孫強(qiáng) 宋維亮 王俊偉 程康

(天津市第三中心醫(yī)院普外科,天津 300170)

研究顯示,大約有1/3結(jié)直腸癌患者具有遺傳因素影響,在早期的癥狀較不明顯,病情發(fā)展緩慢,當(dāng)發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已是晚期〔1～3〕。在晚期通過手術(shù)治療,在術(shù)后5年生存率仍然較低〔4〕。相關(guān)研究顯示,假如能在早期階段對結(jié)直腸癌患者癌前病變的基因水平進(jìn)行科學(xué)研究,有助于較早進(jìn)行干預(yù)及治療〔5〕。目前,關(guān)于基因分子水平探討結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制及治療的研究,已成為廣大學(xué)者所關(guān)注的焦點(diǎn)〔6〕。本文選擇探究腫瘤基因N-MYC下游調(diào)節(jié)基因(NDRG)1靶向調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路對直腸癌患者細(xì)胞凋亡、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑 人直腸癌細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。NDRG1、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)2抗體(Hyclone公司);MAPK抗體(上海博光公司);細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)2及MAPK2單克隆抗體(MEK)2抗體(BD公司)胎牛血清、青霉素(HYCLONE)RPMI1640培養(yǎng)基、恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人直腸癌細(xì)胞株以RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)培養(yǎng)基中含10%胎牛血清及青霉素,轉(zhuǎn)染前胰酶消化細(xì)胞,在培養(yǎng)基內(nèi),以細(xì)胞濃度調(diào)整到1×105個(gè)/ml,接種在6孔板中進(jìn)行,于每孔內(nèi)置放2 ml,將其放置37 ℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行過夜,當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)70%～80%后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1,100倍稀釋退火產(chǎn)物之后與其連接,20 ℃水浴過夜,使用大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化,次日選擇單克隆菌落,30 μg/ml Kana LB培養(yǎng)液中接種,2 000 r/min離心處理,37 ℃下震混,孵育過夜。少量抽提質(zhì)粒后使用SacⅠ酶切進(jìn)行鑒定,分為對照組、下調(diào)NDRG1組和上調(diào)NDRG1組,重懸處理后分別加入4 μg生理鹽水、NDRG1-siRNA、pcDNA3.1-NDRG1,電擊后常溫保存2 h,各組細(xì)胞加入6孔、96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取出后,添加800 μg/ml G418培養(yǎng)基進(jìn)行再次培養(yǎng)。

1.3NDRG1及Bcl2蛋白檢測 以Western印跡法對NDRG1及Bcl2蛋白進(jìn)行檢測。將各組細(xì)胞接種到6孔板,加入細(xì)胞裂解液,裂解細(xì)胞,收集上清液;二喹啉甲酸(BCA)檢測蛋白濃度,30 μg蛋白樣品,進(jìn)行電泳,室溫下孵育1 h,加入兔抗NDRG1、Bcl2及磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)多克隆抗體,4 ℃孵育過夜,第2天室溫孵育二抗,重復(fù)試驗(yàn)3次,分析條帶灰度值。

1.4NDRG1、MAPK、ERK2及MEK2 mRNA表達(dá)檢測 Trizol法提取細(xì)胞總RNA,檢測RNA純度、含量,行逆轉(zhuǎn)錄處理后,采用RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢查NDRG1、MAPK、ERK2及MEK2 mRNA表達(dá)。反應(yīng)體系:10 μl 2×All-in-One qPCR Mix、1 μl引物正義鏈、2 μl 50×Syner Green、2 μl cDNA、1 μl引物反義鏈、4 μl ddH2O;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

1.5細(xì)胞增殖、凋亡能力檢測 以噻唑藍(lán)(MTT)比色法對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測,選擇0.125%胰蛋白酶消化生長期細(xì)胞,同時(shí)將其制作為膽細(xì)胞懸液,以2×103個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔板中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,在5% CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在24、48、72 h分別觀察培養(yǎng)細(xì)胞,待各組細(xì)胞培養(yǎng)到相同時(shí)間后,在每孔中加入20 μl MTT,避光孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μg二甲基亞砜(DMSO)于搖床低速震蕩10 min,采用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞組光密度(OD)值,按照腫瘤細(xì)胞增殖率=(細(xì)胞組OD值/參照值-1)×100%的計(jì)算公式,計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。

TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡:將20 μg/ml蛋白酶K添加至細(xì)胞中,培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白,清洗后加入100 μl平衡緩沖液、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)反應(yīng)液避光培養(yǎng),1 h后添加檸檬酸鈉緩沖液(SSC)100 μl,靜置30 min,經(jīng)洗滌、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色封片后的細(xì)胞核分別呈現(xiàn)為陽性和陰性,取每切片3視野計(jì)算細(xì)胞凋亡率平均值。

1.6細(xì)胞侵襲、遷移能力檢測 采用Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲能力:實(shí)驗(yàn)開始前2 h濕化小室,上室加入細(xì)胞懸液(200 μl),下室加入細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清),置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次,置于4%多聚甲醛中30 min,使用結(jié)晶紫溶液染,倒置顯微鏡對穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力:將細(xì)胞接種至18孔板待其增長到80%時(shí),使用100 μl的槍頭,垂直劃出3條直線,使用PBS清洗2～3次,分別加入0.5%的血清培養(yǎng)基,觀察24 h之后,使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的遷移數(shù)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件,多組對比行F檢驗(yàn),組間對比行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組NDRG1 mRNA、NDRG1及Bcl2蛋白比較 與對照組相比,下調(diào)NDRG1組NDRG1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著下降,Bcl2蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05);與對照組、下調(diào)NDRG1組相比,上調(diào)NDRG1組NDRG1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高,Bcl2蛋白表達(dá)顯著下降(均P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 Western印跡檢測NDRG1及Bcl2蛋白表達(dá)

