傅文婷,江惠華,鐘文謠,李銘臻

脆性位點是人類基因組中的特定染色體區(qū)域,在缺乏葉酸和胸苷的培養(yǎng)基中易形成如缺失、裂隙和無著絲粒片段等染色體異常。脆性位點根據(jù)其在群體中的頻率分為罕見型和普通型兩大類。罕見型脆性位點在人群中的發(fā)生率<5 %[1]。有學者認為脆性位點是染色體正常變異,但有報道認為脆性位點攜帶者的流產率和后代的染色體異常率增高[2]。在16號染色體上有三類脆性部位,包括對葉酸敏感的FRA16A、可用遠霉素A誘導的FRA16B和FRA16E[3],其中FRA16B(16q22.1)最為常見。有研究認為FRA16B與hsa-mir-328、hsa-mir-140 miRNA有關聯(lián)[4],并與復發(fā)性流產和男性不育相關[5]。本文應用染色體G顯帶技術和基因組拷貝數(shù)變異測序,確診1例男性fra16q22攜帶患者,現(xiàn)報道如下。

1 病例資料

患者,男,37歲,身高172 cm,體重68 kg,平素體健,無既往病史。2017年結婚,性生活正常,未避孕未育。精子總數(shù)417.54百萬/mL,精子存活率41%,精子濃度102.2百萬/mL,總活力(PR+NP)百分率32.7%,正常形態(tài)10個(4.8%),異常形態(tài)197個(95.2%),頭部缺陷190個(91.8%),頸部和中段缺陷92個(44.4%),主段缺陷45個(21.7%)。臨床診斷為不育癥和畸形精子癥。內分泌激素、Hb電泳、地中海貧血基因和致畸4項結果未見異常。妻子染色體核型、地中海貧血、內分泌激素、抗子宮內膜抗體和抗精子抗體等檢查均未見異常。

1.1 檢測方法

1.1.1 染色體G顯帶分析 采用常規(guī)染色體G顯帶核型分析技術,按照《人類細胞基因組學國際命名體系》(ISCN2020)的標準進行核型分析,計數(shù)20個分裂相,分析5個核型,如懷疑嵌合體,則加數(shù)到100個分裂相。第一次培養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn)核型異常后,考慮脆性位點易受培養(yǎng)液和實驗過程的影響,遂通知患者重新采血,用兩個不同廠家的培養(yǎng)液進行第二次常規(guī)培養(yǎng),加大計數(shù)到131個分裂相,并分析了13個核型。

1.1.2 基因組拷貝數(shù)變異測序 將患者外周血進行核酸提取和純化;對血液中提取的人基因組DNA酶切打斷,在其兩端添加測序接頭,再通過磁珠分選富集200～500 bp大小的文庫片段,構建好測序文庫。利用DNA納米球技術對測序文庫進行擴增,形成測序模板,通過基于聯(lián)合探針錨定聚合測序技術的基因測序儀進行測序。利用生物信息學軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析,得到匹配到每條染色體上的有效序列數(shù)量,計算有效序列數(shù)量與參考數(shù)據(jù)庫中相應染色體序列數(shù)量的比值,判斷染色體非整倍體異常。

1.2 結果

(1)染色體核型分析:兩次細胞培養(yǎng),第一次核型結果為mos 46,XY,del(16)(q22)[27]/46,XY,fra(16)(q22)[16]/46,XY[39],第2次分析核型時加數(shù)到131個細胞,結果顯示mos 46,XY,del(16)(q22)[39]/46,XY,fra(16)(q22)[31]/47,XY,del(16)(q22),+chtb(16)(qter→q22)[18]/46,XY[43](見圖1),與第1次結果相比,異常細胞類型多了一種,異常細胞數(shù)目略有差別。

注:A:46,XY,del(16)(q22);B:46,XY,fra(16)(q22);C:47,XY,del(16)(q22),+chtb(16)(qter→q22);D:46,XY

(2)基因組拷貝數(shù)變異測序:依據(jù)ACMG(2019)指南[6]對所有變異進行致病性評級,將所有變異分為5類:致病性、可能致病性、臨床意義未明、可能良性和良性。根據(jù)指南共識建議進行結果報告,報告標準為染色體非整倍體、100 Kb以上已知明確致病的CNVs以及1 Mb以上的基因組缺失或重復。經分析本例患者結果未見染色體重復和缺失(圖2,見彩插2)。

