武倩男 張璐璐 邢雁青 霍如婕 田新瑞

Krüppel 樣因子 4 (Kruppel-like factor 4,KLF4),也稱為腸道富集的Krüppel樣因子(Gut-enriched kruppel-like factor,GKLF),是最早發(fā)現(xiàn)的 KLF 家族成員之一。它是一種高度保守的含鋅指轉錄因子,可在人體多種組織中表達,調節(jié)細胞生長、增殖、分化、凋亡等多種過程[1],同時它是一種雙功能轉錄因子,對于不同的靶基因能夠通過不同的機制激活或抑制轉錄[2]。KLF4含有483 個氨基酸,分子量為 53 kDa,其特征在于羧基末端序列中含有三個鋅指基序。而在氨基末端,擁有一個反式激活結構域,與其相鄰的則是一個抑制結構域,這些特性決定了KLF4可通過與其他因子相互作用和調節(jié) DNA 結合效率從而影響轉錄調節(jié)活性的特異性。作為一種多功能轉錄因子,可通過磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化調節(jié)在多個水平上進行參與調節(jié)細胞的轉錄、翻譯過程[3],因而可在不同的疾病中發(fā)揮不同作用。近年來,對KLF4在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究有了深入發(fā)展。現(xiàn)就KLF4在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用綜述如下。

一、KLF4與支氣管哮喘

哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的呼吸道疾病[4]。關于哮喘的診斷及治療方案雖不斷改進,但在哮喘的發(fā)病機制上所取得的研究成果仍十分有限。多項研究發(fā)現(xiàn)在哮喘及其他過敏性疾病患者中,KLF4的表達水平均較健康患者明顯升高,這意味著KLF4可能在哮喘等過敏性疾病中發(fā)揮著關鍵作用。最新的研究發(fā)現(xiàn),KLF4可能通過OX40L、胸腺基質淋巴細胞生成素(transactions on speech and sanguage processing,TSLP)及肺泡巨噬細胞(alveolarmacrophage,AAM)等不同途徑在哮喘中發(fā)揮重要作用。

OX40L也稱為 CD252,最初稱為糖蛋白34 kDa (GP34),與其同源受體OX40,均屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和TNF受體超家族。OX40L主要由抗原呈遞細胞表達,包括活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞以及內(nèi)皮細胞。在小鼠和非人靈長類動物哮喘模型中發(fā)現(xiàn),抑制OX40L會減少TSLP表達。TSLP可介導Th2型炎癥,當其在肺中過表達時可導致嚴重的氣道炎癥和氣道高反應性(airway hyper reactivity,AHR)[5-6]。最新有研究發(fā)現(xiàn),在哮喘小鼠模型中,當KLF4過表達時,OX40L基因的啟動子活性明顯降低,而當KLF4表達減少時,OX40L基因的啟動子活性則明顯增強,其通過實驗證明KLF4對OX40L具有明顯的抑制作用[7],該團隊研究發(fā)現(xiàn)通過KLF4過表達沉默OX40L啟動子來抑制氣道炎癥及高反應性緩解哮喘的發(fā)生、發(fā)展。而Jeanette及其團隊則證實在敲除KLF4基因的哮喘小鼠模型中,TSLP生成明顯減少,這意味著KLF4或許可直接作用于TSLP,該研究團隊的實驗結果則證明KLF4在急性哮喘小鼠模型中可促進氣道炎癥和重塑[8]。上述不同實驗研究表明KLF4通過OX40L、TSLP在哮喘中發(fā)揮的作用較為復雜,其兼顧促炎及抑炎作用,通過靶向KLF4-OX40L-TSLP軸平衡哮喘氣道炎癥及高反應性,或可為研究哮喘發(fā)病機制或治療哮喘的發(fā)生與發(fā)展提供新的研究方向及思路。