表1 各組NDRG1 mRNA、NDRG1及Bcl2蛋白比較

2.2各組MAPK、ERK2及MEK2 mRNA比較 與對照組相比,下調(diào)NDRG1組MAPK、ERK2及MEK2 mRNA表達(dá)顯著升高(均P<0.05);與對照組、下調(diào)NDRG1組相比,上調(diào)NDRG1組MAPK、ERK2及MEK2 mRNA顯著降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組MAPK、ERK2及MEK2 mRNA比較

2.3各組細(xì)胞增殖率、凋亡率比較 24、48、72 h時(shí),與對照組比較,下調(diào)NDRG1組細(xì)胞增殖率較高,凋亡率較低,上調(diào)NDRG1組細(xì)胞增殖率較低,凋亡率較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與下調(diào)NDRG1組比較,上調(diào)NDRG1組細(xì)胞增殖率顯著低,凋亡率顯著高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞不同時(shí)間增殖率、凋亡率比較

2.4各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 與對照組相比,下調(diào)NDRG1組侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)顯著高,上調(diào)NDRG1組侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)顯著低(均P<0.05)。與下調(diào)NDRG1組比較,上調(diào)NDRG1組侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)顯著低(均P<0.05)。見表4、圖2。

圖2 Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲(臺(tái)盼藍(lán),×100)

表4 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較個(gè),n=6)

3 討 論

結(jié)腸癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中排名第3位,其中大部分患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí),已進(jìn)展至中晚期,在臨床上治療效果欠佳〔7〕。經(jīng)過手術(shù)治療后,結(jié)直腸癌患者約有1/2在5年內(nèi)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移情況,成為主要影響結(jié)直腸癌治療效果及致死的原因。相關(guān)研究顯示,原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移為90%惡性腫瘤患者出現(xiàn)相關(guān)死亡的原因〔8〕。因此,對于研究調(diào)控原發(fā)腫瘤的發(fā)生遷移、浸潤及形成轉(zhuǎn)移灶的分子生物機(jī)制具有重要意義〔9〕。NDRG1為N-MYC下游調(diào)節(jié)的基因,在多種惡性腫瘤的發(fā)展過程中均有參與,同時(shí)在細(xì)胞的生長發(fā)育及維持外周軸突功能完整中均有NDRG1參與,在多個(gè)腫瘤組織中呈不同表達(dá)〔10〕。相關(guān)研究顯示,NDRG1在結(jié)直腸癌中隨無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌向有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中,表達(dá)會(huì)逐漸升高,差異具有顯著性〔11〕。

癌基因、抑癌基因及錯(cuò)配修復(fù)基因等在直腸癌腫瘤的發(fā)生過程中具有密切聯(lián)系〔12〕。其發(fā)生發(fā)展被認(rèn)為是多因素、多步驟、多階段及多基因所改變的一個(gè)復(fù)雜過程〔13〕。Bcl2表達(dá)升高能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移與增殖,NDRG1能夠?qū)ζ溥M(jìn)行抑制,進(jìn)而在細(xì)胞的遷移與增殖中發(fā)揮作用〔14〕。在各種腫瘤組織中NDRG1基因的表達(dá)水平各不相同,在較多組織中NDRG1基因表達(dá)的不一致性,說明可能在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上能夠同時(shí)進(jìn)行調(diào)控。相關(guān)研究顯示,NDRG1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān),在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大腸癌組織中其陽性表達(dá)率要低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織〔15〕。本文研究結(jié)果表明,NDRG1參與直腸癌發(fā)展,同時(shí)上調(diào)NDRG1能夠抑制細(xì)胞的遷移與增殖,與上述討論一致。

MAPK信號通路在細(xì)胞遷移及凋亡過程中明顯參與,其能夠?qū)⒓?xì)胞外信號轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致下游激酶出現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng),激活細(xì)胞質(zhì)中靶蛋白,進(jìn)而對靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)〔16〕。相關(guān)研究顯示,隨著惡性腫瘤的程度上升,MAPK信號通路得到激活,能夠?qū)е录?xì)胞增殖及遷移能力增加,進(jìn)而使病情程度加重〔17〕。本文研究結(jié)果說明,上調(diào)NDRG1表達(dá)對MAPK信號通路進(jìn)行靶向調(diào)控,能夠?qū)χ蹦c癌細(xì)胞增殖能力進(jìn)行抑制,同時(shí)增加細(xì)胞凋亡。

腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤由局灶性病變進(jìn)展成全身性、且對生命產(chǎn)生威脅的疾病過程中的標(biāo)志性事件〔18〕。大多腫瘤的發(fā)展過程中,其原發(fā)腫瘤均會(huì)出現(xiàn)游離出的活躍細(xì)胞,對鄰近組織浸潤,并通過脈管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)隔器官中,同時(shí)形成新的腫瘤灶〔19〕。相關(guān)研究顯示,進(jìn)展期的結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差,其主要原因?yàn)榘┰钪写嬖诰哂蟹呕熆剐缘陌┘?xì)胞,同時(shí)能夠使腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的情況〔20〕。本文研究結(jié)果說明,上調(diào)NDRG1表達(dá)能夠抑制直腸癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力,減輕病情嚴(yán)重程度。

綜上所述,在直腸癌患者細(xì)胞中通過上調(diào)NDRG1表達(dá),對MAPK信號通路進(jìn)行靶向調(diào)控,能夠抑制癌細(xì)胞的遷移與增殖,增加細(xì)胞的凋亡,減輕病情嚴(yán)重程度。