劉雅妮 郭瑞芳 王歡 婁婷婷 李燕

肝臟是人體最大的消化腺,接受肝固有動脈及門靜脈的雙重血液供應(yīng),營養(yǎng)物質(zhì)及藥物等的代謝、膽汁的合成與分泌、抗體的生成等均在肝臟進(jìn)行[1]。致病因素可引發(fā)肝臟的氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧(reactive oxygen species,ROS)誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死或凋亡以及肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)的增殖、遷移和膠原積累[2],繼而引起肝功能損害及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積,肝臟彌漫性纖維化,最終導(dǎo)致肝硬化[3]。因此,氧化應(yīng)激是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[4]。

ROS過量產(chǎn)生可激活轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子-2(nuclear erythroid-2-related factor 2,Nrf2),Nrf2通過與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements,ARE)結(jié)合,啟動下游血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)等抗氧化保護(hù)基因的表達(dá),從而生成HO-1等抗氧化酶。研究表明,肝臟疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等多種疾病均與Nrf2/HO-1通路相關(guān)[5]。

全球每年約有100萬人因肝硬化失去生命[6],全球最常見死亡原因中,肝硬化排第11位,是目前肝移植的主要指征,給全球衛(wèi)生健康工作帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[7],故深入探究肝硬化的發(fā)病機(jī)制、診治策略頗為重要。任何病因?qū)е碌母斡不囟〞?jīng)過肝纖維化階段[3],此文綜述了肝纖維化過程中氧化應(yīng)激相關(guān)的分子和細(xì)胞機(jī)制,旨在為臨床靶向氧化應(yīng)激設(shè)計新的肝纖維化治療干預(yù)措施提供理論依據(jù)。

一、肝纖維化與氧化應(yīng)激

肝纖維化主要病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死或凋亡、ECM彌漫性沉積及肝內(nèi)外血管增殖,各種慢性肝病在轉(zhuǎn)化為肝硬化甚至肝癌時,必定會經(jīng)歷肝纖維化階段[8]。

生物體內(nèi)可發(fā)生眾多氧化還原反應(yīng),其中與氧相關(guān)的氧化還原反應(yīng)可產(chǎn)生ROS分子,其在人體正常生理功能如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等中發(fā)揮重要作用。然而,當(dāng)其過量生成,超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力時,則導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[9],氧化應(yīng)激是肝纖維化進(jìn)程中的始作俑者,多種細(xì)胞可產(chǎn)生ROS,亦可被ROS攻擊,下面進(jìn)行分別闡述。

(一)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞占肝內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的80%,是肝臟功能的主要組成部分[10],肝細(xì)胞中存在著大量可產(chǎn)生ROS的細(xì)胞器和酶[2],線粒體呼吸鏈、細(xì)胞色素酶P450家族成員及NADPH氧化酶(NOX)在內(nèi)的幾種細(xì)胞機(jī)制都能產(chǎn)生ROS[11]。作為肝臟氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)因子,酒精、藥物、高脂飲食、腸源性內(nèi)毒素[12]等均可直接引起慢性肝損傷,從而引發(fā)氧化應(yīng)激;還可作用于庫普弗細(xì)胞(kupffer cell,KC),誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。過量ROS不僅可作用于線粒體膜、細(xì)胞膜等生物膜,發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),生成過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA),損傷生物膜;還可作用于DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子,使其交聯(lián)聚合,導(dǎo)致肝細(xì)胞功能障礙甚至壞死或凋亡。一方面,肝細(xì)胞持續(xù)凋亡即可誘導(dǎo)纖維化反應(yīng)[2];另一方面,肝細(xì)胞死亡后,可釋放腫瘤壞死因子α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等炎癥因子,放大鄰近肝細(xì)胞、KC、HSC的炎癥及纖維化反應(yīng)[13]。

(二)KC KC是肝臟特異的常駐巨噬細(xì)胞,占肝臟巨噬細(xì)胞總數(shù)的85%[14],可維持肝組織穩(wěn)態(tài)及對肝損傷迅速反應(yīng)[3],是產(chǎn)生活性氧的主要細(xì)胞[2],既可被促纖維化刺激如酒精、內(nèi)毒素等直接激活[15],亦可被肝細(xì)胞壞死或凋亡時釋放的各種損傷相關(guān)分子模式(DAMPs,如游離DNA、ATP等)、炎癥因子以及致病相關(guān)分子模式(PAMPs,如脂多糖或病毒DNA等)激活[3]。其激活后不僅可釋放趨化因子、細(xì)胞因子、粘附分子等生物活性介質(zhì),還可通過NOX2與TLR信號偶聯(lián)生成過量ROS[11],作用于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及HSC,介導(dǎo)損傷及纖維化。NOX是一種催化分子氧向ROS反應(yīng)的多組分復(fù)合物,包括七種亞型,其中NOX2是人類首次在吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的NOX,它在炎癥反應(yīng)和宿主免疫防御中起著重要作用[11],有研究者發(fā)現(xiàn),NOX2缺陷的小鼠HSC的激活及肝纖維化反應(yīng)均減弱[16]。

