劉佳佳 陳思琪 崔魴

肺曲霉菌病(pulmonary aspergillus disease,PA)是由曲霉菌侵入肺組織所引起的深部真菌感染性疾病,其中危害最嚴(yán)重的類(lèi)型是侵襲性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillus,IPA),病程進(jìn)展快,病死率高,常發(fā)生在免疫抑制的病患中[1]。目前診斷PA的依據(jù)缺乏一定客觀性或獲取結(jié)果耗時(shí)久,尤其是IPA病情進(jìn)展迅速,常規(guī)檢測(cè)手段易延誤治療時(shí)機(jī)[2-4]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)作為天然免疫模式識(shí)別受體,參與了煙曲霉感染宿主免疫防御[5-6]。髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體1(triggering recepter expressed on myeloid cell 1 ,TREM1)是先天免疫效應(yīng)細(xì)胞的模式識(shí)別受體之一,在煙曲霉的識(shí)別中發(fā)揮作用,可放大TLR4炎癥信號(hào)[7-8]。因此,本研究檢測(cè)TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的表達(dá)情況并探究其診斷價(jià)值,以期為早期臨床診斷曲霉菌感染提供一定參考價(jià)值。

資料與方法

一、 一般資料

經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(倫理審查批號(hào):2022-K254),選取2021年9月至2023年3月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為肺曲霉菌病患者30例為研究對(duì)象(研究組),選取研究組中接受抗真菌藥物治療214天的患者16例為藥物治療組;同期本院健康體檢者 25例作為健康對(duì)照組,本院確診為肺部感染(非曲霉菌)患者30例為肺部感染對(duì)照組。 研究組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均符合肺曲霉菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2,9]。(2)患者年齡≥18歲。(3)臨床資料完整。(4)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并敗血癥、膿毒癥、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎等慢性炎癥[10]。(2)合并心肌梗死、感染性心內(nèi)膜炎、自身免疫性疾病如銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[11]。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)無(wú)發(fā)熱感染等癥狀。(2)年齡≥18歲。(3)心、肝、腎功能正常。(4)白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常。肺部感染對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合肺部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2)無(wú)曲霉菌感染的臨床及病原學(xué)檢測(cè)依據(jù)。(3)年齡≥18歲。

二、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 檢測(cè)血清中TREM1、TLR4水平

肺曲霉菌病患者、健康體檢者、肺部感染(非曲霉菌)患者于入院當(dāng)天、獲得診斷當(dāng)天、體檢當(dāng)天空腹抽取靜脈血5mL,室溫靜置1h,3000r/min離心10min,上清備用。嚴(yán)格按照人TREM1、TLR4 ELISA試劑盒(華美生物 cusabio 公司,產(chǎn)品編號(hào)分別為:CSB-E04836h,CSB-E12954h)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中TREM1、TLR4水平。

三、使用AVIOS高通量流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清Th1/Th2/Th17型相關(guān)細(xì)胞因子濃度(包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ)

肺曲霉菌病患者、健康體檢者、肺部感染(非曲霉菌)患者于入院當(dāng)天、獲得診斷當(dāng)天、體檢當(dāng)天、肺曲霉菌患者服用抗曲霉菌藥物治療14天[12]后,空腹抽取靜脈血5mL,室溫靜置1h,3000r/min離心10min,上清備用。嚴(yán)格按照人Th1/Th2/Th17亞群檢測(cè)試劑盒(江西賽基生物技術(shù)有限公司)使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中Th1/Th17型相關(guān)細(xì)胞因子濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、基線資料

選取2021年9月至2023年3月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為肺曲霉菌病患者30例為研究對(duì)象(研究組),男 20例、女10例,年齡≥18歲、平均年齡(62.60±13.95)歲(見(jiàn)表1); 同期本院健康體檢者 25例作為健康對(duì)照組,男16例、女9例,年齡≥18歲、平均年齡(62.92±10.32)歲; 本院確診為肺部感染(非曲霉菌)患者30例為肺部感染組,男24例、女6例,年齡≥18歲、平均年齡(70.13±19.99)歲。各組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.043,F=2.198,P>0.05),具有可比性。

二、研究組、肺部感染組、健康對(duì)照組血清TREM1、TLR4水平情況

與健康對(duì)照組、肺部感染組相比較,研究組血清中TREM1、TLR4水平均升高(P<0.05)。肺部感染組與健康對(duì)照組血清中TREM1、TLR4水平相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

