葉勁松 梁子聰

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,貴州 都勻 558000)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是臨床骨科常見的疾病之一,以中老年發(fā)病為主,女性高于男性〔1〕。KOA的主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化、滑膜炎癥等〔2〕。KOA除引起膝關(guān)節(jié)疼痛外,后期可使膝關(guān)節(jié)畸形、關(guān)節(jié)功能喪失,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。動物實驗是研究臨床疾病發(fā)生、發(fā)展及防治方法的重要途徑。建模方法、病變特點相似性、建模時間等是一直以來KOA動物模型研究關(guān)注的焦點問題〔3〕。常用的KOA建模方法有:關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物法,如木瓜蛋白酶、膠原酶、碘乙酸鈉;關(guān)節(jié)制動法,如石膏固定法、外固定支架固定法;誘導(dǎo)法,如卵巢切除法;外科手術(shù)法,如Hulth法、改良Hulth法、前交叉韌帶離斷術(shù)、半月板切除術(shù)等〔4〕。本研究通過比較卵巢切除法、木瓜蛋白酶法、改良Hulth法3種方法在不同時間節(jié)點血清炎癥因子、病理表現(xiàn)及關(guān)節(jié)軟骨膠原蛋白(Collagen)Ⅱ表達(dá),了解KOA不同造模方法的造模效果及特點。

1 資料與方法

1.1儀器、藥品與試劑 儀器:MR-96A型酶標(biāo)儀(深圳邁瑞),ASP300 S型全封閉式組織脫水機(德國Leica)、RM2265型全自動輪轉(zhuǎn)式切片機(德國Leica)、HI1210型攤片機(德國Leica)、DM750型光學(xué)顯微鏡(德國Leica)。藥品與試劑:木瓜蛋白酶(北京索萊寶),白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(北京誠林生物公司),封閉液(武漢博士德),CollagenⅡ多克隆抗體(北京百奧思科),通用型SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色盒(北京中杉金橋),其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗動物與分組 清潔級雌性SD大鼠80只,體質(zhì)量(200±20)g,由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(湘)2014-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w,分籠飼養(yǎng),不限制飲食。采用隨機數(shù)字表法分別設(shè)立空白對照組(6、10 w)、卵巢切除法組(6、10 w)、木瓜蛋白酶法組(6、10 w)、改良Hulth法組(6、10 w),每組10只。

1.3動物造模 所有SD大鼠于相同環(huán)境及飼喂條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,見各組大鼠在進食量、精神狀態(tài)、活潑程度等大體情況無差別后開始造模建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。具體操作步驟如下:動物麻醉:所有造模大鼠均采用3%戊巴比妥鈉1 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉。卵巢切除法〔5〕:麻醉生效后,無菌條件下由雙側(cè)肋脊角下后1 cm處縱行切口入后腹腔,緩慢提拉出卵巢及附近脂肪墊,仔細(xì)剝離,結(jié)扎輸卵管,結(jié)扎卵巢動靜脈,切除雙側(cè)卵巢后復(fù)位關(guān)閉。木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射法〔6〕:麻醉生效后,輕輕彎曲右膝關(guān)節(jié),自膝關(guān)節(jié)兩側(cè)膝眼進針,刺入關(guān)節(jié)腔內(nèi),先回抽,確定針頭于關(guān)節(jié)腔內(nèi)后,將提前配置好的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)。拔針后以滅菌棉球輕壓針眼2 min,避免木瓜蛋白酶溶液溢出。被動屈伸膝關(guān)節(jié)10次左右,使所注射溶液能均勻浸潤膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。間隔3 d后重復(fù)此方法1次,共進行3次注射。改良Hulth法〔7〕:麻醉生效后,無菌條件下取右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2 cm,顯露膝關(guān)節(jié),然后切斷前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶,完整切除內(nèi)側(cè)半月板,保留關(guān)節(jié)軟骨面。術(shù)后不固定傷肢,自由活動,可適當(dāng)給予抗生素預(yù)防感染。待麻醉蘇醒后,造模大鼠歸籠喂養(yǎng)?？瞻讓φ战M:不進行任何處理。

1.4標(biāo)本采集方法 根據(jù)實驗計劃,各組大鼠分別于造模后第6周、第10周分批次處死,每組10只。麻醉處死后,腹主動脈剪開取血,所得血液注入無菌EP管中離心(3 000 r/min,4 ℃)10 min,吸取上清液后置于-20 ℃冰箱中待測。取大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨標(biāo)本,置于4%多聚甲醛中固定,10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脫鈣,矢狀位取材,常規(guī)脫水石蠟包埋,切片備用。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清IL-6、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3的含量 具體操作參照說明書。

