梁浩 張娜 趙樂 霍明艷 王青松 王虹

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科,河北 承德 067000)

心房顫動(AF)是高血壓、心力衰竭、冠心病等心血管疾病常見的并發(fā)癥,能夠使患者的心功能受到損傷,并且可導(dǎo)致心房收縮功能下降、心房血栓及重要器官栓塞等,具有很高的發(fā)病率和致死率,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量〔1〕。心肌纖維化(MF)是心房重構(gòu)的主要特征,是AF發(fā)生的病理基礎(chǔ),其主要特征是心肌成纖維細(xì)胞(CF)增殖、分化為肌成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的大量沉積〔2〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是CF的增殖、分化和ECM的生成中重要的調(diào)節(jié)因子,是公認(rèn)的MF治療靶標(biāo)。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時,肌成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1增加,激活Smad家族成員(Smad)2和Smad3的磷酸化,進(jìn)而激活與肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序。而Smad7可以阻止肌成纖維細(xì)胞的形成〔3〕。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的20～25 nt的非編碼小RNA,其5′末端長為2～8個核苷酸序列能夠與靶基因3′-UTR堿基配對結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)。新近研究表明,心肌細(xì)胞的生長發(fā)育、心律失常、動脈粥樣硬化斑塊形成、心肌重構(gòu)等過程均與miRNA有關(guān)〔4〕。Gou等〔5〕發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-92a的表達(dá),可抑制缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而促進(jìn)心功能恢復(fù)。段卡丹等〔6〕發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-92a表達(dá),可降低活性氧(ROS)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達(dá),增加B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2表達(dá),抑制過氧化氫誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡。朱參戰(zhàn)等〔7〕發(fā)現(xiàn),微小RNA-21-5p的上調(diào),能夠靶向抑制Smad7表達(dá),促進(jìn)TGF-β1和纖連蛋白(Fibronecin)表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)MF,促進(jìn)房顫發(fā)生。薛貽敏等〔8〕發(fā)現(xiàn)微小RNA-21通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad7信號通路促進(jìn)慢性病毒性心肌炎小鼠MF。但是miR-92a是否通過調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路調(diào)控AF MF鮮有報道。本研究探討miR-92a是否通過調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路對AF大鼠MF產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠50只,購自賽業(yè)(固安)生物科技有限公司,體質(zhì)量200～220 g,生產(chǎn)許可證號:SYXK(冀)2021-005。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后用于實驗,飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為:室溫23～25 ℃、相對濕度55%～60%、12 h光照/12 h黑暗、正常飲水飲食。本研究目的及實驗操作經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(201905014)。

1.2主要試劑和儀器 Western印跡試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)、Masson染色試劑盒(上海碧云天生物有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司);實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(上海連橋生物科技有限公司);TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen-Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(Collagen-Ⅲ)抗體(美國CST公司);α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、成纖維細(xì)胞特異蛋白(FSP)-1、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(美國Santa Cruz公司);miR-92a、Smad7引物(上海生物工程技術(shù)有限公司);腺病毒載體(天津賽爾生物有限公司)。CKX41顯微鏡(日本Olympus公司);GeneAmp 9700q型RT-PCR儀(美國thermo公司);3K15低溫高速離心機(德國Sigma公司);165-8001蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司);SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3動物分組、模型制作及干預(yù) 50只大鼠隨機分為5組:對照組、AF組、轉(zhuǎn)染rAAV9-miR-92a-mimic-NC組(AAV-NC組)、轉(zhuǎn)染rAAV9-miR-92a-mimic組(AAV-miR-92a組)、轉(zhuǎn)染rAAV9-miR-92a-mimic-inhibitor組(AAV-inhibitor組)。模型制作:采用乙酞膽堿-氯化鈣(ACh-CaCl2)混合液尾靜脈注射法構(gòu)建大鼠AF模型。對照組:大鼠每天尾靜脈注射生理鹽水(1 ml/kg),共14 d;AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組、AAV-inhibitor組:每天尾靜脈注射ACh-CaCl2(60 μg/ml ACh和10 mg/ml CaCl2〔9〕,1 ml/kg),共14 d。干預(yù):AAV-NC組、AAV-miR-92a組、AAV-inhibitor組:分別在第1天尾靜脈注射rAAV9-miR-92a-mimic-NC、rAAV9-miR-92a-mimic、rAAV9-miR-92a-mimic-inhibitor(2×1011vg)1次。14 d后采用MedLab-U/4C501H系統(tǒng)記錄大鼠心電圖。AF組P波消失,代替為小F波(350～600次/min),表示大鼠AF造模成功(圖1)。超聲心動圖評估大鼠左心室重構(gòu)及功能。所有大鼠采用尾靜脈空氣栓塞方式處死,取其心臟組織,部分浸于4%多聚甲醛溶液中固定;部分分離和培養(yǎng)原代心房肌細(xì)胞;部分置于-80 ℃冰箱保存待測。

