肖瀅 吳治念 王亞東

肝素主要生物學作用是參與調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng),被臨床廣泛用于血栓栓塞性疾病與體外循環(huán)抗凝。肝素與肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)、肝素酶(heparanase,HPSE)等具有高親和力,當肝素與其結(jié)合后通過一系列信號通路發(fā)揮抑制肝纖維化、減緩肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)進程等不同生物學效應;還可通過干擾細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan,HSPG)作用,阻止乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)進入肝細胞;中期因子(midkine,MDK)作為一種肝素結(jié)合性生長因子,被認為是更具特異性的HCC標志物。本文就肝素非抗凝作用在病毒性肝炎、肝纖維化、肝細胞癌中的潛在應用價值與相關(guān)機制作一綜述。

一、肝素參與肝炎病毒感染與抗病毒免疫

HBV、HCV均屬嗜肝病毒,為病毒性肝炎主要致病病毒,病毒侵入肝細胞,引起機體免疫應答介導肝細胞損傷及壞死性炎癥。HepG2-NTCP細胞常被用于研究HBV體外感染過程?，F(xiàn)已證明,HBV借助大包膜蛋白[1]與HSPG低親和力結(jié)合附著在肝細胞表面,后與?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽(sodium-taurocholate co-transports peptides,NTCP)[2]高親和力結(jié)合后轉(zhuǎn)入肝細胞內(nèi),即HSPG可介導HBV在細胞表面附著與入胞。Watashi等[3]研究證實復合聚乙二醇可以通過增強HSPG與NTCP結(jié)合,增加病毒吸附和進入,提高HBV感染效率。Schulze等[4]報道HBV進入肝細胞主要依賴于HSPG的GAG側(cè)鏈,肝素與HSPG結(jié)構(gòu)相似,都有核心蛋白和硫酸化的GAG鏈,因此可與HSPG競爭性結(jié)合HBV,發(fā)揮抑制病毒入胞作用,證實高濃度肝素可以抑制HBV感染過程。值得注意的是,Choijilsuren等[5]通過建立一種無聚乙二醇的感染系統(tǒng)模擬體內(nèi)HBV自然感染過程,觀察到生理濃度的肝素以NTCP依賴性方式增強HBV感染。因此,生理濃度肝素是否參與HBV進入人體后對肝細胞的自然感染過程值得確證;且在HBV感染肝細胞過程中,不同濃度肝素最終是發(fā)揮增強抑或抑制作用,有待進一步研究證實。除此之外,肝素還抑制HCV感染肝細胞過程。Dubuisson等[6]研究證實,HCV組成成分之一載脂蛋白-E(apolipoprotein E,ApoE)可借助于肝細胞表面HSPG與細胞因子CD81高親和力結(jié)合,繼而轉(zhuǎn)入肝細胞內(nèi)。Bankwitz等[7]將外源性ApoE、HCV和原代人肝細胞共同培養(yǎng),放大觀察ApoE在HCV感染過程中的作用,發(fā)現(xiàn)ApoE使HCV感染能力增強8倍;加入肝素時可抵消ApoE增強感染的作用,這一結(jié)果與肝素作為HSPG競爭性拮抗劑抑制HCV入胞相關(guān)。因此,肝素通過調(diào)節(jié)ApoE與肝細胞表面相關(guān)物質(zhì)間的作用,可能是抑制HCV感染的有效治療策略。

