張生琰，孟祥男

（綠葉生命科學(xué)集團(tuán)廣州派諾生物技術(shù)有限公司，廣州 510005）

重組蛋白疫苗是一類應(yīng)用基因重組技術(shù)將目標(biāo)病原微生物的保護(hù)性抗原重組到細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等不同的異源表達(dá)系統(tǒng)中，隨后這些表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)培養(yǎng)、增殖后，純化制備蛋白抗原可作為疫苗的活性成分[1]。該類疫苗不包含完整病原體，通常需添加佐劑來提高疫苗接種后的免疫反應(yīng)[2]。相比于傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗，重組蛋白疫苗具有穩(wěn)定性和安全性好、成本較低、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于乙型病毒性肝炎、人乳頭狀瘤病毒感染、百日咳、白喉、破傷風(fēng)（簡稱百白破）等多種傳染病的預(yù)防[3]。

截止2021 年底，重組蛋白疫苗在全球范圍內(nèi)有74 個上市銷售或處于注冊狀態(tài)，適應(yīng)癥包括乙型病毒感染、百白破、流感嗜血桿菌感染、流感病毒感染、腦膜炎奈瑟球菌感染、脊髓灰質(zhì)炎病毒感染等，其中中國原研疫苗有21 個，占比最高[4]。

當(dāng)前新型冠狀病毒大流行中，重組蛋白疫苗也發(fā)揮了重要的作用，在多種技術(shù)路線中重組蛋白疫苗項(xiàng)目的數(shù)量最多[5]。因此，重組蛋白疫苗是現(xiàn)階段和未來疫苗開發(fā)的主要方向之一，會有越來越多的重組蛋白疫苗進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化。本文針對重組蛋白疫苗的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)，結(jié)合GMP 和國家相關(guān)設(shè)計(jì)要求，對重組蛋白疫苗原液生產(chǎn)工藝流程和中試生產(chǎn)車間的布局進(jìn)行闡述，并提供原液中試車間設(shè)計(jì)案例分析。

1 原液中試車間的特征分析

1.1 特殊性

中試是產(chǎn)品從研發(fā)進(jìn)入到商業(yè)化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)?？蒲谐晒?jīng)中試后的產(chǎn)業(yè)化成功率能達(dá)到80%，而未經(jīng)中試的產(chǎn)業(yè)化成功率僅為30%左右[6]。生物制品在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)成功后進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，臨床實(shí)驗(yàn)申報(bào)樣品、I 期和II 期臨床樣品均需在中試車間生產(chǎn)，因此中試車間的設(shè)計(jì)需要符合cGMP 和相關(guān)法規(guī)的要求[7]。

中試車間生產(chǎn)規(guī)模較小，尚未達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，通常是對研發(fā)工藝50～ 100 倍的放大生產(chǎn)[8]。另外相比于商業(yè)化生產(chǎn)車間，中試車間具有產(chǎn)品不確定性和多產(chǎn)品共線等特點(diǎn)，需要支持產(chǎn)品工藝放大，這都增加了中試車間的設(shè)計(jì)難度。

1.2 工藝流程及特點(diǎn)

重組蛋白疫苗原液中試生產(chǎn)有以下特點(diǎn)：

（1）生產(chǎn)規(guī)模?。褐亟M蛋白疫苗劑量小，通常為20～ 50 ug/劑，因此生產(chǎn)規(guī)模相對單抗等治療性蛋白較小。目前，重組蛋白疫苗原液中試規(guī)模的發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器規(guī)模通常在50～ 200 L；

（2）生產(chǎn)周期長：從細(xì)胞復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)到發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器培養(yǎng)需要10～ 14 d，發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器中培養(yǎng)需要10～ 16 d，整個細(xì)胞培養(yǎng)過程歷時20～ 30 d；

（3）多產(chǎn)品共線：目前大多數(shù)公司的重組蛋白疫苗都在其平臺上工藝研發(fā)，會有同類型的多種疫苗陸續(xù)通過中試放大進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)，因此多產(chǎn)品共線是中試車間必然的選擇。同平臺的不同產(chǎn)品在工藝上也會有一定的差異，為防止換品種時的交叉污染，中試車間需要有良好的設(shè)計(jì)；

