柳麗 梅葵 柳建

(六盤水市人民醫(yī)院 1心血管內(nèi)科,貴州 六盤水 553000;2內(nèi)分泌科;3重癥醫(yī)學(xué)科)

心力衰竭指在多種致病因素作用下,心臟泵功能發(fā)生異常變化,導(dǎo)致心輸出量絕對(duì)減少或相對(duì)不足,不能滿足機(jī)體組織細(xì)胞代謝需要,患者有明顯臨床癥狀和體征的病理過程〔1～3〕。主要表現(xiàn)為呼吸困難、肺水腫、心源性休克和血流動(dòng)力學(xué)障礙等。炎癥反應(yīng)、心肌組織心肌纖維化是導(dǎo)致心功能損傷,引起心力衰竭的主要原因〔4,5〕。白茅根具有抗炎、益氣活血、阻止膠原蛋白合成等功能,能夠減輕患者心力衰竭指標(biāo)及炎癥水平等,但作用機(jī)制尚不明確。心肌纖維化包括間質(zhì)纖維化和心肌間質(zhì)膠原沉積,屬于多種不同的心臟疾病發(fā)展到一定時(shí)期時(shí)共同病理改變〔6,7〕。本研究分析白茅根取物對(duì)心力衰竭大鼠心肌纖維化的干預(yù)作用及對(duì)Sirt1信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取45只SD健康雄性大鼠(河南省疾病預(yù)防控制中心,使用許可證號(hào):SYXK(豫)2017-0009),8～9周齡;體質(zhì)量185～220 g,平均(197.5±10.0)g。在溫度(22.0±2.6) ℃、濕度50%～55%環(huán)境中喂養(yǎng)1 w,正常飲水,規(guī)律光照12 h/d。主要試劑:取白茅根100 g,加水浸泡1 h,煮沸后煎30 min,過濾殘?jiān)偌铀?0 min后過濾合并兩次過濾,經(jīng)2 000 r/min,離心15 min。取上清液,濃縮至100 ml放置4 ℃冰箱保存。兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6購自上海酶聯(lián)生物研究所;兔抗人細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白(Sirt)1、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Fox)o1小鼠抗大鼠購自北京百奧萊科技有限公司;一抗兔抗鼠Ac-Foxo1購自艾美捷科技有限公司。

1.2建模及分組干預(yù) 正常組選取15只大鼠,其余30只建立心力衰竭大鼠心肌纖維化模型。模型組采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立舒張性心力衰竭(DHF)模型,用7號(hào)針頭平行置于腹主動(dòng)脈上,絲線扎緊后抽出針頭,術(shù)后腹主動(dòng)脈直徑由1.0～1.2 mm減少至0.7 mm左右;正常組僅游離腹主動(dòng)脈但不縮窄,其他操作與手術(shù)組相同。術(shù)后8 w,兩組分別按完全隨機(jī)分組法抽取3只大鼠通過超聲心動(dòng)圖及心導(dǎo)管檢測(cè)心臟舒張功能確立造模成功。建模過程中死亡2只,將剩余28只成模大鼠隨機(jī)分為模型組和白茅根組各14只。正常組給予溫生理鹽水灌胃處理,10 ml/(kg·d);模型組和正常組接受等體積生理鹽水灌胃處理;白茅根組給予白茅根湯處理10 ml/(kg·d),持續(xù)喂養(yǎng)8 w。

1.3HE 染色觀察心肌組織形態(tài) 采集靜脈血,2 000 r/min室溫離心 10 min,取上清液置于-20 ℃冰箱中保存待用。立即處死大鼠,取心肌組織,部分置于 4%多聚甲醛中固定,部分置于-80 ℃冰箱中保存待用。取出多聚甲醛中固定的心肌組織,制備常規(guī)石蠟切片后每組取部分切片經(jīng)脫蠟、水化處理后,蘇木素染色,鹽酸乙醇分化至返藍(lán),乙醇伊紅復(fù)染后脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡拍照。

1.4炎性因子水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6及心肌組織中纖維連接蛋白(FN)水平,取包被液適當(dāng)0.1 ml漢克平衡鹽溶液(HBS)-lg稀釋溶液加入含有聚苯乙烯反應(yīng)板。加蓋,放入4 ℃冰箱中,24 h,次日使用洗滌液洗滌,重復(fù)3次,甩干。將0.1 ml不同倍數(shù)血清加入每個(gè)孔中,同時(shí)將陽性和陰性對(duì)照血清加入,移去液體。洗滌,重復(fù)3次,甩干。再將每孔內(nèi)加入0.1 ml辣根過氧化物酶(HRP)-抗體HBS-lgG,稀釋,放置43 ℃溫箱中60 min,移去液體,使用洗滌液洗滌,3次,甩干;將各個(gè)孔中注入0.1 ml底物液,避光放置20 min。再將各孔中加入0.05 ml 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

1.5心肌纖維化指標(biāo)檢測(cè) 使用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量心肌纖維化相關(guān)指標(biāo),包括心肌血管周圍膠原與管腔面積比例(PVCA)、左心室重量指數(shù)(LVMI)、心肌膠原體積比例(CVF)等指標(biāo),隨機(jī)取每張心肌切片4個(gè)視野,取其平均值。

1.6心功能指標(biāo)和血流動(dòng)力學(xué) 采用無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)讀取左室舒張末期壓(LVEDP)和左心室收縮壓(LVSP)。

