劉文明 鄢和新

肝臟再生、干細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)技術(shù)、類器官培養(yǎng)等領(lǐng)域近幾十年來(lái)穩(wěn)步發(fā)展,與二代測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)、人工智能、基因編輯技術(shù)和生物工程等高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)交叉融合突破了既往研究的瓶頸,使得肝病再生領(lǐng)域逐漸成為焦點(diǎn)并在全球范圍內(nèi)方興未艾。肝臟因其強(qiáng)大的再生能力可以承受長(zhǎng)時(shí)間的損傷,并能夠在受損后再生主要的實(shí)質(zhì)性組織。因此,肝臟一直是人們研究器官再生的主要器官。人體肝臟可以耐受70%的肝切除術(shù),嚙齒類動(dòng)物可以承受90%的肝切除術(shù),斑馬魚甚至可以在肝細(xì)胞接近完全死亡后發(fā)生肝再生[1]。肝臟再生正在被視為肝移植的替代手段用于終末期肝病治療。盡管肝移植仍然是治療晚期肝病的唯一有效手段,然而供體不足、并發(fā)癥和長(zhǎng)期免疫耐受阻礙其在臨床上的廣泛應(yīng)用。肝臟再生的目的便是克服這些困難。首先,肝再生的目標(biāo)是在不可逆損傷之前促進(jìn)內(nèi)源性肝組織修復(fù)再生。其次,當(dāng)肝臟的內(nèi)源性再生能力不足,或是肝臟遭受損害不可逆(如失代償期肝硬化),肝再生的目的是替換受損的細(xì)胞或組織。與健康的自體或同種異體肝移植相比,肝再生不受器官可用性的限制,使用自體細(xì)胞移植能夠消除免疫抑制,無(wú)需手術(shù),減少產(chǎn)生并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

終末期肝病細(xì)胞療法已探索了幾十年,報(bào)道較多的是使用肝細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)治療。這些開(kāi)創(chuàng)性的研究推動(dòng)了基礎(chǔ)研究領(lǐng)域肝再生的最新進(jìn)展,產(chǎn)生了令人振奮的結(jié)果,但也存在不容忽視的弊端。原代肝細(xì)胞是最早被證明有效的可用于治療急性肝功能衰竭的細(xì)胞之一,但有限的供體和植入效率低制約其推廣使用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯示出良好的抗炎作用,但植入細(xì)胞通常不能替代受損組織。近年來(lái),肝臟類器官技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)成為一個(gè)突破點(diǎn)去應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。

一、肝臟類器官簡(jiǎn)述

類器官多指源于干/祖細(xì)胞在體外三維培養(yǎng)的細(xì)胞或組織,通過(guò)細(xì)胞自組裝模擬發(fā)育階段的時(shí)空變化,從而形成的類機(jī)體組織(如初級(jí)類器官)。類器官系統(tǒng)由人體組織或iPSC產(chǎn)生,可模擬不同的器官或組織,例如肝臟、肺、腎、心臟、大腦和腸道[2]。在肝病學(xué)研究中,出現(xiàn)了大量不同的3D培養(yǎng)系統(tǒng)和模式,使用各種術(shù)語(yǔ)(如肝-膽-胰類器官;肝臟類器官;肝膽類器官;膽管細(xì)胞類器官;膽管類器官;導(dǎo)管類器官;肝芽等等),導(dǎo)致了科學(xué)文獻(xiàn)中概念使用混亂,缺乏準(zhǔn)確性。為解決這個(gè)問(wèn)題,肝、胰和膽管(HPB)類器官聯(lián)合會(huì)最近發(fā)表了一份共識(shí)文件,旨在定義一個(gè)通用的命名法[3]。文件中對(duì)類器官定義為:源自多能干細(xì)胞、祖細(xì)胞或分化細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用,自組裝形成三維結(jié)構(gòu),可體外模擬天然組織的結(jié)構(gòu)和功能特征。該小組進(jìn)一步將類器官分為三大類,包括(1)上皮細(xì)胞類器官:來(lái)自單個(gè)器官的單胚層細(xì)胞;(2)多組織類器官:來(lái)自單個(gè)器官的多胚層細(xì)胞;(3)多器官類器官:來(lái)自多個(gè)器官細(xì)胞類型的類器官。

二、肝臟類器官培養(yǎng)

