王云燕 高偉鏗

(海南省中醫(yī)院 1心功能科,海南 ?？?571199;2臨床內(nèi)科)

心肌梗死(MI)是一種常見的缺血性急性心臟病,每年有50萬人以上新發(fā)MI〔1〕。MI后可觀察到多種局部改變,如心室重構(gòu)、心室壁結(jié)構(gòu)改變、非收縮性瘢痕組織形成等〔2〕。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展,MI的預(yù)后得到了一定程度的改善,死亡率也有所降低〔3〕。然而,作為一個(gè)全球性的問題,MI仍然是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因〔4〕,迫切需要?jiǎng)?chuàng)新的MI后恢復(fù)和再生治療藥物。MI是指心肌細(xì)胞因長(zhǎng)期缺血(缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏)引起的死亡〔5〕。心肌缺血缺氧后引起的損傷是心肌細(xì)胞不可逆損傷〔6〕。H9c2細(xì)胞是一種來源于大鼠胚胎心室肌細(xì)胞的細(xì)胞系,與原代心肌細(xì)胞有許多相似之處,研究通過在缺氧處理的H9c2細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn),探究心肌缺血的潛在治療方法〔7〕。又因成人心肌細(xì)胞增殖能力有限,這使誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖為治療MI的一種可能方案〔8〕。因此,缺氧處理后H9c2細(xì)胞增殖和凋亡的變化可作為潛在治療藥物的評(píng)價(jià)指標(biāo)?；ń?ZER)是從亞熱帶姜科植物中分離得到的一種天然化合物,具有抗氧化、抗炎等多種生物活性〔9〕。ZER還具有調(diào)控血管生成的作用,是治療癌癥的抗腫瘤藥物,可逆轉(zhuǎn)多種癌細(xì)胞的增殖和侵襲作用〔10〕。本研究旨在探究ZER對(duì)缺氧H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用及潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 H9c2細(xì)胞系(CRL-1446TM)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)庫(ATCC)。ZER購(gòu)自上海滬崢有限公司〔分子式:C15H22O,分子量:218.34,純度:高效液相色譜(HPLC)測(cè)定≥98%〕;DEME培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司;二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;抗體B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-3、caspase-9、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸化(p)-MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p-ERK均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司(型號(hào):BB150-2TCS);流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER公司(型號(hào):CytoFLEX SRT);酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Lonza公司(型號(hào):LONZA ELx808);凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司(型號(hào):Gel Doc EZ)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 H9c2細(xì)胞于含有10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基(含有1%青霉素和鏈霉素)中,在37 ℃,含有95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d更換1次培養(yǎng)基。為刺激缺氧損傷,H9c2細(xì)胞在37 ℃,充滿94%N2、5%CO2和1%O2的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ZER溶解于二甲基亞砜(DMSO)中,配成10 mmol/L的母液,使用DEME培養(yǎng)基稀釋,使最終處理濃度為:0、8、16、24 μmol/L〔10〕。從缺氧處理開始時(shí)分別使用不同濃度(0、8、16、24 μmol/L)的ZER培養(yǎng)36 h,依次作為對(duì)照組、8、16、24 μmol/L ZER組,另設(shè)空白組不做缺氧處理。

1.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞以5×103個(gè)/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,過夜培養(yǎng)后,分別給予缺氧24、36、48 h和各組細(xì)胞缺氧36 h處理,后使用10%的CCK-8溶液替代DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后,將96孔板放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm處的吸光度(A)。細(xì)胞活力=A缺氧24 h/A缺氧0 h×100%;細(xì)胞活力=A實(shí)驗(yàn)組/A空白組×100%。

1.4膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)雙染色法分析H9c2細(xì)胞的凋亡率 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37 ℃孵育過夜后,給予缺氧和ZER處理。離心,收集細(xì)胞,使用提前預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,而后添加100 μl的結(jié)合緩沖液制備形成細(xì)胞懸浮液,后添加5 μl Annexin Ⅴ-FITC和PI對(duì)細(xì)胞染色,在室溫避光孵育15 min后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色細(xì)胞,FlowJo軟件分析各組H9c2細(xì)胞凋亡百分比。

1.5Western印跡檢測(cè)凋亡及MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 使用添加1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液提取處理后的各組H9c2細(xì)胞蛋白質(zhì),用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的蛋白濃度。添加蛋白緩沖液在高溫水浴鍋中煮沸15 min,使蛋白變性,隨后,將變性后蛋白點(diǎn)膠,上樣,每孔25 μl。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上進(jìn)行分離,并通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h后,使用PBS沖洗3次后,添加PBS稀釋的抗體Bax、caspase-3、caspase-9、MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK低溫?fù)u床孵育過夜。隔天使用PBS沖洗PVDF膜,后添加二抗(山羊抗兔IgG-HRP)室溫孵育2 h,再次使用PBS沖洗。后按照試劑盒說明添加電化學(xué)發(fā)光(ECL)混合液檢測(cè)免疫反應(yīng)信號(hào),使用ImageJ軟件對(duì)免疫強(qiáng)度(條帶灰度)進(jìn)行定量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度/內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)重復(fù)均超過3次,采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同缺氧時(shí)間對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響 缺氧0、12、24、36、48 h H9c2細(xì)胞活力分別為:(100.12±2.40)%、(98.38±1.34)%、(75.12±8.79)%、(41.56±4.69)%、(26.45±3.15)%。與缺氧0 h相比,缺氧24、36和48 h的H9c2細(xì)胞存活率顯著降低(F=189.753,P=0.000,n=4),而細(xì)胞活力在缺氧處理12 h內(nèi)基本保持不變,但在缺氧處理36 h時(shí)細(xì)胞活力下降到一半,因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中將細(xì)胞置于低氧條件下孵育36 h。