（4）完善的病毒控制：重組蛋白疫苗若采用哺乳動物細(xì)胞作為表達(dá)載體，需要考慮細(xì)胞或原材料中潛在引入病毒對產(chǎn)品質(zhì)量造成的影響，因此需要嚴(yán)格控制病毒引入的風(fēng)險(xiǎn)，還應(yīng)當(dāng)有病毒清除滅活的工藝設(shè) 置。

重組蛋白疫苗原液的生產(chǎn)工藝流程大致分為兩個階段：

（1）上游，從種子復(fù)蘇到澄清收獲。種子復(fù)蘇后擴(kuò)增培養(yǎng)，然后發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后真核體系澄清過濾收獲上清液，原核體系經(jīng)細(xì)胞破碎后澄清收獲；

（2）下游，從層析到原液。上游收獲液經(jīng)多步層析、超濾后得到原液。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還需考慮病毒滅活和病毒清除步驟。

1.3 生物安全要求

若CHO 細(xì)胞為原材料，需要考慮CHO 細(xì)胞潛在的病毒污染。CHO 細(xì)胞本身無生物學(xué)危害，屬于生物安全等級一級（ISPE），但需要防止其潛在的污染病毒的風(fēng)險(xiǎn)。病毒污染可能來源于細(xì)胞系本身，也有可能是從生產(chǎn)過程中引入的外源病毒[9]。應(yīng)采取合理的病毒滅活/去除工藝來預(yù)防潛在病毒污染。

2 工藝布局設(shè)計(jì)

2.1 布局設(shè)計(jì)遵循的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范

《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》；

GB 50457—2019《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)》；

GB 50073—2013《潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》；

GB 50016—2014《建筑設(shè)計(jì)防火規(guī)范》。

2.2 設(shè)計(jì)原則

（1）滿足GMP 基本要求：GMP（2010 修訂版）的“廠房與設(shè)施”一章中第一節(jié)第一條（原文第三十八條）規(guī)定：“廠房的選址、設(shè)計(jì)、布局、建造、改造和維護(hù)必須符合藥品生產(chǎn)要求，應(yīng)當(dāng)能夠最大限度地避免污染、交叉污染、混淆和差錯，便于清潔、操作和維護(hù)”。按照工藝流程布局，平面布局合理，嚴(yán)格劃分區(qū)域，防止混淆、防止交叉污染，方便生產(chǎn)操作。

（2）滿足操作需求：溶液配制區(qū)、準(zhǔn)備清洗區(qū)與各功能區(qū)需布置合理，滿足準(zhǔn)備的器具、配制的緩沖液或培養(yǎng)基方便進(jìn)入各自功能區(qū)。GMP（2010修訂版）的“設(shè)備”一章中第三節(jié)第一條（原文第七十九條）規(guī)定：“設(shè)備的維護(hù)和維修不得影響產(chǎn)品質(zhì)量”。車間設(shè)備擺放設(shè)置合理，有合理的間距便于操作和檢修。

（3）滿足生物安全要求：重組蛋白疫苗生產(chǎn)中有工程菌或潛在的宿主病毒，因此在車間設(shè)計(jì)中要考慮嚴(yán)格分開有生物活性區(qū)和無生物活性區(qū)。GMP（2010 修訂版）生物制品（附錄3）的“生產(chǎn)管理”一章中第五十二條規(guī)定：使用二類以上病原體進(jìn)行生產(chǎn)時，對產(chǎn)生的污物和可疑污染物品應(yīng)當(dāng)在原位消毒，完全滅活后方可移出工作區(qū)。有活性區(qū)的生產(chǎn)中產(chǎn)生的固體廢物和廢水需要滅活處理，廢氣需要過濾后排出。

（4）滿足潔凈分區(qū)要求：種子復(fù)蘇擴(kuò)增是敞口無菌操作，需在C 級背景下完成；發(fā)酵/細(xì)胞培養(yǎng)、純化在D 級或C 級環(huán)境下完成；溶液配制、準(zhǔn)備清洗在D 級環(huán)境下完成；除菌過濾在A 級單向流保護(hù)下完成。

