀形貌無明顯差異。同時觀察到PCL@MBGN可靜置于吊蘭葉片尖端。

PCL@MBGN橫截面SEM結(jié)果可見PCL@0MBGN組的纖維直徑不規(guī)則增加,表面可見凝膠涂層(圖1G)。添加MBGN組纖維表面可見顆粒狀MBGN附著在纖維表面(圖1H、I),且隨MBGN添加量增加而纖維表面顆粒含量增加。

EDS結(jié)果(圖1D)顯示MBGN的主要組成元素為O、Si、Ca,其中Si的質(zhì)量分數(shù)為19.4%,Ca的質(zhì)量分數(shù)為2.9%。PCL@150MBGN的主要組成元素為C、O、Si,其中Si的質(zhì)量分數(shù)為2.6%,Ca質(zhì)量分數(shù)為0.1%,與MBGN中Ca添加量較低有關(guān)。

2.2 體外細胞毒性

RAW 264.7細胞在浸提液中培養(yǎng)24 h和48 h后均表現(xiàn)為良好的增殖活性。PCL@MBGN各組在浸提液中培養(yǎng)24 h后,較空白對照組均表現(xiàn)為高于110%的增殖活性,PCL@0MBGN(P<0.01)、PCL@150MBGN組(P<0.05)明顯增高,其中PCL@0MBGN組增殖活性最高,但PCL@MBGN各組間無明顯差異(P>0.1)。在浸提液中培養(yǎng)48 h后,PCL@MBGN組仍表現(xiàn)為高于空白對照組的增殖活性,且隨MBGN添加量增加,增殖活性越強(圖2)。以上結(jié)果表明PCL@MBGN對RAW 264.7細胞無毒性,且MBGN的添加可能促進細胞的增殖。

*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001圖2 RAW264.7細胞在PCL@MBGN浸提液中培養(yǎng)24 h和48 h后的細胞活性Fig.2 RAW264.7 cells viability after 24 and 48 hours of cultivation in PCL@MBGN extract

活死細胞染色顯示,各組均未見大量紅色熒光指示的死細胞,驗證PCL@MBGN無細胞毒性(圖3)。

綠色熒光指示活細胞,紅色熒光指示死細胞圖3 RAW264.7細胞在PCL@MBGN浸提液中培養(yǎng)24 h和48 h后活死細胞染色結(jié)果Fig.3 RAW264.7 cells viability after 24 and 48 hours of cultivation in PCL@MBGN extract

2.3 體外免疫調(diào)節(jié)能力

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,LPS作用后,CD86陽性率較空白對照組有明顯提高(P<0.05),PCL@MBGN浸提液處理48 h后,CD86+M1型巨噬細胞比例隨MBGN添加量增加而減少;CD206+M2型巨噬細胞比例增加,雖然增加量較少,但增長倍數(shù)明顯提高(P<0.05)。未添加MBGN的PCL@0MBGN組也較LPS處理組CD86+M1型巨噬細胞比例降低,CD206+M2型巨噬細胞比例增加(P<0.05)(圖4、表2)。

A:空白對照組;B:添加100 ng/mL LPS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h;C:LPS+PCL@0MGBN組;D:LPS+PCL@100MGBN組;E:LPS+PCL@150MGBN組圖4 PCL@MBGN浸提液對RAW 264.7細胞極化水平影響 Fig.4 The effect of PCL@MBGN extracts on the polarization level of RAW 264.7 cells

表2 PCL@MBGN浸提液對RAW 264.7細胞極化水平影響Tab.2 The effect of PCL@MBGN extracts on the polarization level of RAW 264.7 cells %

qRT-PCR檢測IL-4、IL-1β、TNF-α、iNOs等免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平如表3所示。在LPS刺激下,炎性相關(guān)的IL-1β、TNF-α、iNOs的轉(zhuǎn)錄水平較空白對照組顯著上調(diào),而抑炎相關(guān)因子IL-4下調(diào),表明本研究成功誘導(dǎo)RAW 264.7細胞炎性反應(yīng)。與LPS組相比,PCL@MBGN各組中IL-4轉(zhuǎn)錄水平均明顯提高(P<0.001),且MBGN添加量越多,IL-4轉(zhuǎn)錄水平越高(P<0.000 1);IL-1β、TNF-α、iNOs轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(P<0.05);LPS+PCL@150MBGN IL-1β、iNOs、TNF-α表達最低,IL-4表達最高,抑炎效果最好。

表3 PCL@MBGN浸提液對炎癥相關(guān)細胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平影響Tab.3 The effect of PCL@MBGN extract on the transcription level of inflammatory related cytokine genes

3 討 論

目前使用CMCS進行靜電紡絲纖維表面改性并粘接MBGN,合成PCL/MBGN復(fù)合3D支架材料用于骨組織工程尚未見相關(guān)報道。本研究結(jié)合利用靜電紡絲、均質(zhì)化、明膠熱自組裝、CMCS表面改性等技術(shù)將溶膠-凝膠法合成的MBGN粘接于納米纖維表面,成功合成了3D結(jié)構(gòu)的納米纖維支架PCL@MBGN。

巨噬細胞極化與機體功能和疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。在骨再生過程中,M1型巨噬細胞釋放大量促炎細胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6),抑制骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)和成骨細胞的增殖和成骨分化[17],促進成骨細胞凋亡,并激活破骨細胞[18-19],對成骨產(chǎn)生抑制作用[20-23]。TNF-α刺激成骨細胞分泌NF-κB配體的受體激活劑,與單核細胞膜受體結(jié)合,通過激活NF-κB途徑促進單核細胞向破骨細胞分化[24]。在這個過程中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加[25],進一步放大了炎癥級聯(lián)反應(yīng),且ROS可以抑制BMSCs的成骨分化[26],加速成骨細胞的衰老和功能障礙[27]。因此通過抑制巨噬細胞的M1型分化,并抑制促炎因子分泌將有利于BMSCs的成骨向分化,創(chuàng)建一個有利于成骨的免疫微環(huán)境。該復(fù)合支架免疫調(diào)節(jié)功能與促進骨再生之間的內(nèi)在機制還有待進一步探究。

4 結(jié) 論

綜上,本研究成功制備了由PCL和MBGN組成的具有3D結(jié)構(gòu)的復(fù)合骨組織工程支架,該支架在體外發(fā)揮了抑炎作用,抑制了小鼠RAW264.7巨噬細胞系向M1型極化,并在一定程度上促進其向M2型極化,并抑制促炎因子轉(zhuǎn)錄,這可能是其促進骨再生的一個潛在機制。PCL@MBGN在骨再生應(yīng)用,尤其是炎癥環(huán)境下的骨缺損修復(fù)具有很大的潛力。