2.2ZER對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧損傷的影響 與空白組相比,其余4組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05);與對(duì)照組相比,ZER處理組可顯著提高細(xì)胞活力(P<0.05),且呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)。與空白組相比,其余4組H9c2細(xì)胞的凋亡率及Bax、caspase-3和caspase-9的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與對(duì)照組相比,ZER處理組可顯著降低凋亡率和H9c2細(xì)胞中Bax、caspase-3和caspase-9的蛋白表達(dá)(P<0.05),且均呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)。說明ZER可減輕H9c2細(xì)胞的缺氧損傷。見表1、圖1、圖2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ZER對(duì)缺氧H9c2細(xì)胞凋亡率的影響

1～5:空白組、對(duì)照組、8 μmol/L ZER組、16 μmol/L ZER組、24 μmol/L ZER組;圖3同

表1 各組H9c2細(xì)胞活力、凋亡率及Bax、caspase-3和caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3ZER對(duì)缺氧H9c2細(xì)胞中MAPK/ERK信號(hào)通路的影響 與空白組相比,其余4組H9c2細(xì)胞中MAPK、ERK的蛋白相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05),而p-MAPK、p-ERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);與對(duì)照組相比,ZER處理組可顯著提高p-MAPK、p-ERK的蛋白表達(dá)(P<0.05),且呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05),而對(duì)MAPK、ERK的蛋白表達(dá)無影響(P>0.05)。見圖3、表2。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞中MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)

表2 各組H9c2細(xì)胞中MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

MI是指心肌細(xì)胞因長(zhǎng)時(shí)間缺血而死亡〔11〕。缺氧是MI的主要風(fēng)險(xiǎn)之一,是氧氣不足以支持新陳代謝的一種狀態(tài)〔12〕。在缺氧條件下,能量代謝從線粒體呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧糖酵解,同時(shí)引起大量的生理和病理反應(yīng),導(dǎo)致酸中毒和細(xì)胞壞死〔13〕。本研究結(jié)果顯示,缺氧時(shí)間可能與細(xì)胞損傷的程度呈正相關(guān);缺氧處理后H9c2細(xì)胞增殖受到抑制同時(shí),凋亡增強(qiáng),說明H9c2細(xì)胞缺氧損傷模型構(gòu)建成功。

生姜作為最古老的草藥之一,因其具有抗癌作用備受關(guān)注〔14〕。幾千年來,中國(guó)人一直把生姜作為治療頭痛、惡心和感冒的傳統(tǒng)藥物〔15,16〕,在西方和地中海地區(qū),生姜因含有抗炎化合物而被用于治療肌肉疼痛、關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎,同時(shí)其對(duì)牙齦炎癥、牙痛、哮喘、腦卒中、糖尿病和便秘也具有一定的作用〔17〕。ZER是從生姜的根莖中提取的揮發(fā)油得到的,約占59%〔9〕。研究數(shù)據(jù)表明,ZER具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡的作用,具調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多項(xiàng)功能〔18〕。故對(duì)ZER研究一直是一種熱點(diǎn),ZER可用于治療不同類型的癌癥,如結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌和肝癌,而且與正常細(xì)胞相比,其不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,還可顯示出對(duì)癌細(xì)胞的選擇性作用〔9〕。本研究結(jié)果表明,ZER處理可通過促進(jìn)H9c2細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡,從而減輕H9c2細(xì)胞的缺氧損傷。

在細(xì)胞缺血損傷中,多種激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡過程,包括:PI3K/AKT、MAPK/ERK和JAK/STAT〔19〕。Yan等〔20〕研究證明,丙泊酚在心肌細(xì)胞中通過激活MAPK/ERK通路呈劑量依賴式降低心肌細(xì)胞的凋亡率,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用。Ren等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),厄貝沙坦可通過調(diào)控MAPK/ERK信號(hào)通路中ERK的基因和蛋白水平進(jìn)而改善心肌病理損傷,對(duì)大鼠心臟起到保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞缺氧損傷后,MAPK/ERK通路的激活可能被抑制;MAPK/ERK通路可被ZER激活,說明ZER可通過激活MAPK/ERK通路削弱細(xì)胞損傷。

綜上,ZER可促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,且這種作用可能是通過激活MAPK/ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。但本研究并未深入探究ZER是如何通過影響MAPK/ERK信號(hào)通路表達(dá)進(jìn)而對(duì)心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用的,還需更進(jìn)一步的研究。