李家政,繆楊陽 綜述,郭 勇 審校

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科,江蘇蘇州 215000

近年來,由于惡性腫瘤的高發(fā)病率及化療藥物、廣譜抗菌藥物和免疫抑制劑等在臨床的廣泛應(yīng)用,侵襲性真菌感染的發(fā)生率和病死率呈明顯上升趨勢[1]。真菌感染的臨床表現(xiàn)復(fù)雜,頑固難治愈,易誤診誤治,早期抗真菌治療對患者生存至關(guān)重要?？拐婢委煵怀浞?、延遲開始治療時間均會增加患者的病死率[2]。傳統(tǒng)的真菌鑒定方式,尤其是絲狀真菌的鑒定,主要依賴形態(tài)學(xué)方法。由于檢驗人員專業(yè)水平和經(jīng)驗參差不齊,其準(zhǔn)確性和時效性較差,鑒定困難和鑒定錯誤的情況時有發(fā)生,進而導(dǎo)致治療失敗、病情延誤。雖然分子測序技術(shù)是真菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但其操作復(fù)雜、價格昂貴且對實驗條件和人員要求較高,難以在臨床實驗室常規(guī)開展?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是一種跨學(xué)科的檢測新技術(shù),具有適應(yīng)范圍廣、快速、準(zhǔn)確、高通量、經(jīng)濟、操作方便等優(yōu)勢[3]。近幾十年來,科研人員對MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床真菌的快速鑒定、藥敏試驗等方面不斷探索和實踐,在一定程度上彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子測序技術(shù)上的不足。影響質(zhì)譜鑒定真菌的因素比較復(fù)雜,尤其是絲狀真菌,在培養(yǎng)條件、蛋白質(zhì)提取方法、蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫均不同的條件下,鑒定結(jié)果具有較大差異,仍需進行改進和完善[4]。本文基于近幾年來MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床真菌鑒定和診斷中的應(yīng)用進展,總結(jié)出不同檢測條件對鑒定結(jié)果的影響,旨在為臨床實驗室實施MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定真菌提供相應(yīng)信息。

1 培養(yǎng)條件對MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定真菌的影響

絲狀真菌受生長條件和真菌菌絲體區(qū)域的影響,呈現(xiàn)出可變的表型。菌齡、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件等均可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)譜差異,干擾樣品的正確鑒定。有研究顯示,來源相同的尖孢鐮刀菌株,在兩種不同瓊脂培養(yǎng)基平板溫度為25 ℃的環(huán)境下生長1周,蛋白質(zhì)譜具有明顯差異,隨著時間的推移,即使在含有相同培養(yǎng)基的瓊脂平板上,也會對蛋白質(zhì)譜產(chǎn)生影響,特別是蛋白質(zhì)峰的相對高度[5]。絲狀真菌的孢子和菌絲體具有不同的生物相和蛋白質(zhì)圖譜,在采集固體培養(yǎng)基上的絲狀真菌樣品時,二者往往被同時采集,進而影響鑒定結(jié)果。布魯克系統(tǒng)建議用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀真菌,因為液體培養(yǎng)基中絲狀真菌分離物主要是菌絲體,可以提高蛋白質(zhì)譜質(zhì)量。但由于液體培養(yǎng)基存在霧化孢子污染風(fēng)險和無法可視化宏觀和微觀表型特征的缺點,臨床實驗室仍然以直接從固體培養(yǎng)基中收集真菌樣品為主,以簡化樣品制備過程并節(jié)省時間。

對于酵母菌,使用不同的培養(yǎng)基同樣會對MALDI-TOF MS技術(shù)的鑒定對數(shù)評分值有明顯影響[6]。一般而言,采用MALDI-TOF MS技術(shù)分析的菌落,應(yīng)選擇已經(jīng)經(jīng)過所用檢測系統(tǒng)制造商驗證的培養(yǎng)基,以提高鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫的匹配度,保證鑒定質(zhì)量?？傊?用戶應(yīng)了解制造商推薦的培養(yǎng)基優(yōu)、缺點及其孵育條件,以提高MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定真菌的性能。

2 標(biāo)本制備對MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定真菌的影響

對MALDI-TOF MS技術(shù)來說,標(biāo)本制備及合適的蛋白質(zhì)提取方法是影響鑒定靈敏度、分辨率和再現(xiàn)性的關(guān)鍵步驟。標(biāo)本制備不當(dāng)會導(dǎo)致較低的峰分辨率,影響鑒定結(jié)果?；贛ALDI-TOF MS技術(shù)的絲狀真菌鑒定在過去幾年受到限制,主要原因是缺乏高效的樣品制備方法來保證高質(zhì)量的蛋白質(zhì)譜。與細菌不同,真菌可以通過簡單的預(yù)處理方法快速準(zhǔn)確地獲得鑒定結(jié)果,而真菌的傳統(tǒng)預(yù)處理方法,特別是絲狀真菌則更為復(fù)雜,涉及乙醇、甲酸、乙腈等試劑和離心等提取過程,不同絲狀真菌蛋白質(zhì)提取方法對質(zhì)譜鑒定結(jié)果的影響差異較大。