(三)HSC HSC存在于肝血竇內(nèi)皮與肝板之間的Disse間隙,通過其胞質(zhì)突起與周圍的肝細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、其他HSC以及神經(jīng)末梢建立密切聯(lián)系[3]。正常情況下,HSC呈靜止?fàn)顟B(tài),在肝臟中主要參與脂肪的儲存以及維生素A的貯存、代謝[3]。持續(xù)的肝細(xì)胞損傷觸發(fā)炎癥因子及ROS釋放,以及肝損傷時KC介導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS,共同導(dǎo)致HSC的激活,HSC被激活后形態(tài)發(fā)生變化,胞質(zhì)脂滴減少,從靜止表型轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MF)表型,產(chǎn)生α平滑肌肌動蛋白、I型膠原、III型膠原等ECM成分[4],導(dǎo)致肝纖維化。HSC是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中最主要的參與者[17],實(shí)驗和臨床數(shù)據(jù)表明,MF在健康的肝臟中是不存在的,它們是在肝臟損傷時由其前體細(xì)胞誘導(dǎo)和激活的[11],無論何種病因所致的肝纖維化,HSC的激活是肝MF的主要來源[18]。

氧化應(yīng)激是肝纖維化的關(guān)鍵起始步驟,過量ROS既可作用于上述細(xì)胞致肝纖維化,還可通過激活NF-κB,促進(jìn)TNF-α和白介素-6(IL-6)等炎癥因子釋放,加重炎癥反應(yīng)[19],從而間接增強(qiáng)其致纖維化作用。因此,減輕氧化應(yīng)激是抑制炎癥和肝纖維化的有效策略。

二、肝纖維化與Nrf2/HO-1抗氧化通路

Nrf2由Nfe2l2基因編碼,屬于帽和領(lǐng)(cap-n-collar,CNC)家族的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子的一員,具有獨(dú)特的CNC結(jié)構(gòu)域和高度保守的bZIP結(jié)構(gòu)[20],是含有605個氨基酸的蛋白質(zhì),由7個Nrf2-ECH同源結(jié)構(gòu)域,即Neh1-7組成,這些功能域負(fù)責(zé)維持Nrf2的穩(wěn)定性及調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性[5, 21]。其中N端Neh2結(jié)構(gòu)域的兩個重要基序DLG和ETGE負(fù)責(zé)Nrf2與其負(fù)調(diào)控因子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1[22](Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)的結(jié)合[5]。bZIP基序位于Neh1結(jié)構(gòu)域,可介導(dǎo)Nrf2與ARE序列的正確結(jié)合,該結(jié)構(gòu)域還可與E2-泛素結(jié)合酶相互作用調(diào)節(jié)Nrf2的穩(wěn)定性[21]。Neh4和Neh5可以招募環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白和受體相關(guān)輔激活子-3,促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活[23]。Neh6結(jié)構(gòu)域含有豐富的絲氨酸殘基,參與Nrf2的降解[21]。

生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1特異性結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中[8]。Keap1是由624個氨基酸組成的富含半胱氨酸的同二聚體鋅指蛋白[24],由5個結(jié)構(gòu)域組成,包括BTB區(qū)域、N端區(qū)域(NTR)、中間區(qū)域(IVR)、雙甘氨酸重復(fù)區(qū)域(DGR)、C端區(qū)域(CTR)[25]。其中,DGR區(qū)域是其與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的區(qū)域,BTB結(jié)構(gòu)域為介導(dǎo)Keap1同源二聚化及與Cullin 3-環(huán)盒蛋白(Cul3-Rbx)復(fù)合物結(jié)合的部位[26]。IVR結(jié)構(gòu)域與Keap1在細(xì)胞質(zhì)中的定位相關(guān)[27]。BTB和IVR結(jié)構(gòu)域中還存在著在應(yīng)激反應(yīng)中可以感應(yīng)親電蛋白的半胱氨酸殘基,主要包括Cys273、Cys288和Cys151[28]。正常情況下,Keap1與Cul3-Rbx E3泛素連接酶復(fù)合體結(jié)合,促進(jìn)Nrf2的多泛素化,從而使其被26S蛋白酶體降解,維持其低活性狀態(tài)[29]。