（5）滿足安全消防要求：需要滿足安全疏散、防火分區(qū)的相關(guān)規(guī)定。

2.3 生產(chǎn)區(qū)域劃分

根據(jù)工藝流程，重組蛋白疫苗原液車間分為種子復(fù)蘇擴(kuò)增、發(fā)酵/培養(yǎng)、純化、溶液配制、準(zhǔn)備清洗等功能區(qū)域。各功能區(qū)域布置需按照工藝流程展開，潔凈區(qū)相對集中，工藝路線順暢、人流物流分開、物流路線短、不迂回、不折返。

2.4 人、物流的設(shè)計(jì)

GMP（2010 修訂版）的“廠房與設(shè)施”一章中第一節(jié)第三條（原文第四十條）規(guī)定：“廠區(qū)和廠房內(nèi)的人、物流走向應(yīng)當(dāng)合理”。人流和物流嚴(yán)格分開，若空間允許，人、物流宜采用單向流設(shè)計(jì)。

（1）有生物活性的區(qū)域：人流和物流的進(jìn)出宜獨(dú)立；人員經(jīng)緩沖間、更衣間、氣鎖間進(jìn)入各功能區(qū)，操作結(jié)束后經(jīng)退更間、氣鎖間、緩沖間退回CNC 區(qū)，各出入口設(shè)置門禁；物料經(jīng)物凈間、物流氣鎖間進(jìn)入各功能區(qū)，操作結(jié)束后固體廢物經(jīng)各區(qū)域的滅活設(shè)備滅活后傳出潔凈區(qū)。

（2）無生物活性的區(qū)域：人流和物流相互獨(dú)立；人員經(jīng)緩沖間、更衣間進(jìn)入各功能區(qū)，操作結(jié)束后沿原路經(jīng)更衣間、緩沖間退出潔凈區(qū)；物料經(jīng)物凈間、物流氣鎖間進(jìn)入各功能區(qū)，操作結(jié)束后固體廢物沿原路經(jīng)物流氣鎖間、物凈間傳出潔凈區(qū)。

2.5 生物安全控制

（1）有活性區(qū)和無活性區(qū)分開，有毒區(qū)和無毒區(qū)分開，工藝操作區(qū)和溶液配制區(qū)、準(zhǔn)備清洗區(qū)等生產(chǎn)輔助區(qū)分開。

（2）采用一次性培養(yǎng)袋、一次性儲液袋、無菌連接器等一次性設(shè)備最大限度降低污染和交叉污染。

（3）有活性區(qū)的固體廢物滅活后退出集中處理，廢水收集后滅活再排放。

（4）根據(jù)工藝各階段不同污染水平，劃分不同的功能區(qū)域，設(shè)置獨(dú)立的空間和空調(diào)系統(tǒng)。有生物活性區(qū)和無生物活性區(qū)、有毒區(qū)和無毒區(qū)采用物理隔離的措施，不同潔凈級別間維持法規(guī)要求的壓差梯度。有生物活性的區(qū)域，排風(fēng)需經(jīng)過濾處理后排放。

3 案例分析

圖1 為依據(jù)以上設(shè)計(jì)理念設(shè)計(jì)的重組蛋白疫苗原液中試車間工藝布局圖。本項(xiàng)目采用哺乳動物細(xì)胞系為原材料，經(jīng)種子復(fù)蘇擴(kuò)增、反應(yīng)器培養(yǎng)、澄清過濾、層析、病毒滅活、超濾、除病毒過濾等步驟制得原液，該工藝流程具有代表性。為滿足中試車間多產(chǎn)品共線、多品種生產(chǎn)、產(chǎn)品不確定的需求，最大限度提高中試車間的利用率，本車間采用鏡像設(shè)計(jì)的思路，平行設(shè)計(jì)兩條相互獨(dú)立的原液中試規(guī)模生產(chǎn)線，配液區(qū)、清洗準(zhǔn)備區(qū)等生產(chǎn)輔助區(qū)為兩條生產(chǎn)線共用區(qū)域，這樣可以節(jié)省車間面積，降低建設(shè)成本，但不影響生產(chǎn)。

圖1 重組蛋白疫苗原液中試車間工藝布局圖Fig.1 Process layout diagram of pilot plant for stock solution of recombinant protein vaccine