圖1 對照組、AF組心電

1.4生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶實驗 根據(jù)數(shù)據(jù)庫TargetScanHuman(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測miR-92a的與Smad7靶向相關(guān)。取AF組心肌組織,剪成小塊,加入胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化,離心后獲得原代心肌細(xì)胞。構(gòu)建Smad7的pGL3-Smad7-3′-UTR-野生型(WT)和pGL3-Smad7-3′UTR-突變型(MUT)質(zhì)粒。取對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞接種于6孔板,將上述質(zhì)粒分別與mimic-nc和miR-92a-mimic混合后共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞48 h。按試劑盒要求檢測熒光素酶活性。

1.5HE、Masson染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變 ①HE:取心房組織用4%多聚甲醛固定,將固定樣本用石蠟包埋,切成厚度為3 μm的切片,按照HE染色試劑盒說明書的操作步驟對石蠟切片進(jìn)行染色、脫水、透明及固定后,于400倍顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)并拍照,每組隨機挑選5個視野。②Masson:取上述石蠟切片,按照Masson染色試劑盒說明書的操作步驟對石蠟切片進(jìn)行經(jīng)Weigert鐵蘇木素染色、Masson返藍(lán)、麗春紅品紅染色,再經(jīng)苯胺藍(lán)染色、脫水、透明及固定后,于400倍顯微鏡下觀察心肌膠原纖維沉積情況并拍照,每組隨機挑選5個視野。

1.6免疫組化染色觀察大鼠心肌組織Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表達(dá) 取石蠟切片經(jīng)加熱熔蠟、脫水、抗原修復(fù),封閉后加入兔抗大鼠一抗Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ(1∶100)4 ℃孵育過夜。次日加入生物素標(biāo)記的二抗,室溫孵育20 min,加入鏈霉親和素酶,室溫孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明后用中性樹膠封片,于顯微鏡(×400)下觀察,每張切片隨機選擇5個不同視野,使用Image-Pro6.0軟件分析陽性染色面積。

1.7免疫熒光檢測大鼠心肌組織α-SMA、FSP-1的表達(dá) 石蠟切片處理同1.6,加入一抗α-SMA、FSP-1(1∶200)4 ℃孵育過夜,加入二抗室溫孵育1 h。沖洗后,將載玻片與DAPI孵育8 min。熒光顯微鏡(×400)下觀察,用Photoshop軟件進(jìn)行處理。

1.8qRT-PCR檢測心肌組織miR-92a、Smad7 mRNA表達(dá) 組織、細(xì)胞:使用TRIzol試劑、mirVana miRNA分離試劑盒分別提取各組癌組織、細(xì)胞總RNA、miRNAs。總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用1 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒配制20 μl PCR體系。miRNAs用All-in-One miRNA qRT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件:,95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次。使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀完成qRT-PCR操作,應(yīng)用2-ΔΔCt法計算LncRNA UCA1、miR-28-5p、CENPF的相對表達(dá)水平。

取凍存的心肌組織,采用Trizol法提取總RNA。總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用1 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SBRY super Mix制備反應(yīng)體系并進(jìn)行擴增,β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,循環(huán)40次。使用2-ΔΔCt公式計算miR-92a、Smad7 mRNA的相對表達(dá)水平。PCR引物序列:miR-92a上游引物:5′-CTCCCTATTGTAAACTTGT-3′,下游:5′-ATAGGGTTCATTCCCATACG-3′。Smad7上游引物:5′-AGGTCTTACATGAAACGCAGAGA-3′,下游:5′-AA-CGCGTGTCTCCGTCAACCAACC-3′。β-actin上游引物:5′-GCTCACGGAGCAATAGAAGAGCCTA-3′,下游:5′-TGGTTCTGCTTCGTGCCCATGGCTCC-3′。

