魏艷潔，趙憲東，王歡歡，賈宇夢(mèng)，隋麗麗，張大軍，欒天，王進(jìn)

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

熊果酸（Ursolic Acid，UA）是一種天然的烏蘇烷型五環(huán)三萜類化合物。近幾年熊果酸的研究在國(guó)內(nèi)外掀起熱潮，研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物學(xué)活性，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗糖尿病、抗心血管疾病、抗病原微生物及抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[1]。遺憾的是，熊果酸結(jié)構(gòu)本身存在水溶性差、生物利用度較低等缺點(diǎn)，因此在臨床上的應(yīng)用受到了非常大的限制。為了克服上述缺點(diǎn)，學(xué)者們對(duì)熊果酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，從而得到一系列熊果酸衍生物[2-3]。其中，Bilal 等[4]將熊果酸C3 位羥基氧化成酮，得到3-羰基熊果酸（圖1 黑色部分），接著將C2 位進(jìn)行羥醛縮合，引入不同的取代苯甲醛，將所有化合物與3-羰基熊果酸通過(guò)噻唑藍(lán)（MTT）法針對(duì)人肺癌細(xì)胞（A-549），乳腺癌細(xì)胞（MCF-7），結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116），血癌細(xì)胞（THP-1）四種腫瘤細(xì)胞以及人正常的上皮細(xì)胞（FR-2）進(jìn)行了抗增殖活性的測(cè)試。結(jié)果表明，絕大部分化合物針對(duì)上述四種腫瘤細(xì)胞的IC50值均低于熊果酸，但對(duì)FR-2 的IC50值高于熊果酸。其中，化合物1 活性最優(yōu)，其對(duì)A-549，MCF-7，HCT-116，THP-1 的IC50值分別為0.55、0.10、5.5、0.90 μmol/ L。1,2,3-三氮唑因其經(jīng)典的合成方法被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成與藥物研發(fā)中[5]。報(bào)道顯示在多種天然產(chǎn)物單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)中連接1,2,3-三氮唑片段其原有的生物學(xué)活性明顯提高[6-7]。因此，以熊果酸為結(jié)構(gòu)母體，將其氧化為3-羰基熊果酸，在羰基的鄰位引入不同取代的N1-苯基-1,2,3-三氮唑，該片段與化合物1 所拼接的苯基相比，因具有較多的氫鍵受體而更易與某些靶蛋白相結(jié)合，因此通常會(huì)具有更為良好的生物活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)5 步反應(yīng)合成4個(gè)新化合物，合成工藝成熟，收率理想，1,2,3-三氮唑的合成方法采用經(jīng)典的Click 環(huán)合法，操作簡(jiǎn)單。本實(shí)驗(yàn)合成路線可為相關(guān)領(lǐng)域的合成研究提供參考，并為開(kāi)發(fā)三唑類熊果酸衍生物提供借鑒。

圖1 化合物1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性Fig.1 Chemical structure and biological activity of compound 1

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑與儀器

試劑：疊氮化鈉、丙炔醇、抗壞血酸鈉、熊果酸，阿拉丁試劑、鹽酸、亞硝酸鈉、氯化鈉﹑五水硫酸銅、二氧化錳、三氧化鉻、硫酸、氫氧化鉀、乙醇、丙酮、異丙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、叔丁醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

儀器：DF-II 型集熱式磁力加熱攪拌器，BSA124S 型電子天平，RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，WFH-203B 型三用紫外分析儀，Axima CFR plus 型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，Bruker ARX-300核磁共振波譜儀。

1.2 目標(biāo)化合物的合成

目標(biāo)化合物的合成路線如圖2 所示。

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.2 The synthetic route of the target compounds

1.2.1 中間體A1-A4 的合成

將不同取代的苯胺（10 mmol）溶于10 mL 10%的鹽酸中，冰浴下滴加亞硝酸鈉溶液（1.035 0 g 的NaNO2溶于25 mL 的水中），滴畢，反應(yīng)0.5 h 后，滴加疊氮化鈉溶液（2.600 0 g 的NaN3溶于50 mL 的水中），3 h 后TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全（展開(kāi)劑為石油醚∶乙酸乙酯=15∶1，生成物Rf=0.8）；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取（10 mL× 3），合并有機(jī)相，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL × 3）后加入無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓蒸干，得淡黃色油狀物，收率95%～ 98%，無(wú)需純化直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

1.2.2 中間體B1-B4 的合成

不同取代的中間體A1-A4（9.5 mmol）與0.560 0 g 的丙炔醇溶于35 mL 的叔丁醇中，0.198 0 g的抗壞血酸鈉與0.125 0 g 的五水硫酸銅溶于35 mL的水中，合并上述叔丁醇與水溶液，室溫下攪拌過(guò)夜；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取（10 mL× 3），合并有機(jī)相，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL × 3）后加入無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓蒸干，得白色或淡黃色固體，收率89%～ 92%，無(wú)需純化直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

1.2.3 中間體C1-C4 的合成

不同取代的中間體B1-B4（8 mmol）溶于50 mL的丙酮中，加入10.000 0 g 的二氧化錳后回流反應(yīng)2 h 后TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全；抽濾，濾液減壓蒸干后經(jīng)硅膠色譜純化（石油醚-乙酸乙酯=5∶1）得白色固體，收率80%～ 82%。