3.1 平面布局

設(shè)計(jì)時應(yīng)用了國際上通用的模塊化設(shè)計(jì)思路，按照工藝流程將生產(chǎn)區(qū)域劃分開，依次布置種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)、細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)、除病毒過濾前純化區(qū)、除病毒過濾后純化區(qū)、生產(chǎn)輔助區(qū)。

（1）種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)為有生物活性區(qū)。細(xì)胞種子從液氮罐取出后傳遞至復(fù)蘇擴(kuò)增間，然后完成細(xì)胞的復(fù)蘇和擴(kuò)增培養(yǎng)，該區(qū)域的操作均為敞口操作，需在生物安全柜進(jìn)行，背景環(huán)境為C 級。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)為有生物活性區(qū)，環(huán)境的潔凈級別為D 級。該區(qū)域包括細(xì)胞培養(yǎng)間和澄清過濾間，均屬于上游生產(chǎn)區(qū)，與下游嚴(yán)格物理隔離。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞培養(yǎng)液運(yùn)送至澄清過濾間進(jìn)行澄清過濾，澄清過濾后上清經(jīng)穿墻管輸送至下游生產(chǎn)區(qū)。

GMP（2010 修訂版）生物制品（附錄3）的“廠房與設(shè)備”一章中第二十一條規(guī)定：“使用密閉系統(tǒng)進(jìn)行生物發(fā)酵的可以在同一區(qū)域同時生產(chǎn)，如單克隆抗體和重組DNA 制品”。因此細(xì)胞培養(yǎng)間留有充足的空間來放置2～ 3 臺一次性生物反應(yīng)器，能夠滿足兩臺以上的生物反應(yīng)器在同一區(qū)域內(nèi)同時生產(chǎn)，不但解決了房間因隔斷過多導(dǎo)致利用率低的問題，還能夠提高車間的使用靈活性。

（3）下游生產(chǎn)區(qū)包括除病毒過濾前純化區(qū)和除病毒過濾后純化區(qū)，除病毒過濾前純化區(qū)屬于有毒區(qū)，除病毒過濾后純化區(qū)屬于無毒區(qū)，兩個區(qū)域嚴(yán)格物理隔離，環(huán)境的潔凈級別為C 級。在下游生產(chǎn)區(qū)，常規(guī)的生產(chǎn)工藝包括層析、超濾、病毒滅活及除病毒過濾等。該區(qū)域工藝操作復(fù)雜、人員較多、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)批次更換頻繁，因此對人員管理的要求較高，宜按照工藝流程布局房間，以避免交叉污染和產(chǎn)品污染。中試車間的產(chǎn)品不確定，工藝路線不定，因此各區(qū)域應(yīng)預(yù)留充足的房間，房間有足夠的空間，以滿足不同產(chǎn)品的生產(chǎn)。

（4）生產(chǎn)輔助區(qū)，該區(qū)域包括物料暫存間、稱量間、培養(yǎng)基配制間、緩沖液配制間、清洗間、滅菌間等，環(huán)境的潔凈級別為D 級。為滿足不同品種的生產(chǎn)，培養(yǎng)基和緩沖液的配制和暫存均采用一次性儲液袋，有較好的工藝靈活性。兩條原液生產(chǎn)線共用一個生產(chǎn)輔助區(qū)，但培養(yǎng)基配制間和緩沖液配制間為兩條線各配置一套的設(shè)計(jì)，便于人員的操作和管理。

3.2 人流設(shè)計(jì)

（1）種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)、細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)及除病毒過濾前純化區(qū)：該區(qū)域人流進(jìn)出設(shè)計(jì)為回字形，人員進(jìn)出共用一個緩沖間，人員進(jìn)入依次經(jīng)緩沖間、更衣間、進(jìn)入氣鎖間，人員退出依次經(jīng)退更間、退出氣鎖間、緩沖間。人員進(jìn)出嚴(yán)格分開，防止交叉污染。

（2）除病毒過濾后純化區(qū)和生產(chǎn)輔助區(qū)：該區(qū)域?yàn)闊o毒區(qū)，人員進(jìn)入依次經(jīng)緩沖間、更衣間，人員退出為沿原路返回。

3.3 物流設(shè)計(jì)