1.9Western印跡檢測心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá) 取凍存的心肌組織制成勻漿,加入適量預(yù)冷RIPA,充分混勻后冰上孵育30 min,離心提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,取等質(zhì)量蛋白上樣,凝膠電泳分離樣品蛋白,轉(zhuǎn)膜,取目的條帶用5%脫脂奶粉制成的封閉液室溫封閉2 h,封閉液稀釋一抗(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)制成孵育液,稀釋比例為1:200,4 ℃過夜,TBST漂洗3次,加入稀釋比例為1∶10 000的對應(yīng)二抗孵育液,室溫孵育2 h,TBST漂洗3次,用ECL發(fā)光劑顯影,Quantity One軟件進(jìn)行各組蛋白灰度分析,以β-actin作為內(nèi)參。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗,作圖軟件采用GraphPad Prism5。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶實驗 數(shù)據(jù)庫(Target Scan Human)預(yù)測結(jié)果顯示,Smad7基因的第1 329～1 335個核苷酸位置與miR-92a存在靶向結(jié)合位點。見圖2。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-92a后,與miR-NC組相比,WT Smad7的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而MUT Smad7熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞雙熒光素酶結(jié)果比較

圖2 miR-92a與Smad7存在結(jié)合位點

2.2各組超聲心動圖比較 與對照組相比,AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)水平顯著降低(P<0.05);與AF組相比,AAV-miR-92a組LVEF和LVFS水平顯著降低,AAV-inhibitor組LVEF和LVFS水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表2。

表2 各組LVEF、LVFS水平

圖3 各組超聲心動圖

2.3各組心肌組織病理學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示,心肌細(xì)胞染成紫紅色,細(xì)胞核染成藍(lán)色。對照組心肌細(xì)胞紋路清晰、排列整齊;AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組心肌細(xì)胞排列紊亂,間質(zhì)增多,成纖維細(xì)胞大量增生;AAV-inhibitor組心肌細(xì)胞排列稍紊亂,成纖維細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)少量增生。Masson染色結(jié)果顯示,對照組心肌細(xì)胞排列整齊、有少量膠原纖維出現(xiàn),無明顯心肌纖維化現(xiàn)象出現(xiàn);AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組心肌細(xì)胞排列紊亂,膠原纖維大量沉積,心肌組織纖維化明顯;AAV-inhibitor組心肌細(xì)胞排列稍紊亂,膠原纖維少量沉積。見圖4。

圖4 各組心肌組織(×400)

2.4免疫熒光檢測各組心肌組織α-SMA、FSP-1 OD值 與對照組相比,AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組α-SMA、FSP-1水平明顯升高(P<0.05);與AF組相比,AAV-miR-92a組α-SMA、FSP-1水平明顯升高(P<0.05),AAV-inhibitor組α-SMA、FSP-1水平明顯降低(P<0.05)。見圖5、表3。

表3 各組心肌組織α-SMA、FSP-1 OD值、miR-92a、Smad7 mRNA、Smad7、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平比較

圖5 各組心肌組織α-SMA、FSP-1表達(dá)(免疫熒光,×400)

2.5各組心肌組織miR-92a、Smad7 mRNA表達(dá) 與對照組相比,AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組miR-92a水平顯著升高,Smad7 mRNA水平顯著降低(P<0.05);與AF組相比,AAV-miR-92a組miR-92a水平顯著升高,Smad7 mRNA水平顯著降低,AAV-inhibitor組miR-92a水平顯著降低,Smad7 mRNA水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.6大鼠心肌組織Smad7、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá) 與對照組相比,AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組TGF-β1、Smad2、Smad3水平顯著升高,Smad7水平顯著降低(P<0.05);與AF組相比,AAV-miR-92a組TGF-β1、Smad2、Smad3水平顯著升高,Smad7水平顯著降低,AAV-inhibitor組TGF-β1、Smad2、Smad3水平顯著降低,Smad7水平顯著升高(均P<0.05)。見表3、圖6。

