陸維 陳亮 姜玉新 陸志偉

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)的主要特征是肺血管重塑,從而導(dǎo)致動脈管腔變窄,肺血管阻力增加,肺動脈壓升高,最終右心衰竭甚至死亡。肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞,肺動脈平滑肌細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,免疫系統(tǒng)失調(diào)及血管生成受損等因素參與肺血管重塑[1]。PAH目前病因不明,可能與遺傳突變、表觀遺傳、環(huán)境因素,免疫炎癥等相關(guān),目前對PAH的發(fā)病機制的研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展。

非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)因其在疾病中的作用,已經(jīng)成為越來越令人感興趣的領(lǐng)域。ncRNA中的一個亞組,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),內(nèi)源性表達(dá)缺乏蛋白編碼能力的RNA,這些RNA在一系列病理生理過程中發(fā)揮重要作用,譬如調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(增殖、遷徙、凋亡、血管新生、新陳代謝),炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答和血管新生[2]。根據(jù)lncRNA在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域附近的基因組位置,lncRNA被分為5類:正義,反義,內(nèi)含子,基因間和雙向作用lncRNA[3]。然而,非編碼RNA并非完全不參與編碼,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)lncRNA可參與編碼蛋白質(zhì)或多肽[4],這些功能肽可能成為抗癌治療的靶點或預(yù)后的標(biāo)記物。近年來,大量研究表明其在PAH發(fā)病機制中參與細(xì)胞差異表達(dá)。本文將綜述lncRNA在PAH病理生理中的作用,并闡述其在PAH診斷及治療中的作用及面臨的挑戰(zhàn)。

一、LncRNA在PAH中的作用機制

肺動脈血管重塑是PAH的重要機制,肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)的過度增殖和凋亡抵抗可導(dǎo)致肺血管重塑。PASMC的功能障礙可由不同的信號通路介導(dǎo),包括:PDGF,TGF-β,Wnt,雌激素,Notch,PI3K/AKT/mTOR 和 MAPK等。目前大部分lncRNA的研究都集中在PAH發(fā)展過程中對PASMCs及肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary arterial endothelial cells,PAECs)的調(diào)節(jié)作用。

1 H19

LncRNA H19是一種高度保守lncRNA,在胚胎形成過程中,在許多胎兒組織和在胚胎本身中高表達(dá),但H19出生后在除了心臟和骨骼肌中以外的組織中下調(diào)[5]。近來,一些研究揭示了H19在PAH發(fā)病機制中的調(diào)節(jié)作用,其表達(dá)水平在野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的PAH兔子和小鼠模型的血液和肺中均有升高,此外,已證明PDGF,IL-1β和 IL-6可以誘導(dǎo)產(chǎn)生H19,且可以通過PDGF-BB/H19/let-7b信號軸調(diào)節(jié)1型血管緊張素II受體促進(jìn)PASMC細(xì)胞增殖[6]。而對小鼠模型中H19進(jìn)行敲降,則對MCT誘導(dǎo)的PAH臨床特征(右室肥大,肺血管中膜厚度和血管肌化等)表現(xiàn)出保護(hù)作用,表明H19可能是PAH的一個潛在治療靶點。但是有研究則得出不同的結(jié)論,Wang等最近的研究表明,MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的H19,PDCD4和miR-675-3p水平顯著降低,而IGF1R 和 miR-200α的表達(dá)水平增高,并證明了褪黑素可通過調(diào)節(jié)H19/miR-200α/PDCD4 和H19/miR-675-3p/IGF1R信號軸,抑制PASMCs 增殖,對PAH起保護(hù)作用[7]。故此,H19在肺血管重塑的作用方向尚不明確,仍需要更多在人類PAH樣本中的研究。

2 CASC2

癌癥易感性候選者2(Cancer Susceptibility Candidate 2,CASC2)是一種腫瘤抑制基因,已被研究證明通過不同的機制調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。Gong等研究表明CASC2的表達(dá)水平在缺氧誘導(dǎo)的大鼠PAH模型的PA中和人PASMCs(HPASMCs)中明顯降低,且無論體內(nèi)和體外,CASC2過表達(dá)都可以抑制細(xì)胞增殖和遷移,并促進(jìn)凋亡。此外,CASC2過表達(dá)可通過降低缺氧誘導(dǎo)的表型切換相關(guān)標(biāo)記物α-SMA的表達(dá)。CASC2過表達(dá)可以改善缺氧誘導(dǎo)的大鼠的肺動脈高壓的表現(xiàn)如:平均肺動脈壓,RV肥厚,肺血管內(nèi)壁增厚和纖維化等[8]。另一項體外研究表明,CASC2可通過調(diào)節(jié)miR-222/ING5軸減弱缺氧誘導(dǎo)的HPASMC的增殖和遷移,表明CASC2可能作為抑制PAH中的血管重塑的一個靶點[9]。