Yong Gyu Lee發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠模型中的肺泡巨噬細胞(alveolarmacrophage,AAM)可在Th2介導的免疫微環(huán)境中分化并極化為M2型(促哮喘炎癥表型),其表現(xiàn)出吞噬作用降低和自身免疫受損,該過程可誘導氣道炎癥加重和肺部嗜酸性粒細胞募集,加重哮喘的進展[9]。KLF4可誘導單核細胞趨化蛋白誘導蛋白(monocyte chemoattractant protein-inducible protein,MCPIP)的RNase和去泛素酶活性,從而刺激活性氧的產(chǎn)生,進而導致AAM向M2型細胞極化,此外也可通過抑制NF-κB 通路來抑制M1極化,進一步促使AAM向M2型分化。另一方面,KLF4可刺激過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR-γ),誘導細胞有氧呼吸,這是 M2 細胞分化所必需的。KLF4可通過上述不同途徑上調M2極化并抑制M1極化,誘導AAM分化為M2型巨噬細胞[10]。Song等人通過使用大黃素下調小鼠哮喘模型中KLF4,降低AAM極化為M2型巨噬細胞,從而緩解哮喘小鼠氣道炎癥及重塑,再次證實KLF4可通過AAM影響哮喘的發(fā)生及發(fā)展[11]。

關于KLF4在哮喘中發(fā)揮的具體機制似乎很復雜。既往研究中,無論是實驗哮喘小鼠模型亦或者是哮喘及過敏性鼻炎等過敏性疾病患者中,KLF4表達水平均可見明顯升高,且通過降低KLF4表達水平,氣道炎癥及重塑均較前明顯緩解。不同的是最近則有學者發(fā)現(xiàn)KLF4亦可通過OX40L軸抑制炎癥而緩解哮喘發(fā)展。這或許與KLF4的雙功能轉錄相關,我們十分期待未來關于KLF4在哮喘中的進一步研究,這或許可進一步揭示哮喘新發(fā)病機制,并可能為該疾病的治療提供新的思路或靶點。

二、KLF4與肺癌

肺癌是全世界最致命的疾病之一。在美國,肺癌的五年生存率為 17.7%,而我國的肺癌患者僅為 16.1%,其已成為我國醫(yī)療的嚴重負擔[12]。其根據(jù)病理類型的差異,可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。目前與KLF4研究相關性較高的為NSCLC。病灶轉移被認為是NSCLC患者治療失敗及死亡的最主要原因之一。上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認為是病灶轉移的關鍵因素[13]。近來研究發(fā)現(xiàn)KLF4可通過雷帕霉素的機制靶點(Mechanistic targets of rapamycin,mTOR)途徑影響NSCLC的轉移。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,屬于 PI3K 相關激酶家族,mTOR 通過兩種結構和功能不同的多蛋白復合物—— mTOR 復合物 1和 mTOR 復合物 2在細胞生理學中發(fā)揮作用,而雷帕霉素不敏感伴侶(Rapamycin-insensitive companion of mTOR,Rictor)屬于mTORC2[14]。Huiling Zhou等人通過 RNA 干擾沉默了 NSCLC 細胞的 Rictor 表達,結果顯示 NSCLC細胞的遷移能力顯著下降。在實驗中發(fā)現(xiàn),NSCLC細胞中的間充質標志物波形蛋白和 E-鈣粘蛋白轉錄抑制因子 Slug 表達明顯下降,上皮標記物 E-鈣粘蛋白和 β-連環(huán)蛋白的表達則增加。這些結果表明抑制 Rictor可導致反向間充質-上皮轉化(Mesenchymal-epithelialtransition,MET)——這是 EMT 的逆過程,進而降低癌細胞的運動性、侵襲性,并參與EMT 重編程的調節(jié)。而將NSCLC 中KLF4 敲低后Rictor 的表達下調,同時伴隨波形蛋白和Slug 表達的減少。Rictor還可與mTOR組成復合物,且該復合物參與EMT的重編程[15],敲低KLF4后該復合物明顯減少,證明KLF4影響 Rictor的表達。KLF4 的敲低導致 Rictor 及其復合物的下調,伴隨著 MET 的一系列特征性變化,顯著降低了 NSCLC 細胞的遷移、侵襲和轉移。通過靶向KLF4降低 Rictor表達,抑制NSCLC的轉移,或可能是未來用于治療NSCLC的一種策略[13]。