1.6鏡下觀察切片行蘇木素-伊紅(HE)染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨的組織結(jié)構(gòu)是否完整、軟骨細(xì)胞數(shù)量的多少和潮線完整與否。按改良Mankin標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)行病理評分〔8〕。分組標(biāo)準(zhǔn)為:正常:0～1分;輕度:2～5分;中度:6～9分;重度:10～14分。

1.7免疫組化觀察膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ表達(dá) 切片脫水后,予檸檬酸高溫高壓8 min行抗原修復(fù);滴加阻斷劑一滴,置濕盒內(nèi)室溫孵育10～30 min;每張切片滴加一抗后置濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜;再滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,置濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min,滴加DAB顯色液顯色后,脫水、透明、中性樹膠封片。免疫組化切片置于顯微鏡下,每例取臨近軟骨退變區(qū)隨機選取8個不重疊視野,圖形軟件測定陽性顆粒光密度值與底面光密度值之比,取每張切片的均值作為每例的測量值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行配對樣本t檢驗、獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時間點血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量比較 造模6 w時,與空白對照組對比,其他各組血清IL-6含量明顯增高(P<0.05);與卵巢切除法組比較,木瓜蛋白酶法組、改良Hulth法組血清IL-6含量明顯增高(P<0.05);與空白對照組、卵巢切除法組對比,木瓜蛋白酶法組、改良Hulth法組血清TNF-α、MMP-3含量明顯增高(P<0.05),而空白對照組與卵巢切除法組對比未見明顯差異(P>0.05)。造模10 w時,與空白對照組對比,卵巢切除法組血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量未見明顯差異(P>0.05);而與空白對照組、卵巢切除法組比較,木瓜蛋白酶法組、改良Hulth法組血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量明顯增高,且改良Hwlth法組TNF-α、MMP-3含量明顯高于木瓜蛋白酶法組(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量比較

2.2各組不同時間點膝關(guān)節(jié)鏡下病理表現(xiàn)和改良Mankin病理評分比較 造模6、10 w時,空白對照組膝關(guān)節(jié)鏡下見關(guān)節(jié)軟骨光滑平整,軟骨排列、形態(tài)細(xì)胞正常,軟骨基質(zhì)無明顯減少,潮線完整。造模6 w時,卵巢切除組膝關(guān)節(jié)鏡下見關(guān)節(jié)軟骨光滑平整,軟骨排列、形態(tài)細(xì)胞正常,軟骨基質(zhì)無明顯減少,潮線完整。造模10 w時,卵巢切除法組膝關(guān)節(jié)鏡下見軟骨關(guān)節(jié)面尚平整,軟骨細(xì)胞部分退化、軟骨基質(zhì)減少。造模6 w時,木瓜蛋白酶法組和改良Hulth法組膝關(guān)節(jié)鏡下見軟骨關(guān)節(jié)面變粗糙,軟骨細(xì)胞增生活躍、軟骨基質(zhì)減少。造模10 w時,木瓜蛋白酶法組和改良Hulth法組膝關(guān)節(jié)鏡下見軟骨關(guān)節(jié)面明顯粗糙、部分關(guān)節(jié)軟骨糜爛、缺損,軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)明顯減少,但改良Hulth法組病理表現(xiàn)更明顯。造模6、10 w時,與空白對照組對比,卵巢切除法組改良Mankin評分無明顯差異(P>0.05);與空白對照組、卵巢切除法組比較,木瓜蛋白酶法組、改良Hulth法組改良Mankin評分明顯升高(P<0.05);與木瓜蛋白酶法組比較,改良Hulth法組改良Mankin評分明顯升高(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組不同時間點改良Mankin評分、膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ免疫組化結(jié)果比較

2.3各組不同時間點膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ免疫組化比較 造模6 w時,與空白對照組對比,卵巢切除法組膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ表達(dá)無明顯差異(P>0.05);與空白對照組、卵巢切除法組比較,木瓜蛋白酶法組、改良Hulth法組膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ表達(dá)明顯降低(P<0.05)。造模10 w時,與空白對照組對比,卵巢切除法組膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ表達(dá)無明顯差異(P>0.05);與空白對照組、卵巢切除法組比較,木瓜蛋白酶法組、改良Hulth法組膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ表達(dá)明顯降低(P<0.05);與木瓜蛋白酶法組比較,改良Hulth法組膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ表達(dá)明顯更低(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組不同時間點膝關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ陽性表達(dá)(免疫組化染色,×400)