3 TUG1

?；撬嵘险{(diào)基因1(Taurine-Up-Regulated Gene 1,TUG1)是一種長度為7.1 kb 的lncRNA,在PASMC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá),其在哺乳動物中高度保守。既往的研究表明TUG1參與調(diào)控蛋白和miRNA的表達(dá),在細(xì)胞增殖、凋亡和染色質(zhì)的調(diào)控重塑中起重要作用。Yang等的研究表明,TUG1在缺氧誘導(dǎo)的小鼠模型和PASMCs中高表達(dá)。TUG1通過與miR-374c結(jié)合,上調(diào)Foxc1的表達(dá),而沉默的TUG1通過結(jié)合miR-374c下調(diào)Foxc1表達(dá),從而抑制增殖和遷移,并通過Notch信號通路促進(jìn)PASMCs凋亡,阻礙PAH的肺血管重構(gòu)[10]。Wang[11]等的研究發(fā)現(xiàn)TUG1是通過結(jié)合miR-328來調(diào)節(jié)HPASMCs的增殖和細(xì)胞周期,而TUG1是否還通過其他機制調(diào)節(jié)PAH,如表型轉(zhuǎn)換,免疫失調(diào),炎癥反應(yīng)等,仍需要進(jìn)一步研究。

4 MALAT1

轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1(Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1,MALAT1)是一種高度保守的lncRNA,已發(fā)現(xiàn)其參與多種癌癥發(fā)病機制,Brock等報道了MALAT1在低氧的HPASMCs和缺氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織中顯著升高,并發(fā)現(xiàn)MALAT1可促進(jìn)PASMCs的增殖和遷移,并調(diào)節(jié)它的表型。此外,MALAT1基因敲除可以抑制體外PASMC的增殖,通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)來抑制小鼠模型心肌肥厚[12]。而Zhuo等,在MALAT1基因上識別了一個與PAH易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性序列rs619586A>G,而MALAT1 rs619586 GG等位基因?qū)AH有保護(hù)作用。進(jìn)一步的功能實驗表明,MALAT1中rs619586A到G的改變可以通過作為miR-214的競爭性內(nèi)源性RNA (ceRNA)直接上調(diào)X盒結(jié)合蛋白1 (XBP1)的表達(dá),并因此通過縮短S-M相變來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[13]。此外,還有研究表明MALAT1通過調(diào)節(jié)miR-503/Toll樣受體4促進(jìn)HPASMCs遷移和增殖[14]。這表明MALAT1可能通過多種路徑抑制PASMC的增殖。

5 MEG3

母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)位于人類染色體14q32上,長度為1.6kb,它是一種腫瘤抑制因子。Piccoli等的研究表明,MEG3主要定位于缺氧PASMCs的細(xì)胞質(zhì)中,在缺氧誘導(dǎo)的PAH動物模型和特發(fā)性肺動脈高壓患者的PASMCs中表達(dá)水平顯著升高[15]。MEG3通過肺特異性傳遞小干擾RNA (siRNA)進(jìn)行敲除后,可抑制PAH在體內(nèi)的發(fā)展。MEG3基因沉默后,特發(fā)性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary hypertension,IPAH)患者的PASMCs和體外缺氧暴露的PASMCs二者的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程均減弱,此外MEG3還可與microRNA-328-3p (miR-328-3p)相互作用并導(dǎo)致其降解,導(dǎo)致胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)上調(diào)。這可能揭示了MEG3在缺氧誘導(dǎo)PASMC增殖中存在多種調(diào)控機制[16]。

6 ANRIL

INK4位點上的lncRNA反義非編碼RNA (Antisense Noncoding RNA in the INK4 Locus,ANRIL)是一段長126kb的長鏈非編碼RNA,包含19個外顯子,定位于染色體9p21區(qū)域的INK4位點上。ANRIL首先在家族性黑色素瘤患者中發(fā)現(xiàn)。ANRIL的失調(diào)和血管內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、血管平滑肌細(xì)胞的衰老、單個核細(xì)胞增殖和粘附以及DNA損傷有關(guān)。Wang等人的研究表明,ANRIL在缺氧的HPASMCs中表達(dá)顯著下降,而siRNA導(dǎo)致的ANRIL靜默加速了細(xì)胞周期進(jìn)程,使更多的HPASMC從G0/G1期進(jìn)入G2/M+S期,增加了缺氧暴露的HPASMCs細(xì)胞增殖和遷移,證明ANRIL在缺氧HPASMCs中起重要作用[17],這可能為PAH的治療提供了新的靶點,但仍需要更多的研究去證實及探索更多的作用機制。