腫瘤相關巨噬細胞 (Tumor-associated macrophage,TAM) 是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[16],其通過影響肺癌發(fā)生的過程,包括肺癌細胞的增殖、侵襲和轉移被認為是肺癌進展的關鍵因素。TAM可分化為 M1型(經(jīng)典激活)和 M2型(交替激活),因此同時具有抗腫瘤和促腫瘤作用[17]。M1 型巨噬細胞的功能是促進Th1反應包括殺微生物和殺腫瘤作用[17-18]。M2 型巨噬細胞的功能是誘導 Th2 反應并促進組織修復和重塑、血管生成和免疫抑制,以及腫瘤進展[16]。相關臨床數(shù)據(jù)表明,約70 % 的 TAM 為 M2 型,其余為 M1型,這意味TAM在促癌方面可能更占據(jù)優(yōu)勢[19]。上文提及,KLF4可通過不同途徑上調M2極化,抑制M1極化。通過靶向抑制KLF4表達,減弱M2型巨噬細胞激活,或可能成為一種治療肺癌的新型方案。

三、KLF4與肺炎

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎最常見的致病病原體,目前多重耐藥肺炎鏈球菌菌株的出現(xiàn)增加了與肺炎球菌肺炎相關的發(fā)病率和死亡率[20]。肺的先天免疫系統(tǒng)是消除侵入性肺炎球菌的關鍵,多形核中性粒細胞 (Polymorphonuclear neutrophil,PMN) 和巨噬細胞是肺先天免疫反應細胞中的重要效應物。這兩種細胞均由骨髓中的骨髓前體形成,在血液中以靜止的PMN或單核細胞的形式循環(huán),在肺相關部位發(fā)生炎癥時被招募,轉化為活化的效應細胞[21]。在識別細菌成分后,活化的PMN和巨噬細胞會通過各種機制例如吞噬作用、抗菌化合物的釋放、跨越細胞外陷阱等消除病原體如肺炎球菌,并通過產(chǎn)生細胞因子和抗原呈遞至細菌的效應細胞來協(xié)調免疫反應。另一方面PMN活化后其 NADPH 氧化酶復合物會釋放細胞外活性氧 (Reactive oxygen species,ROS),其對病原體的滅解亦發(fā)揮重要作用[22]。

Shen Yuyan等人研究發(fā)現(xiàn)KLF4 是PMN的關鍵轉錄調節(jié)因子。其使用脂多糖或大腸桿菌刺激特異性KLF4敲除的小鼠骨髓PMN,通過定量實時 PCR測定實驗組小鼠中性粒細胞中的基質金屬蛋白酶9(Matrix metallopeptidase 9,MMP-9)即中性粒細胞特征性細胞器水平,發(fā)現(xiàn)其較對照組明顯降低,證實KLF4在誘導PMN生長中起關鍵作用,但具體通路仍需進一步探討[23]。Shen Yuyan等人通過肺炎小鼠模型證實缺乏KLF4的PMN所產(chǎn)生的ROS較正常PMN明顯減少,且標志細胞凋亡的caspase-3 的激活顯著減弱,表明細胞凋亡受到干擾。與正常中性粒細胞比較,缺乏 KLF4 的中性粒細胞不能有效殺死細菌。這些數(shù)據(jù)表明 KLF4 是中性粒細胞炎癥反應所必需的[23]。通過上述論述,缺乏KLF4后PMN對病原體的消除能力明顯下降,從而導致炎癥進一步加重,表明 KLF4 可能是治療肺炎等中性粒細胞介導疾病的可行靶點。