當(dāng)各種肝毒性因素作用于肝臟時,細(xì)胞內(nèi)ROS增加、親電分子積累,Keap1上關(guān)鍵半胱氨酸殘基被氧化,使得Keap1-Cul3-Rbx E3泛素連接酶復(fù)合體失活[30],Nrf2降解受到影響,新生成的Nrf2不斷積累,進(jìn)而轉(zhuǎn)位入核,在細(xì)胞核內(nèi)與小肌腱膜纖維肉瘤(small musculo aponeurotic fibrosarcoma,sMaf)蛋白結(jié)合成異二聚體,進(jìn)而識別并結(jié)合ARE序列,啟動下游抗氧化保護(hù)性基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄[31],從而生成HO-1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶[8]。HO-1是其中被廣泛研究的抗氧化酶之一,由HMOX1基因編碼,又稱熱休克蛋白-32[32],在NADPH存在下將血紅素轉(zhuǎn)化為一氧化碳(CO)、二價鐵(Fe2+)和膽綠素;Fe2+通過增加鐵蛋白的合成起到抗氧化作用;膽綠素可被膽綠素還原酶還原為膽紅素,膽紅素亦是一種有效的抗氧化劑[33];CO可激活細(xì)胞信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,起到擴(kuò)張血管、松弛平滑肌和解聚血小板的功能,亦有抵消促炎細(xì)胞因子級聯(lián)的作用[34]。綜上,在氧化應(yīng)激發(fā)生時,HO-1及其產(chǎn)物可通過抗氧化損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)減輕肝纖維化[35]。

有研究者通過制備肝細(xì)胞特異性Nrf2缺乏的小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗,得出了肝細(xì)胞特異性Nrf2缺乏小鼠比對照組小鼠對四氯化碳所致氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、纖維化反應(yīng)更為敏感的結(jié)論,進(jìn)一步證實(shí)Nrf2是抵御肝損傷和纖維化的關(guān)鍵因素[36]。亦有學(xué)者通過實(shí)驗證明,間充質(zhì)干細(xì)胞、紅樹莓提取物等均可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制肝臟氧化應(yīng)激、炎癥和肝纖維化[19, 37]。

三、總結(jié)

目前臨床用于肝纖維化治療的藥物很少,肝移植是目前治療肝纖維化最有效的方法,然而,供體器官短缺、費(fèi)用高昂、免疫排斥反應(yīng)、手術(shù)并發(fā)癥等諸多因素限制了其廣泛開展[19]。

Nrf2 /HO-1信號通路因其可通過抗氧化應(yīng)激達(dá)到抗肝纖維化的目的,成為具吸引力的藥理學(xué)新靶點(diǎn),被越來越多的學(xué)者關(guān)注。研究表明,某些中草藥[37]以及天然存在的化合物[38]可能通過激活Nrf2提升抗氧化能力,從而減輕肝臟纖維化,然而由于作用機(jī)制尚不夠明確等原因,使其臨床應(yīng)用受到限制,應(yīng)對這部分藥物進(jìn)行深入研究,明確其臨床治療肝纖維化的可行性。

多項研究表明,益生菌可能通過Nrf2/HO-1通路減輕藥物、酒精等所致的肝損傷[39],還可減弱肝纖維化患者及動物模型的氧化應(yīng)激水平[40],增強(qiáng)其抗氧化能力,但關(guān)于益生菌能否通過Nrf2/HO-1通路減輕肝纖維化,目前研究較少。益生菌具有肝毒性小、副作用少、與其他藥物相互作用少等優(yōu)點(diǎn),可通過更多前瞻性臨床試驗挖掘其潛在益處。

引起肝纖維化的病因諸多,應(yīng)明確不同病因致纖維化機(jī)制的不同,從而進(jìn)行更有針對性的靶向治療。應(yīng)繼續(xù)研究其他可作用于Nrf2/HO-1通路的激活劑。此外,HSC、KC等在肝纖維化發(fā)展中的作用亦至關(guān)重要,以HSC為靶點(diǎn),抑制膠原纖維形成的藥物現(xiàn)已在研究。Nrf2/HO-1通路激活劑與其他藥物聯(lián)合使用,多管齊下,可能是減輕肝纖維化的更好的潛在治療方法。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。