7 TYKRIL

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體誘導(dǎo)lncRNA(Tyrosine Kinase Receptor Inducing LncRNA,TYKRIL)是所有條件下唯一普遍上調(diào)的lncRNA。PDGF、IL-18 和TGF-β等促PAH因子可誘導(dǎo)TYKRIL表達(dá)上調(diào)。有研究表明TYKRIL可通過p53/PDGF信號軸促進(jìn)PASMC細(xì)胞增殖,同時抑制其凋亡。且在體外對IPAH患者的肺精確切割薄片(PCLS)研究,證明用GapmeR介導(dǎo)的PCLS中TYKRIL的敲除,可逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu),說明TYRIL對PAH有潛在的治療作用[18]。

8 SMILR

平滑肌富集lncRNA(Smooth Muscle Enriched Long Noncoding RNA,SMILR)的表達(dá)已被證明在PAH患者、MCT誘導(dǎo)的PAH模型和缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中高表達(dá)。一項體外研究表明,SMILR的下調(diào)通過靶向miR-141抑制缺氧誘導(dǎo)的PASMC的增殖和遷移,SMILR 的雙鏈RNA在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型中的傳遞,可通過靶向Rho/ROCK/miR-141軸改善PAH和肺血管重塑[19]。但其目前在PAH中的研究仍非常有限,未來需要更多的研究去證實及探索其在PAH中的作用。

9 PAXIP1-AS1

一項小樣本的研究發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1在IPAH患者的肺小動脈,血管外膜成纖維細(xì)胞和PASMC中表達(dá)上調(diào)。而PAXIP1-AS1的抑制可通過靶向其下游的樁蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制PASMC的增殖和遷移[20]。還有研究亦得出PAXIP1-AS1的表達(dá)在缺氧誘導(dǎo)的大鼠PAH模型和缺氧的PASMCs中均顯著升高。該研究發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1通過與WIPF1/RhoA復(fù)合體相互作用,招募轉(zhuǎn)錄因子ETS1形成調(diào)控復(fù)合體充當(dāng)支架的作用。PAXIP1-AS1的敲除顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs的細(xì)胞活力和遷移[21]。

10 RPS4l

核糖體蛋白S4l(Ribosomal Protein S4-Like,RPS4l)是Liu等在缺氧誘導(dǎo)的小鼠PAH模型中,通過高通量RNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了其在肺組織中的表達(dá)降低,并在PASMCs中也驗證了這一點。RPS4l可通過調(diào)控PASMCs中白細(xì)胞介素增強劑結(jié)合因子3 (ILF3)和缺氧誘導(dǎo)因子1 (HIF-1α),來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程等功能,而轉(zhuǎn)基因小鼠過表達(dá)RPS4l可通過減少肺血管重構(gòu)和右心室肥厚來減緩PAH的發(fā)展[22]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),RPS4l編碼的一條新肽RPS4XL,在缺氧誘導(dǎo)的PAH和缺氧PASMCs中下調(diào)。RPS4XL通過抑制其結(jié)合蛋白RPS6的磷酸化來抑制缺氧誘導(dǎo)的PASMC的增殖,表明這條肽可能在缺氧的PAH中起作用[23]。但這些仍需要更多的研究在體內(nèi)及PAH患者中證實。

11 GAS5

LncRNA生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào),比如肺、乳腺、膀胱、胃、前列腺和胰腺癌等,表明GAS5可能在細(xì)胞生長和增殖中起抑制作用。近來,在缺氧誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺和缺氧的PASMCs中,GAS5的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào),用siRNA沉默GAS5的表達(dá)可能通過GAS5/miR-23b-3p/KCNK3信號軸來刺激HPASMCs的遷移和增殖[24]。與此一致的是用血小板源生長因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)處理的PASMC中也發(fā)現(xiàn)了GAS5表達(dá)的下調(diào),進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)GAS5通過靶向miR-382-3p調(diào)節(jié)慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(CTEPH)大鼠的肺動脈壁增厚、血管生成和自噬[25]。Wu等在CETPH患者及大鼠模型中采集肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞,研究亞精胺(SP)誘導(dǎo)自噬的機制中發(fā)現(xiàn),SP誘導(dǎo)的自噬使PAECs中的GAS5升高。GAS5的下調(diào)則可逆轉(zhuǎn)了SP在PAECs中的作用,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)GAS5在體內(nèi)外通過miRNA 31 5p/NAT8L信號通路促進(jìn)SP誘導(dǎo)的自噬,表明GAS5未來可能是治療CTEPH分子標(biāo)記物之一[26],但是目前GAS5與其他的lncRNA存在一樣的問題,其多在嚙齒動物模型中研究,在哺乳動物中或是體內(nèi)研究甚少,未來還有很大的研究潛力