1.7Western印跡測(cè)定Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表達(dá)量 檢測(cè)心肌組織Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1蛋白表達(dá)水平,冰箱中取心肌組織,磨碎,蛋白提取試劑盒提取總蛋白,凝膠電泳分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉恒溫封閉2 h;對(duì)應(yīng)加入一抗Sirt1(1∶10 000)、Foxo1(1∶500)、Ac-Foxo1(1∶250)、人磷酸苷油酸脫氫酶(GADPH,1∶10 000),4 ℃孵育過夜;加入對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育2 h。蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1心肌組織HE染色 正常組心肌細(xì)胞排列整齊,肌原纖維完整,細(xì)胞核和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整;模型組心肌纖維化,細(xì)胞形態(tài)不完整,心肌細(xì)胞增生性炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯;白茅根組細(xì)胞排列較整齊、炎癥現(xiàn)象降低。見圖1。

圖1 3組心肌組織(HE染色,×400)

2.2各組血清炎性因子水平比較 與正常組相比,模型組和白茅根組血清TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,白茅根組血清TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清炎性因子及心肌纖維化指標(biāo)比較

2.3各組心肌纖維化指標(biāo)水平比較 與正常組相比,模型組和白茅根組LVMI、PVCA、CVF指標(biāo)水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,白茅根組上述指標(biāo)水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組心功能指標(biāo)和血流動(dòng)力學(xué)的比較 與正常組相比,模型組LVEDP水平明顯升高,LVSP水平明顯下降(P<0.05);與模型組相比,白茅根組LVEDP水平明顯降低,LVSP水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.5各組心肌組織Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1蛋白表達(dá)水平比較 與正常組相比,模型組和白茅根組Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表達(dá)明顯升高,Sirt1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,白茅根組上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組心功能指標(biāo)水平、心肌組織Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表達(dá)量比較

圖2 各組心肌組織Sirt1通路蛋白表達(dá)

3 討 論

心力衰竭是由于心排血量不足或心臟泵血功能受損功能發(fā)生障礙,導(dǎo)致心臟不能搏出同靜脈回流及機(jī)體組織代謝所需的血液供應(yīng)。心肌細(xì)胞減少是導(dǎo)致心肌功能障礙的關(guān)鍵因素〔8,9〕。因冠狀動(dòng)脈血管壁周圍纖維增生和管壁增厚使冠脈循環(huán)儲(chǔ)備和供血降低,進(jìn)而促使心肌細(xì)胞死亡和纖維化,是難治性心力衰竭的病理基礎(chǔ),是心血管疾病的主要死亡原因。

心力衰竭與中醫(yī)癥候怔忡、水腫、心悸、痰飲、心痹等疾病相似,孫思邈《備急千金藥房·脾臟脈論第一》中指出“心水者,身腫而少氣,不得臥,煩而躁,其陰大腫,反瘦”,治療上以益氣溫陽、益氣養(yǎng)陰、益氣活血、活血利水、活血化瘀為主。中醫(yī)認(rèn)為,白茅根性寒、味甘,可入肺經(jīng)、胃經(jīng)和膀胱經(jīng),具有涼血止血、清熱利尿的作用?！侗静菥V目》中記載,白茅根可“止吐衄諸血、傷寒噦逆、肺熱喘急、水腫黃疸、解酒毒”。研究發(fā)現(xiàn),白茅根提取物具有鎮(zhèn)痛抗炎、增強(qiáng)免疫功能、抑制毛細(xì)血管通透性增加、抗心肌缺血、降血壓、可降低全血黏稠度、降低血細(xì)胞聚集性、改善血流變性從而起到抗血栓效果〔10,11〕。本研究結(jié)果表明,白茅根提取物能夠調(diào)節(jié)心肌射血受損,對(duì)心肌組織起到保護(hù)的作用。

使用白茅根提取物治療心力衰竭大鼠心肌纖維化,LVMI、PVCA、CVF指標(biāo)水平較低,血清炎癥TNF-α、IL-6水平下降,LVMI、PVCA、CVF水平升高,表現(xiàn)為基質(zhì)沉積、纖維化現(xiàn)象越嚴(yán)重〔12,13〕。研究發(fā)現(xiàn),心肌纖維化伴隨炎癥水平升高,IL-6、TNF-α作為炎癥因子參與心肌細(xì)胞壞死過程,TNF-α可誘導(dǎo)IL-6釋放,IL-6能加強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性〔14,15〕;IL-6可影響心肌收縮力,TNF-α可介導(dǎo)心肌重構(gòu)和心肌收縮力。本研究提示,白茅根提取可減緩心肌纖維化、炎癥損傷體征,對(duì)心肌起到保護(hù)作用。

Sirt1與多種信號(hào)傳導(dǎo)通路中的蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等蛋白相互作用參與神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞衰老凋亡、糖脂代謝、炎癥氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程,發(fā)揮其對(duì)基因的調(diào)控功能和心血管的保護(hù)〔16,17〕。Sirt1水平降低使心肌細(xì)胞保護(hù)作用減弱是導(dǎo)致心功能病變的主要原因。Sirt1激活可抑制降低炎癥因子IL-6、TNF-α水平,實(shí)現(xiàn)對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠腦損傷。Foxo1是Foxo亞家族中發(fā)現(xiàn)最早的轉(zhuǎn)錄因子,在機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡、抵抗氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用〔18,19〕。Sirt1通過調(diào)節(jié)Foxo1蛋白去乙酰化作用,去乙?；?轉(zhuǎn)錄活性減弱,進(jìn)而參與疾病的發(fā)生使Foxo1與DNA結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性。Foxo1的水平能夠調(diào)控與骨骼肌萎縮相關(guān)蛋白,從而加重慢性心力衰竭導(dǎo)致的骨骼肌萎縮現(xiàn)象。研究指出,Foxo1介導(dǎo)途徑能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝疾病中以膠原蛋白沉積和纖維化蛋白表達(dá)形式出現(xiàn)的肝纖維化〔20,21〕。