1.2.4 3-羰基熊果酸的合成

熊果酸（1.0 mmol）溶于60 mL 的丙酮中，冰浴下緩慢滴加瓊斯試劑，直至反應(yīng)液呈現(xiàn)黃紅色并在10 min 內(nèi)不褪色，繼續(xù)反應(yīng)1 h，TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，滴加1 mL 的異丙醇淬滅瓊斯試劑，待反應(yīng)液呈綠色后抽濾，濾液減壓蒸干，加入50 mL 的乙酸乙酯，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL× 3）后加入無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓蒸干，得白色固體0.408 6 g，收率90%。

1.2.5 終產(chǎn)物（D1-D4）的合成

0.090 8 g 的3-羰基熊果酸與中間體C1-C4（物料比為1∶1.1）溶于15 mL 的無(wú)水乙醇中，加入0.016 8 g 的氫氧化鉀，室溫下反應(yīng)4 h 后TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，減壓蒸干溶劑，加入30 mL 的水，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至酸性，用乙酸乙酯萃?。?0 mL× 3），合并有機(jī)相，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL× 3）后加入無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓蒸干后經(jīng)硅膠色譜純化（石油醚-乙酸乙酯=5∶1）得白色固體收率76%～ 79%。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

本實(shí)驗(yàn)以不同取代的苯胺為起始物料，第一步為“一鍋法”，首先在酸性條件下被亞硝酸鈉還原為重氮苯，再被疊氮化鈉疊氮化生成不同的疊氮苯，本反應(yīng)應(yīng)嚴(yán)格控制疊氮化鈉溶液的滴速，防止過(guò)度放熱。第二步以中間體A 為原料，通過(guò)Click 反應(yīng)制得中間體B，將二價(jià)銅離子被抗壞血酸鈉還原為一價(jià)銅離子后催化環(huán)合反應(yīng)；本反應(yīng)探索了反應(yīng)溶劑對(duì)反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)使用叔丁醇﹑四氫呋喃這類與水互溶的有機(jī)試劑或二氯甲烷等與水分層的有機(jī)試劑均可發(fā)生該反應(yīng)，本反應(yīng)副產(chǎn)物少，目標(biāo)產(chǎn)物易于純化。第三步使用二氧化錳作為弱氧化試劑將不同的醇（中間體B1-B4）氧化為醛，本反應(yīng)在后處理中應(yīng)在抽濾濾紙上加適宜量的硅藻土，防止二氧化錳顆粒過(guò)細(xì)透過(guò)濾紙。最后將不同取代的醛（中間體C1-C4）在堿性條件下與3-羰基熊果酸通過(guò)克萊森-施密特縮合反應(yīng)得終產(chǎn)物，因3-羰基熊果酸與終產(chǎn)物極性較接近，與終產(chǎn)物較難通過(guò)色譜法分離，因此反應(yīng)過(guò)程中使中間體C 稍過(guò)量，過(guò)量的中間體C 可通過(guò)硅膠柱層析與終產(chǎn)物進(jìn)行分離，產(chǎn)品易于純化。

2.2 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征

目標(biāo)化合物的質(zhì)譜及核磁共振波譜數(shù)據(jù)如表1及圖3～ 5 所示，以D1 為例，在核磁氫譜數(shù)據(jù)中，化合物的化學(xué)位移8.05 的單重峰為1,2,3-三氮唑C5 位上的氫原子峰，當(dāng)苯環(huán)上引入硝基等強(qiáng)吸電子效應(yīng)基團(tuán)時(shí)，其化學(xué)位移相對(duì)較大（如D2 為8.18）。結(jié)合耦合常數(shù)可以確定，化學(xué)位移7.74 的雙重峰為與三唑相連苯環(huán)鄰位上的兩個(gè)氫原子峰，7.56 的雙重峰為與三唑相連苯環(huán)間位上的兩個(gè)氫原子峰，化學(xué)位移7.50 的單重峰為與1,2,3-三氮唑C4 位相連碳原子上的氫原子峰，化學(xué)位移5.35 的單重峰為熊果酸母體C12 位雙鍵上的氫原子峰，其余均為熊果酸環(huán)上或角甲基的氫原子峰；結(jié)合核磁共振碳譜的碳原子總數(shù)以及質(zhì)譜的分子量測(cè)試結(jié)果表明目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)均正確。

圖3 化合物D1 的核磁共振氫譜圖Fig.3 1H-NMR spectra of compound D1

圖4 化合物D1 的核磁共振碳譜圖Fig.4 13C-NMR spectra of compound D1

圖5 化合物D1 的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of compound D1

3 小結(jié)

經(jīng)5 步反應(yīng)制得4 個(gè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新型熊果酸衍生物，總收率46%～ 53%。本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容可為三唑類熊果酸衍生物的合成提供一定的參考。在后續(xù)的研究中可通過(guò)對(duì)該類化合物的生物學(xué)活性進(jìn)行探究，為新藥的開(kāi)發(fā)與研制提供有價(jià)值的借鑒。