1～5:對照組、AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組、AAV-inhibitor組

2.7各組心肌組織Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示,Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ陽性表達(dá)為棕黃色,與對照組相比,AF組、AAV-NC組、AAV-miR-92a組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ水平顯著升高(P<0.05);與AF組相比,AAV-miR-92a組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ水平顯著升高,AAV-inhibitor組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ水平顯著降低(P<0.05)。見表4、圖7。

表4 各組心肌組織Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ表達(dá)比較

3 討 論

AF是臨床常見的心率失常,其發(fā)病機制十分復(fù)雜。心房重構(gòu)是指心臟在損傷情況下發(fā)生的結(jié)構(gòu)性變化,目前認(rèn)為心房重構(gòu)是導(dǎo)致AF的重要原因。心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)以心房纖維化為特征,纖維化程度與AF明顯相關(guān),因此探究其發(fā)病機制對預(yù)防和治療AF具有重要意義。miRNA在心肌細(xì)胞的生理過程發(fā)揮重要作用,如與心肌細(xì)胞的衰老、凋亡密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-92a在人內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá),損害血管生成。Wang等〔10〕發(fā)現(xiàn),高表達(dá)miR-92a,可加重心肌缺血再灌注損傷。Boon等〔11〕發(fā)現(xiàn),miR-92a參與了心肌梗死后的心臟重塑。Zhang等〔12〕發(fā)現(xiàn),抑制miR-92a的表達(dá)可減小心肌梗死面積,使梗死后心肌重塑,并可促進(jìn)心肌組織的血管再生,從而使心臟功能得到恢復(fù)。厲菁等〔13〕發(fā)現(xiàn),抑制miR-92a的表達(dá),可以促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,提示miR-92a對心肌組織及細(xì)胞具有不良影響。本研究結(jié)果說明,抑制miR-92a表達(dá)能夠改善心功能,有明顯的心肌保護功能。

TGF-β1是對于MF具有重要的促進(jìn)作用,其可通過激活通路下游相關(guān)蛋白促進(jìn)CF膠原增生及纖維連接蛋白沉積。Smad7基因?qū)υ撔盘柾肪哂刑禺愋砸种谱饔?其能夠與TGF-β受體競爭性結(jié)合,即Smad2、Smad3的磷酸化受到抑制,阻斷TGF-β蛋白對下游蛋白的激活作用,從而干預(yù)信號通路的傳導(dǎo),并使心肌纖維化得到明顯改善。張步升〔14〕發(fā)現(xiàn),Smad7是miR-92a的靶基因,miR-92a的低表達(dá)能夠提高Smad7水平,通過Smad7/NF-κB信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷。朱珂〔15〕發(fā)現(xiàn),扶正化瘀方通過miR-29b-5p靶向TGF-β/Smads通路,增加Smad7水平,降低Smad2、Smad3水平,調(diào)控CF增殖、凋亡,抑制心肌纖維化。郭東等〔16〕發(fā)現(xiàn),miR-21通過抑制Smad7基因的表達(dá),激活CF,促進(jìn)其增殖、分化。本研究結(jié)果說明,miR-92a可能通過靶向調(diào)控Smad7的表達(dá)發(fā)揮對TGF-β1/Smads信號通路的干預(yù)作用。

膠原纖維包裹正常心肌細(xì)胞,引起傳導(dǎo)速度減慢,CF被激活,其增殖分化形成肌成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ等細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積,α-SMA水平升高,加快纖維化進(jìn)程。馮巍等〔17〕發(fā)現(xiàn),miR-544通過靶向調(diào)控Smad3的表達(dá),阻斷TGF-β1/Smad3信號通路,降低Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ水平,發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)。Kang等〔18〕發(fā)現(xiàn),在ROS誘導(dǎo)的心肌損傷模型中,紫檀芪通過抑制AF相關(guān)基因Pitx2c/miR-15b途徑,抑制α-SMA、FSP-1水平,減輕大鼠MF。楊澤福等〔19〕發(fā)現(xiàn),miR-125a通過下調(diào)Notch1的表達(dá),上調(diào)Smad2、Smad3、Collagen-Ⅰ、α-SMA水平,參與調(diào)控心肌梗死后MF。本研究結(jié)果說明,抑制miR-92a的表達(dá),能降低心肌組織纖維化程度。