肝實(shí)質(zhì)由上皮細(xì)胞(肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞)組成,非實(shí)質(zhì)由基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞組成。其中肝細(xì)胞約占肝實(shí)質(zhì)的95%,肝細(xì)胞類器官技術(shù)主要應(yīng)用于研究生長(zhǎng)發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和疾病模擬,若沒(méi)有肝細(xì)胞類器官技術(shù),這些復(fù)雜的過(guò)程都難以在體外重現(xiàn)。來(lái)自于前腸的肝祖細(xì)胞、原代肝細(xì)胞均被報(bào)道在體外通過(guò)類器官培養(yǎng)保留了肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,但它們?cè)隗w外存活時(shí)間很短。一項(xiàng)突破性研究報(bào)道于2013年,Huch等[4]通過(guò)將Matrigel與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和R-spondin混合用于培養(yǎng)分離的肝細(xì)胞,建立了成年鼠來(lái)源的肝臟類器官培養(yǎng)體系,該方法培養(yǎng)的類器官具有自我更新能力、良好的遺傳穩(wěn)定性且可長(zhǎng)期擴(kuò)增。即使是單個(gè)LGR5+細(xì)胞也具有自組裝成3D結(jié)構(gòu)并分化為功能性肝樣細(xì)胞的能力。通過(guò)調(diào)控cAMP和TGFβ信號(hào)通路對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化,使得人肝細(xì)胞類器官體外成功構(gòu)建并擴(kuò)增,盡管其成熟度與功能仍比源組織低[5]。Clevers和Nusse實(shí)驗(yàn)室基于這一成果開(kāi)發(fā)了新的系統(tǒng),以類器官形式長(zhǎng)期培養(yǎng)小鼠和人原代肝細(xì)胞[6-7]。與以往的培養(yǎng)系統(tǒng)相比,用類器官培養(yǎng)模式使肝細(xì)胞移植和再生能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

眾所周知,肝臟具有獨(dú)特的膽管網(wǎng)絡(luò)和血管結(jié)構(gòu),肝臟的膽管結(jié)構(gòu)對(duì)于其發(fā)揮解毒功能至關(guān)重要。Tanimizu等[8]通過(guò)在I型膠原和ECM的混合物中培養(yǎng)肝細(xì)胞和EpCAM陽(yáng)性膽管細(xì)胞的混合物,建立了肝膽管類器官培養(yǎng)系統(tǒng)。為了提高移植物的存活效率,Takebe等[9]從多潛能干細(xì)胞衍生來(lái)源的肝內(nèi)胚層細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞形成肝芽結(jié)構(gòu),采用這種模式成功地在體外模擬Alagille綜合征、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏癥、多囊肝病以及癌癥等。Koike等[10]使用前腸和中腸類器官的混合物對(duì)早期內(nèi)胚層形態(tài)發(fā)生進(jìn)行模擬,這些類器官通過(guò)內(nèi)陷和分支過(guò)程自發(fā)組織成復(fù)雜的結(jié)構(gòu),包括肝臟、胰腺、腸道和膽道祖細(xì)胞,成功模擬了前腸-中腸邊界肝外膽管樹(shù)的早期發(fā)育。該系統(tǒng)的建立為肝臟發(fā)育提供全新的研究策略,并為在體外開(kāi)發(fā)功能性“迷你肝臟”單元奠定了基礎(chǔ)。

三、膽管類器官培養(yǎng)

盡管膽管細(xì)胞占總肝實(shí)質(zhì)的比例不到5%,但膽管疾病占成人肝移植的25%～30%和兒童肝移植的70%。以往關(guān)于膽管的培養(yǎng)主要由iPSC分化為成肝祖樣細(xì)胞,隨后這些細(xì)胞向膽道譜系轉(zhuǎn)化,盡管iPSC細(xì)胞在治療中存在弊端,但其產(chǎn)生的細(xì)胞具備了關(guān)鍵的膽管上皮細(xì)胞功能,成功地用于疾病建模和藥物篩選[11]。 膽管上皮細(xì)胞和肝祖細(xì)胞培養(yǎng)的膽管類器官表現(xiàn)出膽管細(xì)胞關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá),如CFTR、形成初級(jí)絨毛等[12-13]。文獻(xiàn)報(bào)道,微絨毛在相鄰近的肝細(xì)胞間發(fā)育成緊密的復(fù)合接連體,一旦復(fù)合體形成,毛細(xì)膽管的內(nèi)腔就可被打開(kāi),形成一個(gè)充滿膽汁液的膽管腔。盡管體外培養(yǎng)的膽管類器官呈現(xiàn)較好的功能屬性,但培養(yǎng)過(guò)程中它們也會(huì)失去一些膽管分化特征,表現(xiàn)出共同的類器官特性,這些細(xì)胞在體內(nèi)、外的身份(肝內(nèi)、肝外、膽囊)不固定,呈現(xiàn)可塑性,暴露于不同膽汁酸和膽汁濃度的類器官可以恢復(fù)與微環(huán)境相對(duì)應(yīng)的體內(nèi)特性[14]。然而,這些類膽管結(jié)構(gòu)在人體中能否真正行使膽管功能仍然存疑,直到Sampaziotis等建立的膽管類器官移植到膽管損傷的人體內(nèi),發(fā)現(xiàn)確實(shí)能整合進(jìn)原有膽管并修復(fù)損傷部位[12],這一憂慮終被打破。該模型的建立為治療膽管損傷性肝病的細(xì)胞療法鋪平了道路,即在實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng)的“小膽管”可以作為功能替代部件,修復(fù)受損的膽管,恢復(fù)患者自身肝臟的健康。