三、血清TREM1、TLR4水平對(duì)肺曲霉菌病患者的診斷價(jià)值

表1 研究組臨床資料

表2 研究組、肺部感染組、健康對(duì)照組血清中TREM1、TLR4水平比較

通過(guò)ROC曲線探究血清TREM1、TLR4水平對(duì)肺曲霉菌病患者的診斷價(jià)值。ROC曲線顯示,血清TREM1水平預(yù)測(cè)肺曲霉菌病的ROC曲線下面積為0.753(95%CI:0.608～0.897),截?cái)嘀禐?51.387 ng/L,其敏感度為56.67%,特異度為84.21%,準(zhǔn)確度為 67.35% ;血清TLR4水平預(yù)測(cè)肺曲霉菌病的ROC曲線下面積為0.865(95%CI:0.761～0.969),截?cái)嘀禐?.707 ng/mL,其敏感度為76.67%,特異度為89.47%,準(zhǔn)確度為 81.63% ;兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)肺曲霉菌病的ROC曲線下面積為0.898(95%CI:0.810～0.986),其敏感度為90.00%,特異度為78.95%,準(zhǔn)確度為85.71%(見(jiàn)圖1)。血清TLR4水平與TREM1+TLR4 ROC曲線下面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.944,P=0.345);與血清TREM1水平相比,TREM1+TLR4 ROC曲線下面積升高(Z=2.089,P=0.037)。血清TREM1水平敏感度、準(zhǔn)確度均低于TREM1+TLR4(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

圖1 血清TREM1、TLR4水平預(yù)測(cè)肺曲霉菌病的ROC曲線

表3 血清TREM1、TLR4水平及兩者聯(lián)合對(duì)肺曲霉菌病診斷價(jià)值的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度比較(%)

四、研究組、肺部感染組、健康對(duì)照組血清炎性因子比較

健康對(duì)照組與研究組血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);健康對(duì)照組與肺部感染組血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);肺部感染組與研究組血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表4);研究組用藥前與用藥后血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表4 研究組、肺部感染組、健康對(duì)照組血清炎性因子比較

表5 研究組用藥前后血清炎性因子比較

討 論

PA患者在感染早期,其外周循環(huán)中即會(huì)出現(xiàn)各種炎癥因子的改變,可作為早期診斷備選生物標(biāo)志物。且血清炎癥因子的檢測(cè)具有廉價(jià)、簡(jiǎn)單,可操作性強(qiáng)、研究?jī)r(jià)值高,應(yīng)用前景廣等優(yōu)點(diǎn),值得進(jìn)一步研究探索[15-16]。TREM-1在含有曲霉菌肉芽腫中有表達(dá),提示該受體可能參與宿主的抗真菌反應(yīng);進(jìn)一步的研究表明,TREM-1在真菌感染的肺中調(diào)節(jié)對(duì)煙曲霉的免疫應(yīng)答,明確揭示了TREM-1在真菌感染中的作用[17-18]。在曲霉菌感染患者體內(nèi),TLR4能夠識(shí)別受損組織和壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性病原分子,進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[5,19];而TREM-1作為煙曲霉炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子;可調(diào)節(jié)對(duì)感染的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng),從而協(xié)同和放大TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生,加強(qiáng)炎癥反應(yīng)過(guò)程[20-23];有研究指出TREM-1激活后與TLR4協(xié)同作用,通過(guò)激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、酪氨酸磷酸化來(lái)促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,如 白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL- 12p40和腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor alpha,TNF-α )等[24-25]。因此本研究通過(guò)檢測(cè)血清TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的表達(dá)水平,以期早期發(fā)現(xiàn)肺曲霉菌感染患者,為患者治療提供一定參考依據(jù)。在本研究中肺曲霉菌病患者血清中TREM1、TLR4水平與健康對(duì)照組、肺部感染組相比升高,表現(xiàn)出高表達(dá),且肺部感染組與健康對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2);提示曲霉菌侵入肺組織后誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng),進(jìn)而影響TREM1、TLR4水平。Bernal-Martínez L.等[7]研究中指出TREM1水平在IPA患者體內(nèi)是升高的,與本研究結(jié)果相符 ;并通過(guò)進(jìn)一步研究表明,患者血清中TREM1水平高于251.387ng/L、TLR4水平高于6.707 ng/mL在臨床上應(yīng)該受到重視,提示患者感染肺曲霉菌病的概率升高;而且TREM1+TLR4 ROC曲線下面積高于血清TREM1 ROC曲線下面積,敏感度、準(zhǔn)確度高于血清TREM1敏感度、準(zhǔn)確度(見(jiàn)圖1、表3)。表明兩者聯(lián)合診斷可使診斷價(jià)值更高,綜合兩者指標(biāo)對(duì)于提前診斷肺曲霉菌病更有價(jià)值。