3 討 論

KOA是中老年人群常見疾病,致殘率高,導(dǎo)致其高致殘率的原因是膝關(guān)節(jié)滑膜反復(fù)的炎癥反應(yīng),關(guān)節(jié)軟骨退變、關(guān)節(jié)間隙狹窄逐漸加重,慢性骨質(zhì)增生及骨贅形成,最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、僵硬,功能喪失〔9〕。無論性別、年齡、創(chuàng)傷、肥胖或者先天性因素引起,KOA的發(fā)生進展機制離不開細(xì)胞因子持續(xù)的炎癥反應(yīng)〔10〕。細(xì)胞因子既可以與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表面的靶分子結(jié)合,從而激活軟骨細(xì)胞內(nèi)信號分子通路,調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生理功能,也可以參與生物學(xué)、生物化學(xué)的反饋作用,形成一系列復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)體系,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡及軟骨基質(zhì)破壞〔11〕。軟骨細(xì)胞是維持關(guān)節(jié)軟骨外基質(zhì)合成與釋放的重要細(xì)胞〔12〕。隨著年齡增長,軟骨細(xì)胞生成不足或凋亡過多,軟骨彈性蛋白多糖及膠原不斷地減少,打破了細(xì)胞外基質(zhì)分解和代謝的動態(tài)平衡,關(guān)節(jié)軟骨層變脆而脫落〔13〕。此外,當(dāng)膝關(guān)節(jié)受到外傷時,關(guān)節(jié)軟骨的壓力感受器興奮,誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞基因表達(dá),釋放細(xì)胞因子,產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)〔14〕。

KOA的發(fā)病是由多種細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果,如IL、TNF、趨化因子等細(xì)胞因子家族均在KOA炎癥過程發(fā)揮重要作用〔15〕。其中,IL家族包括了促炎性和抑炎性細(xì)胞因子。相關(guān)研究顯示,IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17等細(xì)胞因子與KOA發(fā)病關(guān)系密切〔16〕。IL-1β可以刺激成纖維細(xì)胞分泌IL-6、IL-8,促進關(guān)節(jié)滑膜發(fā)生炎性反應(yīng)〔17〕。同時,IL-1β和TNF-α可協(xié)同作用,使腺苷酸活化酶活動減弱,加快軟骨細(xì)胞分解代謝〔18〕。IL-1β和TNF-α還能夠誘導(dǎo)MMP-3和MMP-13的表達(dá),從而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨CollagenⅡ及基質(zhì)的分解〔19〕。相反,IL-10等抑制性IL可以抑制炎性細(xì)胞因子的活性表達(dá),對軟骨具有保護作用〔19〕。MMP家族是KOA發(fā)病的關(guān)鍵細(xì)胞因子。該家族由基質(zhì)降解酶(MMP-3、MMP-10、MMP-11)、膠原蛋白酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)、膜類MMP(MMP-15、MMP-16、MMP-24)等組成〔20〕。MMP是降解軟骨基質(zhì)最重要的酶。MMP可促進誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2分泌,致使軟骨基質(zhì)的合成代謝降低,同時分解代謝增強,加快軟骨基質(zhì)降解〔21〕。研究表明,MMP-3高表達(dá)可激活MEK、EPK、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多條炎癥反應(yīng)信號通路,參與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的整個過程〔22〕。