四、肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類器官培養(yǎng)

已知肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝臟內(nèi)主要的間充質(zhì)細(xì)胞,在基線時(shí)處于靜止?fàn)顟B(tài),用于儲(chǔ)存維生素A液滴。暴露于毒素或感染后會(huì)激活HSC,導(dǎo)致ECM在肝臟中的沉積增加(纖維化),從而引起肝硬化和門脈高壓。Koui等[15]通過(guò)誘導(dǎo)iPSC衍生的HSC能夠在體外擴(kuò)增,Coll等[16]通過(guò)誘導(dǎo)成中胚層祖細(xì)胞建立了iPSC衍生HSC的方法,Ouchi等[17]利用源自健康人類供體和肝臟疾病的iPSC產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞,如肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞和庫(kù)普佛樣細(xì)胞,它們準(zhǔn)確地在實(shí)驗(yàn)室中重現(xiàn)炎癥、纖維化和肝病的其他特征。這些系統(tǒng)可以作為研究HSC活化、肝纖維化、肝毒性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

五、肝臟類器官的應(yīng)用

在研究領(lǐng)域,肝臟類器官是進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用、疾病模擬、藥物篩選和機(jī)制研究的強(qiáng)大系統(tǒng)。在臨床研究中,肝臟類器官提供了一個(gè)可用于藥物篩選和個(gè)性化治療的平臺(tái),同時(shí)還提供了一種基于再生醫(yī)學(xué)開(kāi)展細(xì)胞治療的細(xì)胞源。在這種模式下,自體患者來(lái)源的類器官可與生物支架和再生活性因子結(jié)合,產(chǎn)生特定的組織工程移植物,用于患者治療[18]。肝臟類器官具有明顯的優(yōu)點(diǎn):(1)產(chǎn)生功能較好的細(xì)胞;(2)具有良好的遺傳穩(wěn)定性和擴(kuò)增能力;(3)能建立結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜的功能單元;(4)是組織工程較好的細(xì)胞源。其缺點(diǎn)也不容忽視:(1)所用基質(zhì)膠源于小鼠,具有小鼠組分污染與致瘤風(fēng)險(xiǎn),開(kāi)發(fā)新型混合凝膠耗時(shí)長(zhǎng)且成本高昂;(2)受供體可用性的限制;(3)脫細(xì)胞支架進(jìn)入人體組織受限制;(4)類器官的培養(yǎng)是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程,對(duì)于需要現(xiàn)成再生細(xì)胞藥物的急性肝衰竭患者不太可能;(5)患者自體來(lái)源的原代類器官受疾病影響,往往呈現(xiàn)較低的再生能力?？朔@些限制需要建立靈活的監(jiān)管機(jī)制,比如目前Matrigel同時(shí)也被類器官以外的其他細(xì)胞治療產(chǎn)品使用,其臨床進(jìn)展將有助于縮短類器官的臨床試驗(yàn)周期。

用于移植的細(xì)胞必須符合某些標(biāo)準(zhǔn),才能提供可行的治療策略。首先,移植的細(xì)胞需要具有較強(qiáng)的功能。其次,對(duì)于全身效應(yīng)(例如,循環(huán)血液中A1AT的分泌),移植物需能長(zhǎng)期存活并整合到宿主血管系統(tǒng)中。第三,從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用,移植的細(xì)胞必須具有規(guī)?；瘮U(kuò)增的能力與臨床應(yīng)用的安全性。最后,細(xì)胞療法不適用于需要進(jìn)行重建的手術(shù)(如膽道重建)。因此,單純的肝細(xì)胞移植不足以完全恢復(fù)肝功能。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn),可能需要對(duì)含有膽道系統(tǒng)的多細(xì)胞類器官進(jìn)行異位移植。這些“迷你肝臟”可在腸系膜、脾臟或腎包膜下進(jìn)行異位移植,以挽救藥物性肝衰竭動(dòng)物模型。尤為可貴的是,這些類器官可形成具有功能性血管的獨(dú)立“迷你肝臟”單元,新生血管自發(fā)地整合到宿主的血管系統(tǒng)中,使其適合異位移植[19]。

肝臟類器官的發(fā)展在高速前行,優(yōu)缺點(diǎn)兼具,如何在培養(yǎng)過(guò)程中放大優(yōu)點(diǎn),弱化缺點(diǎn)是肝臟再生領(lǐng)域未來(lái)研究的熱點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。