12 PAHRF

肺動脈高壓相關(guān)因子(Pulmonary Arterial Hypertension Related Factor,PAHRF),又名NONHSAT169231.1,位于人類14號染色體上,缺氧暴露的HPASMCs和PAH患者的肺動脈中有較低的PAHRF表達(dá)水平,PAHRF過表達(dá)抑制HPASMCs的細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,然而對它進(jìn)行敲除則得到相反的效果。PAHRF可以通過內(nèi)源性吸附miR-23a-3p,最終使MST1的表達(dá)下調(diào)。過表達(dá)PAHRF的質(zhì)粒在缺氧條件下可抑制miR-23a-3p的表達(dá),從而刺激HPASMCs增殖和抑制凋亡來促進(jìn)缺氧肺動脈高壓的肺血管重塑[27]。

13 MANTIS

又稱n342419,有研究表明其在MCT- PAH大鼠模型和晚期IPAH患者的肺中表達(dá)降低,在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者分離出的ECs中和喂養(yǎng)動脈粥樣硬化飲食的食蟹猴頸動脈中明顯升高。表明MANTIS在不同疾病中表達(dá)具有特異性,進(jìn)一步的研究表明,如果對 MANTIS進(jìn)行抑制或敲除,在注射了基質(zhì)嵌入的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)小鼠體外實驗中,ECs的遷移,血管管腔形成和血管出芽均受到抑制,這可能解釋了由于MANTIS下調(diào)導(dǎo)致PAH患者遠(yuǎn)端肺動脈血管生成受阻的原因[28]。

二、LncRNA在PAH中的診斷作用

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種lncRNA在PAH中表達(dá)異常,參與了PAH的不同階段。Omura等的研究發(fā)現(xiàn)血漿H19水平可以區(qū)分PAH患者與對照組,其水平與RV功能相關(guān),并還能預(yù)測長期生存,這表明H19可能是PAH診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物,且已有指南將其納入PAH預(yù)后分層的亞組[29]。還有小樣本的研究中發(fā)現(xiàn)IPAH患者肺小動脈,血管外膜成纖維細(xì)胞和PASMC中PAXIP1-AS1的增高[20],除此之外還有研究發(fā)現(xiàn)PAH患者血漿中MALAT1增高[14],這些都可能成為PAH診斷的生物標(biāo)志物。但目前仍缺乏在人類大樣本中的研究,且各種lncRNA參與的PAH發(fā)生發(fā)展的階段仍不明,導(dǎo)致在患者中采集標(biāo)本的時機不明,可能影響其作為生物學(xué)標(biāo)記物的開發(fā)。其在臨床實踐中實現(xiàn)更準(zhǔn)確的PAH風(fēng)險分層、診斷和預(yù)后管理仍有很大的潛力。

三、LncRNA在PAH中的治療作用

目前,針對lncRNA的作用僅在一些腫瘤的動物模型中進(jìn)行,且因為lncRNA在物種間的保守性很差,目前尚無理想的人類PAH模型,這使得開發(fā)和測試用于人類的lncRNA藥品非常困難。此外,多數(shù)lncRNA存在于細(xì)胞核,且具有高度二級結(jié)構(gòu),這使得 siRNA與這部分lncRNA結(jié)合并使其沉默變的困難,而構(gòu)建lncRNA高表達(dá)質(zhì)粒的方式也存在受限于細(xì)胞核的問題,Yin等[30]設(shè)計了 Sno載體,其可以穩(wěn)定地表達(dá)任何感興趣的序列,并限制其在細(xì)胞核中的積累,并且可能保持著正常的核關(guān)聯(lián)核功能,這可能為這些定位在細(xì)胞核的lncRNA功能的探索提供新的方法。

四、結(jié)語

PAH是一種以肺血管重構(gòu)為特征的疾病,可導(dǎo)致肺動脈壓持續(xù)升高、右心衰甚至死亡。lncRNA是轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵分子。目前大量的證據(jù)表明lncRNA是PAH發(fā)病和進(jìn)展的重要作用。新的PAH相關(guān)lncRNA及其調(diào)控機制不斷發(fā)現(xiàn)。這些lncRNA不僅有望成為治療藥物的有效靶點,還可能為PAH分層、預(yù)后方面提供依據(jù)。但是,目前的研究多在體外或嚙齒動物模型中進(jìn)行,其主要的建模方法為缺氧和野百合堿誘導(dǎo)模型,而建立靈長動物模型可行栓塞或動靜脈分流術(shù),但 PAH形成的機制復(fù)雜,目前鮮有研究對這些動物模型和人類PAH的相關(guān)性進(jìn)行研究,而有關(guān)lncRNA治療研究也非常有限,尤其在臨床應(yīng)用方面。因此,需要繼續(xù)研究lncRNA的作用機制,探索更有效的、可及的靶點;同時探索建立理想的PAH模型,使lncRNA相關(guān)的藥物能夠走向臨床應(yīng)用。