眾所周知,樹突狀細胞(dendritic cell,DC)通過識別病原相關(guān)模式識別受體發(fā)揮抗原遞呈作用,Toll樣受體家族屬該模式識別受體類別之一,參與HBV感染后的抗病毒免疫。CHB患者DC發(fā)育成熟障礙、抗原遞呈能力缺陷,且Th1/Th2分化失衡[8],伴隨TLR2[9]、TLR3[10]、TLR4[11]、TLR9[12]等途徑激活免疫應答的能力減弱。研究發(fā)現(xiàn),肝素可用于慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)免疫調(diào)節(jié)治療。孫偉紅等[10]體外培養(yǎng)來源于CHB患者的DC發(fā)現(xiàn),經(jīng)肝素處理后的DC其TLR3表達水平明顯高于未接受肝素處理的DC,且增強DC釋放IL-12的能力,證實肝素在體外通過上調(diào)DC的TLR3表達進一步通過IL-12促使Th0細胞向Th1分化,增強機體抗病毒能力。研究表明,HBV衣殼與巨噬細胞結(jié)合后通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB),釋放TNF-α、IL-6和IL-12p40細胞因子。肝素通過調(diào)控TLR2信號傳導抑制NF-κB激活,減少促炎性因子和調(diào)節(jié)性細胞因子的釋放[13],緩解肝臟免疫炎癥損傷。CHB患者肝細胞大量壞死導致肝臟微循環(huán)障礙,電鏡下能夠觀察到肝臟竇腔狹窄。肝素通過改善肝臟微循環(huán),促進肝內(nèi)毛細膽管中淤積膽汁的排泄,保護肝細胞。Shah等[14]利用四氯化碳(CCl4)構(gòu)建大鼠慢性肝損傷模型,檢測到模型大鼠血清TBil、DBil、IBil、ALT、AST、ALP水平升高;在CCl4暴露1周后靜脈予以肝素治療6周,上述肝功能指標水平顯著降低,提示肝素可減輕肝細胞損傷。也有國內(nèi)學者以肝素鈉注射液50～100U/kg治療126例伴有高膽紅素血癥的CHB患者,除3例患者因出現(xiàn)鼻出血和(或)牙齦出血,復查PT延長至23～25s而停用肝素,其余患者均無明顯異常出血現(xiàn)象,且TBil、ALT水平較治療前明顯下降,3個月后隨訪各項指標仍繼續(xù)下降[15]。Qiao等[16]利用肝素高生物相容性,制作出包含肝素、重組HBsAg/HBcAg 和分子佐劑(TLR9的激動劑,去甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤寡核苷酸)的治療性納米疫苗,可進一步增強治療性乙肝疫苗的免疫原性,分別使得90%和80%的CHB模型小鼠實現(xiàn)HBsAg清除和血清學轉(zhuǎn)換,也提示肝素在調(diào)控抗HBV感染免疫機制中發(fā)揮一定作用。

二、肝素調(diào)控肝細胞再生與肝纖維化進程

HGF是肝細胞的強效有絲分裂原,通過加速有絲分裂促進肝細胞再生,并可作為受損肝組織修復的重要標志之一。業(yè)已證實,肝素可增加HGF的促有絲分裂能力[17-19],但肝素介導細胞行為的分子機制多樣。Zioncheck等[18]在體外培養(yǎng)原代大鼠肝細胞時加入HGF與肝素,發(fā)現(xiàn)肝細胞有絲分裂程度隨肝素濃度增加而增加,其機制在于肝素能夠穩(wěn)定HGF寡聚體、促進HGF特異性膜表面受體c-Met活化,進而促進肝細胞有絲分裂、加速肝細胞再生。Naka等[19]通過制備125I-HGF研究發(fā)現(xiàn),HGF先與細胞表面HSPG結(jié)合,后與c-Met蛋白相互作用從而進入細胞;肝素通過干擾HSPG使得超過85%的原本與c-Met結(jié)合的HGF從細胞表面釋放,增加游離HGF濃度,發(fā)揮其誘導肝細胞再生的功能。Kato等[20]研究發(fā)現(xiàn)肝素二糖結(jié)構(gòu)重要組分ΔUA-GlcNS可介導HGF濃度增加,其誘導機制包括釋放細胞表面結(jié)合的HGF和增加細胞內(nèi)HGF的產(chǎn)生,經(jīng)ΔUA-GlcNS預處理的小鼠在注射CCl4后24小時檢測血清ALT和AST水平以及行肝組織學檢查,發(fā)現(xiàn)ALT 和AST水平并未增加且小鼠肝臟組織學檢查未顯示肝細胞腫脹和壞死,證實ΔUA-GlcNS可能作為HGF誘導劑抑制肝損傷。

肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化是肝纖維發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié),活化的HSCs是纖維化肝臟中細胞外基質(zhì)的主要來源細胞。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)家族可活化HSCs和促進HSCs向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化,在肝纖維化形成過程中發(fā)揮重要作用。肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)是EGF家族代表性成員之一,主要存在于肝臟非實質(zhì)細胞中,在受損肝臟中表達增加,通過增強EGF受體磷酸化和ErbB4受體合成促進HSCs活化和抑制HSCs凋亡[21],導致肝纖維化程度加重。Guo等[22]通過對HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠注射CCl4構(gòu)建肝纖維化模型,后從模型小鼠中分離HSCs進行體外研究,檢測到HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠α-平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白-I表達較野生型小鼠明顯增強,伴隨更為嚴重的纖維化,證實過度表達HB-EGF基因可導致HSCs活化增加和凋亡減少,抑制HB-EGF,有望成為抗肝纖維化治療的潛在靶點。但是,Huang等[23]通過研究HB-EGF基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn),來自HB-EGF-/-小鼠的活化HSCs中α-平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白mRNA表達更高,伴隨肝臟纖維化程度加重;外源性HB-EGF可抑制HSCs活化和膠原生成。故此,提出HB-EGF可作為抗纖維化天然因子。與此相一致,在硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)誘導的小鼠肝纖維化模型中,HB-EGF敲除后其肝纖維化程度較野生型小鼠明顯加重。業(yè)已證實,臨床肝纖維化患者組織樣本中HB-EGF表達水平增高,這有利于受損肝組織的修復[24]。人類臨床肝纖維化樣本與過表達HB-EGF之間的分子生物學相關(guān)性或許更強,提示HB-EGF 更可能增強肝臟纖維化。因HB-EGF中肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與肝素有較強的親和性,所以與EGF受體的結(jié)合是EGF的數(shù)十倍,推測添加肝素與HB-EGF結(jié)合后可抑制其對HSCs活化的促進作用。