目前KOA模型的建立分為誘導(dǎo)型、自發(fā)型、轉(zhuǎn)基因型3大類型,然而人為干預(yù)誘導(dǎo)的KOA模型是目前最常使用的造模方式〔23〕。本研究結(jié)果可能與卵巢切除術(shù)并非對KOA造模過程中血清炎癥因子和膝關(guān)節(jié)局部的影響直接相關(guān)。有研究認(rèn)為,卵巢切除術(shù)后,大鼠體內(nèi)雌激素水平顯著下降,骨質(zhì)合成代謝減慢,骨質(zhì)分解代謝增強,導(dǎo)致骨量減少而發(fā)生骨質(zhì)疏松〔24〕。由于軟骨下骨量減少,關(guān)節(jié)逐漸失穩(wěn),軟骨磨損從而誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。本文造模方法與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松并膝關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制相似,但是目前并沒有直接研究結(jié)果表明骨質(zhì)疏松與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的先后順序及相關(guān)的發(fā)病機制。本研究應(yīng)用卵巢切除術(shù)在建模第10周時仍然未能成功建立穩(wěn)定的KOA模型。不少學(xué)者在采用卵巢切除術(shù)的基礎(chǔ)上,聯(lián)合糖皮質(zhì)激素、驅(qū)趕運動建立骨性關(guān)節(jié)炎模型〔25〕。馬文娟等〔26〕將新西蘭大白兔雙側(cè)卵巢切除,術(shù)后肌注甲潑尼松龍琥珀酸鈉1 mg/(kg·d)連續(xù)注射1個月,2個月后得到穩(wěn)定的骨質(zhì)疏松并骨性關(guān)節(jié)炎模型。李楠等〔27〕比較單純卵巢切除術(shù)、卵巢切除術(shù)+弱驅(qū)趕、卵巢切除術(shù)+強驅(qū)趕等方法的造模效果,3個月后改良Mankin病理評分結(jié)果顯示,卵巢切除術(shù)+強驅(qū)趕組評分結(jié)果顯著高于單純卵巢切除術(shù)組與卵巢切除術(shù)+弱驅(qū)趕組,說明造模效果與卵巢切除術(shù)后實驗動物驅(qū)趕運動強度密切相關(guān)。糖皮質(zhì)激素聯(lián)合驅(qū)趕運動可能加速了機體低雌激素水平下的骨質(zhì)分解代謝,導(dǎo)致骨量顯著減少,加快了骨性關(guān)節(jié)炎形成的過程。木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶,可以抑制軟骨細(xì)胞合成,并能促進軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖分解,加速了關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的退行性變〔28〕。高濃度木瓜蛋白酶還能直接損傷軟骨細(xì)胞,抑制軟骨細(xì)胞再生修復(fù)〔29〕。段文秀等〔30〕分別在第1天、第4天時向大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射2%木瓜蛋白酶0.15 ml,結(jié)果顯示該方法成功形成早期KAO模型需要4～6 w。何俊君等〔31〕第1、4、7天時用相同方法制造模型,濃度增加為4%,2 w即可成功制備早期膝骨關(guān)節(jié)炎模型,說明膝關(guān)節(jié)破壞程度與木瓜蛋白酶注射的濃度和劑量相關(guān)。本研究中,炎癥因子濃度下降可能是與木瓜蛋白酶注射后炎癥反應(yīng)出現(xiàn)峰值后有所緩和相關(guān),與木瓜蛋白酶注射的濃度和劑量影響膝關(guān)節(jié)破壞程度的結(jié)論相一致。第10周時Mankin病理評分結(jié)果升高可能與關(guān)節(jié)軟骨及周圍軟組織破壞,關(guān)節(jié)內(nèi)機械力線改變,引起膝關(guān)節(jié)不可逆的退行性變有關(guān)。膝關(guān)節(jié)手術(shù)制造KOA動物模型常用方法有傳統(tǒng)Hulth法(前后交叉韌帶切斷+內(nèi)側(cè)副韌帶切斷+內(nèi)側(cè)半月板切除)、改良Hulth法(前交叉韌帶切斷+內(nèi)側(cè)副韌帶切斷+內(nèi)側(cè)半月板切除)、前交叉韌帶切斷術(shù)、單純內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)、膝關(guān)節(jié)軟骨損傷術(shù)〔32〕。其主要原理是直接造成膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷及破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定性使得關(guān)節(jié)面受力失衡,加快膝關(guān)節(jié)退變而誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎〔33〕。楊黎黎等〔34〕應(yīng)用傳統(tǒng)Hulth法建立大鼠KOA造模,發(fā)現(xiàn)于手術(shù)后第2、4、8周分別成功建立了輕度、中度、重度KOA模型。肖春茍等〔35〕應(yīng)用改良Hulth法+驅(qū)趕法制造兔KOA模型,結(jié)果顯示4 w后成功建立動物模型。沈鵬等〔36〕和歐慧瑜等〔37〕分別用前交叉韌帶切斷法和關(guān)節(jié)軟骨損傷法建立KOA模型,實驗結(jié)果均顯示8 w后可得KOA模型。通過上述實驗結(jié)果可推斷膝關(guān)節(jié)手術(shù)制造KOA模型的效果和時間與手術(shù)方法造成膝關(guān)節(jié)的創(chuàng)傷程度相關(guān),但上述方法在不同時間節(jié)點膝關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的比較尚需進一步實驗證實。本研究結(jié)果提示,改良Hulth法組建立的KOA動物模型在炎癥反應(yīng)和膝關(guān)節(jié)病理改變程度等造模效果方面優(yōu)于相同時間節(jié)點的木瓜蛋白酶組。這可能與改良Hulth法所造成的持續(xù)性膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定性相關(guān)。本研究表明,木瓜蛋白酶法和改良Hulth法均可在第6周時快速、有效地建立KOA模型。而改良Hulth法隨著造模時間的增加,在炎癥反應(yīng)表現(xiàn)更加持久和膝關(guān)節(jié)病理改變嚴(yán)重程度更高。通過單純卵巢切除術(shù)法建立KOA動物模型效果不明顯,需要聯(lián)合糖皮質(zhì)激素和驅(qū)趕運動增加建立KOA模型的效果與效率。

綜上,通過不同的方法制備的KOA模型在疾病發(fā)展過程中,炎癥反應(yīng)、膝關(guān)節(jié)病理表現(xiàn)等方面各不相同。由于KOA 病因相當(dāng)復(fù)雜,其疾病的形成與多種因素相關(guān),所以沒有一種動物模型能夠滿足所有實驗研究。研究者應(yīng)當(dāng)結(jié)合患者的病因病機、關(guān)節(jié)力學(xué)特征等方面的特點選擇合適動物模型造模方法,以便在實驗過程中獲得與臨床相似的實驗數(shù)據(jù)。