（1）種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)：該區(qū)域進(jìn)入的物料均為小物品，如細(xì)胞凍存管、移液槍頭、移液管、小體積培養(yǎng)基等，因此物料傳遞應(yīng)用傳遞窗，能夠控制污染的風(fēng)險(xiǎn)。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)、下游生產(chǎn)區(qū)及生產(chǎn)輔助區(qū)：該區(qū)域物料進(jìn)入依次經(jīng)物凈間、物流氣鎖間，物料退出為原路返回。物料進(jìn)出均需拆外包裝，外表擦拭消毒后傳遞。

3.4 污物流設(shè)計(jì)

（1）種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)和細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)：該區(qū)域的污物經(jīng)潔凈走廊傳遞到滅活間，滅活后間在CNC 區(qū)，因此污物滅活后可直接運(yùn)送到污物暫存間。

（2）除病毒過濾前純化區(qū)：該區(qū)域的污物經(jīng)潔凈走廊傳遞到滅活間，滅活后間在生產(chǎn)輔助區(qū)一側(cè)。部分可重復(fù)使用的塑料桶、不銹鋼桶等器具在滅活后直接運(yùn)送到生產(chǎn)輔助區(qū)的清洗間，用器具清洗機(jī)清洗后存放。

（3）除病毒過濾后純化區(qū)和生產(chǎn)輔助區(qū)：該區(qū)域?yàn)闊o毒區(qū)，污物無需滅活處理，裝袋密封后清潔消毒經(jīng)物流退出路徑傳出到CNC 區(qū)，然后運(yùn)送到污物暫存間。

3.5 空調(diào)分區(qū)

GMP（2010 修訂版）生物制品（附錄3）的“廠房與設(shè)備”一章中第二十三條規(guī)定：“有菌（毒）操作區(qū)應(yīng)當(dāng)有獨(dú)立的空氣凈化系統(tǒng)。來自病原體操作區(qū)的空氣不得循環(huán)使用；來自危險(xiǎn)度為二類以上病原體操作區(qū)的空氣應(yīng)當(dāng)通過除菌過濾器排放，過濾器的性能應(yīng)當(dāng)定期檢查”。

種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)、發(fā)酵/培養(yǎng)區(qū)、除病毒過濾前純化區(qū)均屬于有毒區(qū)，其中種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)、發(fā)酵/培養(yǎng)區(qū)屬于有生物活性區(qū)，各區(qū)域有生物活性暴露的風(fēng)險(xiǎn)。種子復(fù)蘇擴(kuò)增區(qū)、發(fā)酵/培養(yǎng)區(qū)、除病毒過濾前純化區(qū)、除病毒過濾后純化區(qū)、生產(chǎn)輔助區(qū)分別采用獨(dú)立的空調(diào)系統(tǒng)。

4 結(jié)束語

近年來，隨著新冠疫情的蔓延，國內(nèi)有越來越多的疫苗產(chǎn)品由小試工藝進(jìn)入中試，并且各企業(yè)的產(chǎn)品大多采用平臺工藝，陸續(xù)會有不同的產(chǎn)品進(jìn)入中試階段，因此建立一個滿足多產(chǎn)品共線、多品種生產(chǎn)需求的中試車間至關(guān)重要[10]。中試車間承擔(dān)了IND 申報(bào)樣品、臨床I/II 期樣品的制備工作，其設(shè)計(jì)建設(shè)需符合cGMP 要求。工藝布局設(shè)計(jì)是中試車間設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，不僅需滿足中試車間對不同產(chǎn)品不同工藝流程的需求，還需符合各專業(yè)設(shè)計(jì)規(guī)范的要求，因此綜合各方面要求的設(shè)計(jì)方案才是最適合的方案[11]。

隨著重組蛋白疫苗生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展、生產(chǎn)設(shè)備自動化程度的提高、一次性設(shè)備的廣泛應(yīng)用，對中試車間的設(shè)計(jì)也提出更高的要求[12]。另外提高車間的經(jīng)濟(jì)性、減少車間能耗、降低勞動成本、提升車間利用率也是中試車間重點(diǎn)考慮的方向[13]。本文所提及的設(shè)計(jì)理念在后續(xù)的實(shí)踐中還需加以檢驗(yàn)并不斷修正。