四、KLF4與肺動脈高壓

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PAH)是一種以肺血管阻力和肺動脈壓升高為特征的呼吸系統(tǒng)疾病[24],其特征是肺動脈平滑肌細胞(pulmonary-artery smooth muscle cells,PASMCs)過度增殖,導致血管重塑失調。

香煙煙霧(cigarette smoke,CS) 是已知的肺動脈高壓危險因素,其可誘導PASMCs 過度增殖和細胞外基質過度沉積導致的動脈壁增厚直接導致肺小血管重塑[25]。Sun等人研究發(fā)現(xiàn)KLF4可通過抑制AKT通路的激活發(fā)揮正向作用,從而抑制細胞增殖,使血管形態(tài)接近正常[26]。其研究團隊通過氣管內(nèi)給藥(AAV1-KLF4-shRNA)敲低CS-PAH大鼠模型 KLF4 基因后發(fā)現(xiàn)隨著實驗組大鼠肺血管中KLF4表達的降低,PASMCs過度增殖及小血管壁增厚較對照組均有明顯改善,右心室血流動力學指數(shù)也較對照組明顯下降。其實驗證明通過氣管內(nèi)給藥AAV1-KLF4-shRNA 敲低 KLF4 基因,可抑制肺血管重塑和改善右心室血流動力學,對 CS 誘導的PAH大鼠模型具有體內(nèi)預防和治療作用?；诖?通過氣管內(nèi)滴注從而敲除或抑制肺血管內(nèi)KLF4基因在未來或許可成為PAH的預防及治療方式[27]。

五、KLF4與特發(fā)性肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的發(fā)生與疾病早期氣道上皮細胞(airway epithelial cell,AECs)長期反復損傷和異常修復有關,它被認為是一種端粒介導的疾病[28]。Dai等人研究表明,具有端粒酶逆轉錄酶(Telomerose reverse transcriptas,TERT)突變的 IPF 患者通常伴有較短的端粒,且絕大多數(shù)患者端粒酶活性降低,端粒長度縮短,Cox比例風險模型分析也表明外周血有核細胞端粒長度縮短是 IPF 患者生存的獨立危險因素[29]。Povedano等人通過實驗發(fā)現(xiàn)上皮細胞中的 TERT 表達能夠抵抗博來霉素誘導肺纖維化,TERT 的缺乏會影響上皮細胞的增殖,并可能導致上皮再生受損使肺纖維化增強[30],這些研究表明端粒縮短在IPF的發(fā)生發(fā)展和預后中具有重要作用,是IPF發(fā)生的重要分子基礎。最新的研究發(fā)現(xiàn),KLF4可能通過調節(jié)肺纖維化的肺泡上皮細胞中TERT的轉錄而參與肺纖維化的發(fā)病機制[31]。

Hoffmeyer等人報道稱,KLF4 在端粒酶基因表達調控中起重要作用。人類胚胎干細胞中 KLF4 的消耗可導致TERT蛋白的表達降低。在hESCs中,β-catenin與KLF4結合形成復合物,與TERT基因的啟動子區(qū)結合,調節(jié)TERT基因的表達,促進端粒延長[32]。在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型中衰老標志物P16、P21和P53的表達顯著升高,KLF4及TERT表達均減少。通過構建腺相關病毒-6載體介導KLF4過表達的SP-C啟動子,特異性靶向AECs,提高KLF4在肺纖維化中的表達水平,端粒酶活性也隨之上調,端粒長度也較對照組長,表明KLF4可以保護肺纖維化的端?；钚约伴L度。當KLF4表達下調時,TERT啟動子轉錄也隨之減少,端粒酶活性下調。證明KLF4可能是通過與TERT啟動子結合,誘導TERT表達和保護端粒酶活性[31]。該研究表明KLF4可能是進一步了解肺纖維化機制和開發(fā)治療肺纖維化新策略的有希望的潛在靶點。