三、肝素抑制肝癌細胞增殖、侵襲與擴散

細胞增殖、血管生成和免疫逃逸的相互作用促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,基于此三項機制的靶點治療也越來越引起專業(yè)學者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),肝素作為一種可生物降解的多糖,在腫瘤血管生成[25]及腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等過程均發(fā)揮抑制作用[26]。Wang等[27]通過修飾肝素分子結(jié)構(gòu)增強其生物活性同時降低出血風險,繼而用作抗腫瘤治療中遞送藥物的納米載體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)由肝素納米顆粒遞送的藥物在進入機體后藥物毒性明顯降低。截止目前,已經(jīng)開發(fā)出多項基于肝素的給藥系統(tǒng),例如,胞苷-磷酸-鳥嘌呤寡核苷酸作為TLR9的免疫激活劑,可加強輔助性T細胞介導的免疫反應[12];藤黃酸作為一種天然抗腫瘤活性物質(zhì),對HCC具有良好的殺傷作用。Shao等[28]通過整合肝素和以上兩種物質(zhì),有效地結(jié)合了肝素抗腫瘤血管形成、藤黃酸化療作用和胞苷-磷酸-鳥嘌呤寡核苷酸免疫治療作用。由動物實驗證實,這種策略還顯著延長HCC小鼠的生存時間。HCC患者腫瘤組織中肝素酶(heparinase,HPSE)表達水平明顯上調(diào),作為一種多功能細胞外水解酶,HPSE可激活HPSE/SDC-1/TNF-α軸和p38mapk通路,誘導微血管內(nèi)皮細胞壞死,促使HCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[29]。肝素是HPSE的水解底物,可下調(diào)HPSE表達[30],發(fā)揮抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的作用。HGF/c-Met參與肝癌細胞增殖、遷移和血管生成[31],肝素通過干擾HGF,抑制c-Met信號激活,進而抑制HGF/c-Met介導的HCC細胞侵襲和遷移,發(fā)揮抗HCC作用[19]。除此之外,Gunes等[32]在大鼠HCC細胞系中行cDNA 微陣列分析測定硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)基因表達水平,研究肝素對這一腫瘤抑制基因表達的影響,證實過表達TXNIP使肝癌細胞黏附性和增殖性降低,肝素通過與TXNIP啟動子上的獨特碳水化合物反應元件結(jié)合,加速TXNIP轉(zhuǎn)錄進程;在此背景下,通過使用HCC大鼠模型檢測肝素對TXNIP表達的體內(nèi)效應,發(fā)現(xiàn)肝臟中TXNIP表達增加,體內(nèi)研究證實肝素可降低肝癌細胞黏附性和增殖性。肝素在細胞生長、分化、遷移和侵襲中起重要作用,但其介導的腫瘤細胞行為及其分子機制尚未統(tǒng)一。拓撲替康(topotecan,TpT)作為拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的主要抑制化合物,可一定程度上增強肝癌細胞同質(zhì)性黏附作用,抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移;還可下調(diào)肝癌細胞黏附于異種組織細胞的能力,使得腫瘤細胞不易定植于其他組織而形成轉(zhuǎn)移灶[33]。Dudás等[34]從肝癌組織中選擇具有高拓撲異構(gòu)酶I活性的HepG2細胞系和具有低拓撲異構(gòu)酶I活性的Hep3B細胞系,經(jīng)肝素處理測量這些提取物的酶活性,發(fā)現(xiàn)肝素暴露后消除了Hep3B細胞系的酶活性,而HepG2細胞系保留了其酶活性。由于TpT的療效取決于拓撲異構(gòu)酶I的實際活性,若同時給藥,肝素雖然會干擾TpT對低酶活性肝癌細胞的生長抑制作用,但是證實肝素能使拓撲異構(gòu)酶Ⅰ活性低的正常周圍組織免受TpT的細胞毒作用。因此,TpT治療高拓撲異構(gòu)酶I活性的肝惡性腫瘤時,或可聯(lián)合應用肝素,降低化療藥物的副作用。

部分肝素樣物質(zhì)在HCC診斷及治療中發(fā)揮的作用不容忽視,其與肝素的相關(guān)性值得進一步研究。Nakamura等[35]發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白通過促進HB-EGF自分泌,參與Ras/PI3 Kinase-Akt信號通路激活Akt,進而刺激癌細胞增殖。Wang等[36]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制因子甲基CpG結(jié)合蛋白-2通過HB-EGF/EGFR通路促進同源盒基因HOXD3(調(diào)控細胞增殖和分化重要分子,參與腫瘤多種生物學過程)的表達,從而誘導HCC 的遷移、侵襲和血管生成。因此以HB-EGF為靶點抑制HCC腫瘤細胞增殖,可成為抗腫瘤治療思路與前景之一。中期因子(midkine,MDK)是一種肝素結(jié)合性生長因子,肝素分子中GAG側(cè)鏈可抑制MDK發(fā)揮其活性[37],進而誘導細胞凋亡并抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[38]。目前MDK的應用已處于臨床前開發(fā)階段,MDK單獨或聯(lián)合AFP可顯著提高HCC的診斷準確性,有望在HCC早期診斷、治療及預后分析中發(fā)揮價值。

四、結(jié)語

綜上所述,肝素參與病毒性肝炎、肝纖維化、肝細胞癌的發(fā)病機制,并潛在一定臨床應用價值,但目前多數(shù)研究尚限于體外和藥理學研究、病例報告和小樣本回顧性隊列研究,缺乏國內(nèi)外指南及專家共識的統(tǒng)一推薦意見,這也可能與肝素在肝病患者應用時潛在出血風險有關(guān)。然而,肝病患者凝血功能障礙是一種低水平的再平衡狀態(tài),通過準確、動態(tài)地評估個體出凝血風險與不良事件發(fā)生的可能性,制定個體化管理策略,有望使肝素這一經(jīng)典藥物在非抗凝方面發(fā)揮其最大應用價值。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。