曲霉菌入侵肺組織引起的免疫反應(yīng):呼吸道上皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(PRRs) 識(shí)別曲霉菌表面上多種病原體相關(guān)分子模式(PAMPs),兩者識(shí)別后曲霉菌抗原被樹(shù)突狀細(xì)胞處理并遷移到局部淋巴結(jié),隨后將真菌肽呈現(xiàn)給曲霉菌特異性的原始CD4+T細(xì)胞,并誘導(dǎo)其分化為輔助性T細(xì)胞亞群1(help T cell 1,Th1)細(xì)胞,輔助性T細(xì)胞亞群2(help T cell 2,Th2)細(xì)胞,輔助性T細(xì)胞亞群17(help T cell 17,Th17)細(xì)胞,這些效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17等)來(lái)對(duì)抗曲霉菌感染[26-27]。中性粒細(xì)胞(Neutrophilicgranulocyte ,NEU)在機(jī)體對(duì)抗曲霉菌感染中也扮演著重要角色,由肺泡巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、NK細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞)產(chǎn)生的前炎因子介導(dǎo)募集,通過(guò)氧化及非氧化途徑殺死出芽的煙曲霉孢子及菌絲[28]。因此本研究通過(guò)檢測(cè)肺曲霉菌病血清炎癥細(xì)胞因子水平來(lái)探究上述指標(biāo)能否為曲霉菌感染的早期診斷和治療提供臨床依據(jù)。有研究指出,IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平在曲霉菌感染早期升高,IL-2、TNF-α、IFN-γ由Th1細(xì)胞分泌,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,增加機(jī)體對(duì)曲霉菌的抵抗力;IL-4、IL-6、IL-10由Th2細(xì)胞分泌,主要介導(dǎo)體液免疫,抑制Th1型淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答;Th1、Th2細(xì)胞之間的平衡共同維護(hù)機(jī)體免疫功能正常狀態(tài)[29]。IL-17由Th17細(xì)胞分泌,而Th17細(xì)胞在IPA中的具有防御和破壞雙重作用,因患者的免疫狀態(tài)、免疫反應(yīng)細(xì)胞、模式受體的不同而出現(xiàn)差異[30]。本研究中肺曲霉菌病患者血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平均顯著高于對(duì)照組,表明曲霉菌侵入機(jī)體后,激活機(jī)體免疫反應(yīng),誘導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞因子的分泌;肺部感染組與研究組相比較患者血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,肺部感染組上述炎性因子水平均高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;進(jìn)一步研究表明肺曲霉菌病患者抗曲霉菌藥物治療14天后的血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17水平與抗曲霉菌藥物治療前相比均顯著降低,表明抗曲霉菌藥物治療兩周后,患者炎癥因子水平降低。故與其他病原體引起的肺部感染相比較,肺曲霉菌病患者血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平變化無(wú)特異性;而TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的變化具有特異性,故對(duì)于肺曲霉菌病的診斷具有一定價(jià)值。因肺曲霉菌病的早期診斷比較困難,在疾病早期大多提前采取經(jīng)驗(yàn)性用藥,故研究組可收集的標(biāo)本量較少,并且目前關(guān)于TREM1和TLR4在肺曲霉菌病中的研究較少,所以本研究的結(jié)果僅作為臨床早期診斷肺曲霉菌病的一項(xiàng)參考指標(biāo),還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)驗(yàn)證其診斷價(jià)值。

結(jié) 論

肺曲霉菌病患者血清中TREM1、TLR4水平升高,對(duì)臨床早期診斷肺曲霉菌病具有一定參考價(jià)值,且兩者聯(lián)合診斷可使診斷價(jià)值更高;血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平在肺曲霉菌病患者體內(nèi)早期升高,可以反映肺曲霉菌病患者抗曲霉菌藥物治療的效果。本研究還存在一定局限性,未能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)上述指標(biāo)在病程中的變化,而且還受到樣本例數(shù)的限制,因此擴(kuò)大樣本量、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)上述指標(biāo)變化是本研究接下來(lái)的研究重點(diǎn)。