已有研究證明,在IPF進展期間,M2型巨噬細胞在肺巨噬細胞分化中占據(jù)主要優(yōu)勢[33],其是促進IPF進展的因素之一[34]。M2型巨噬細胞可分泌多種生長因子,包括轉化生長因子-β (Transforming growth factor-β,TGF-β)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)、血小板源性生長因子-α (Platelet-derived growth factor α,PDGF-α)、胰島素樣生長因子 1 (Insulin-like growth factor 1,IGF-1) 和血管內(nèi)皮生長因子 (Vascular endothelial growth factor,VEGF)[35]。TGF-β是IPF的關鍵促纖維化因子,可誘導EMT的發(fā)生,這是肺泡上皮細胞向肌成纖維細胞轉化的關鍵過程[36]。FGF、PDGF-α、IGF-1、VEGF這些細胞因子的刺激可增強成纖維細胞的增殖,并增加肌成纖維細胞的誘導分化。肌成纖維細胞的快速增殖、膠原蛋白和纖連蛋白等細胞外基質蛋白的過度沉積以及高收縮能力進一步導致纖維化發(fā)展[35]。綜上所述,KLF4通過調節(jié)肺泡上皮細胞中TERT的轉錄及巨噬細胞的分化,可在IPF中發(fā)揮重要作用。

六、KLF4和急性呼吸窘迫綜合征

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),是一種破壞性呼吸系統(tǒng)綜合征,在全球范圍內(nèi)均具有較高的死亡率[37]。其臨床特征包括嚴重的低氧血癥、雙肺炎性浸潤、肺水腫、肺順應性下降和功能殘氣量下降[38]。病理變化主要為肺泡-毛細血管膜功能障礙進而導致血管通透性增加,使大量含有蛋白質的液體滲出、肺泡出血和纖維蛋白沉積[39]。越來越多的證據(jù)表明巨噬細胞是ARDS 發(fā)病機制中的關鍵因素。而Saleh、Mohd等多人均發(fā)現(xiàn)通過靶向誘導KLF4表達可調節(jié)肺巨噬細胞在ARDS中發(fā)揮重要作用[40-41]。在最初 ARDS 中受到刺激后,AAM 會立即轉變?yōu)镸1表型,釋放各種有效的促炎介質,包括 IL-1β、IL-6 和 IL-18,幫助中性粒細胞穿過內(nèi)皮和上皮,進入肺和肺泡空間發(fā)揮作用[42]。因此,M1 型巨噬細胞在ARDS 肺組織損傷過程中起促進作用。消除致病因素后,駐留和募集的巨噬細胞從 M1表型轉變?yōu)榭寡?M2表型。它們產(chǎn)生抗炎細胞因子,例如 IL-10 和 IL-1 受體拮抗劑,以響應Th2細胞因子[43]。此外M2 巨噬細胞具有強大的吞噬能力,可清除壞死細胞和碎片,吞噬細胞,消除凋亡細胞,激活抗炎信號并終止促炎反應[44]。晚期時M2巨噬細胞在肺組織修復中發(fā)揮重要作用,其過度的激活會導致肺部的纖維化反應,如上文IPF中所述。因此,通過靶向KLF4調節(jié)巨噬細胞極化來減少早期過度的促炎反應和晚期過度的成纖維細胞增殖可能是 ALI/ARDS 可行的治療思路。

七、總結與展望

KLF4可在細胞發(fā)育、重編程等過程發(fā)揮重要作用。它最初被認為是細胞生長的負調節(jié)劑,能夠調節(jié)參與細胞周期進程的許多基因的表達。本文綜述了KLF4在呼吸系統(tǒng)疾病中有可能的作用機制及途徑,我們?nèi)孕枵J識到,KLF4是一種雙功能轉錄因子,在不同的細胞環(huán)境及細胞類型中可能會起到完全相反的作用。隨著對KLF4越來越多的研究,其更具體的機制及靶點將進一步明確,未來通過靶向KLF4對于呼吸系統(tǒng)疾病的預防及治療或成為一種可行的方案。