2 討論

脆性位點是指染色體上一些特殊的部位,和染色體上特定的區(qū)帶相關,以顯性孟德爾方式遺傳。根據(jù)其在群體中的頻率分為罕見型和普通型。罕見型脆性位點可由富含AT的DNA配體或核苷酸類物質誘導,有不穩(wěn)定的三核苷酸重復序列。普通型可用阿非迪霉素誘導,除了有數(shù)目高度可變的(TAA)重復序列外,其端粒側還有與DNA復制有關的重復Alu序列[7]。雖然脆性位點表達的機制仍未明確,但有研究表明,所有脆性位點都可能會發(fā)生延遲復制,從而使具有穩(wěn)定二級結構的DNA序列在復制過程中受到阻礙,導致基因組未復制的區(qū)域在中期出現(xiàn)裂隙和斷裂[8]。人群中除了與臨床表型明確相關的脆性X綜合征外,脆性位點攜帶者通常認為是正常變異,無臨床異常表型和生育影響[9]。但也有學者認為,脆性位點能形成二級結構,這些結構可干擾DNA復制和轉錄等過程,導致配子或胎兒細胞染色體結構發(fā)生斷裂或重排,造成流產、死胎等[10]。

16號染色體可不經誘導在常規(guī)培養(yǎng)基中產生脆性[11],位于染色體16q22。fra16q22同時具有普通型和罕見型脆性位點的特征[12],可作為脆性位點的研究模型。該脆性位點可能與外界環(huán)境如輻射、接觸農藥等有關,所以當臨床遇到此類患者時,應注意:① 首先詢問患者的職業(yè),排除接觸史;② 重新采血檢測,用不同廠家的培養(yǎng)液平行培養(yǎng),以排除實驗過程的因素;③ 再次檢測結果仍然異常,則需進行基因層面的檢測,以判斷16q22斷裂點位置是否存在遺傳物質的缺失。

本例患者從事財務工作,健康狀況良好。外周血淋巴細胞在未經誘導的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng),出現(xiàn)fra1622嵌合型核型,涉及染色體裂隙、斷裂、缺失等多種異常,為排除實驗因素的影響,和患者溝通后重新抽血,用兩種不同品牌的培養(yǎng)液重新培養(yǎng),并加大了細胞計數(shù)。兩次核型結果大致相同,異常細胞數(shù)目略有差別,第二次培養(yǎng)異常細胞類型多了一種。因患者異常細胞比例超過了39%,考慮其為真性嵌合。臨床工作中要重視細胞計數(shù),當遇到可疑脆性位點核型時,為避免漏檢,至少需計數(shù)100個細胞[13]。由于α-珠蛋白鏈基因位于16號染色體,為排除α-珠蛋白鏈異常,同時進行了血紅蛋白(Hb)電泳和地中海貧血基因檢測,患者結果均未見異常。

在健康人群中,16q22區(qū)域的脆性位點普遍認為是正常變異,不與特定的臨床病征相關。但有研究者認為,盡管16q22脆性位點沒有表型效應,但它可能與不育、自然流產、雙側隱睪癥、嚴重少精子癥等有關[14]。本例患者的精子亦存在異常,其精子異常形態(tài)197個(95.2%),頭部缺陷190個(91.8%),頸部和中段缺陷92個(44.4%),主段缺陷45個(21.7%),臨床診斷為畸形精子癥。Aswini等[15]報道了1例復發(fā)性流產的罕見病例,夫婦雙方都是fra16(q22)脆性位點攜帶者。Martorell等[16]報道了1對不育夫婦,男方外周血存在fra16q22.1,精液FISH(熒光原位雜交)發(fā)現(xiàn)98.6%的精子正常,異常包括16p重復(0.19%)、16p(0.39%)和16q(0.59%)的缺失。進一步對患者的胚胎通過胚胎植入前遺傳學檢測(PGT),發(fā)現(xiàn)有2枚胚胎異常,分別為16p部分單體和16q部分三體,提示fra16q22.1的存在可能會增加后代染色體異常和自然流產的風險。

根據(jù)患者的檢測結果及文獻復習,考慮本例患者的不育可能跟16q22脆性位點有關。鑒于患者婚后3年不育,且染色體存在較高比例的fra16q22,較易形成核型異常的胚胎,為降低自然流產和生育異常后代的風險,建議患者行體外受精(IVF)獲得胚胎,并進行PGT。越來越多研究表明脆性位點與腫瘤的發(fā)生有關[17],故建議患者定期檢查健康狀況?；颊哂?021年4月在本地醫(yī)院行體外受精和PGT,經兩次移植順利妊娠單胎。胎兒孕期檢查和羊水染色體核型均正常,足月順產一男嬰。隨訪至今嬰兒發(fā)育正常,患者亦無異常表現(xiàn)。

綜上所述, fra16q22攜帶者的臨床表型異質性較強,16q22脆性位點的重要性尚未得到充分評估,明確脆性位點不穩(wěn)定性的機理和基因的表達調控,以及脆性位點與疾病之間的關系,可以為患者后續(xù)的精準治療和產前診斷提供線索,同時可進行優(yōu)生優(yōu)育和提高人口素質。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。