HONSIG等[7]根據(jù)MALDI-TOF MS技術(shù)制造商提供的3種不同標(biāo)本制備方法,比較各自在鑒定絲狀真菌物種水平的識別率,結(jié)果顯示,液體培養(yǎng)有效識別率最高(76.1%),優(yōu)于細胞裂解法(62.0%)和完整細胞法(48.9%)。除制造商推薦的樣本制備方法外,在臨床工作中,廣大科研人員也不斷探索和開發(fā)出了許多新的樣本制備方法。PENG等[8]描述了一種更方便、省時、省試劑、靈敏的預(yù)處理方法:甲酸夾層法。使用安圖生物質(zhì)譜儀的Autof MS系統(tǒng)時,甲酸夾層法能夠?qū)崿F(xiàn)93.9%的物種級鑒定;當(dāng)臨床庫、科研庫、內(nèi)部數(shù)據(jù)庫結(jié)合使用時,使用梅里埃公司的VITEK MS系統(tǒng)能實現(xiàn)97.3%的物種級鑒定。NING等[9]創(chuàng)建了兩種快速提取絲狀真菌蛋白質(zhì)的方法:氧化鋯-二氧化硅磁珠法(ZSB)和聚焦超聲法(FUS),并使用VITEK MS系統(tǒng)評估了兩種方法的識別精度。按制造商推薦的常規(guī)蛋白質(zhì)提取方法,VITEK MS系統(tǒng)物種級正確鑒定率為76.42%,ZSB和FUS物種級正確鑒定率分別為79.67%和76.42%。按制造商推薦的常規(guī)蛋白質(zhì)提取程序,每個絲狀真菌預(yù)處理時間至少需要30 min,而ZSB和FUS分別將每份標(biāo)本的操作時間減少至7 min或5 min,每個額外的菌株只需多出幾秒,從而節(jié)省了大量時間。

通常,實驗技術(shù)人員采用的預(yù)處理方法和策略基于他們的經(jīng)驗或?qū)嶒炇覙?biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,但這種模式可能會導(dǎo)致反復(fù)鑒定,給日常工作帶來負擔(dān),造成時間、人員、耗材等成本的浪費。因此,實驗人員需開拓思維,根據(jù)情況選擇適當(dāng)?shù)姆治銮邦A(yù)處理方法,提高MALDI-TOF MS技術(shù)的鑒定效率和準(zhǔn)確率。

3 數(shù)據(jù)庫對MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定真菌的影響

微生物數(shù)據(jù)庫是MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定的關(guān)鍵組成部分,菌株識別的準(zhǔn)確率主要依靠菌株數(shù)據(jù)庫的功能,尤其是新物種的鑒定對其依賴性更強。目前,在臨床實驗室主要的數(shù)據(jù)庫有布魯克公司的Biotyper系統(tǒng)、梅里埃公司的VITEK MS系統(tǒng)和安圖生物公司的Autof MS系統(tǒng)等。現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫均不夠完善,臨床真菌的鑒定準(zhǔn)確率在不同系統(tǒng)之間存在一定差異。

有研究對各數(shù)據(jù)庫中存在的菌株進行了評價,對于絲狀真菌,Biotyper系統(tǒng)進行種、屬或復(fù)合物的鑒定準(zhǔn)確率為76.7%,高于VITEK MS系統(tǒng)的50.0%;對于酵母菌,Biotyper系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率為82.9%,低于VITEK MS系統(tǒng)的93.3%。對于數(shù)據(jù)庫中不存在的真菌,VITEK MS系統(tǒng)比Biotyper系統(tǒng)給出了更多的錯誤識別[10]。還有相似的研究也顯示,Biotyper系統(tǒng)對酵母菌株物種水平的鑒定率稍遜于VITEK MS系統(tǒng)[11]。最近有研究評估了3種不同的MALDI-TOF MS系統(tǒng)在鑒定臨床絲狀真菌方面的表現(xiàn),VITEK MS系統(tǒng)最具有優(yōu)勢,96.0%菌株鑒定到物種水平,98.4%到屬水平;Biotyper系統(tǒng)42.1%菌株鑒定到物種水平,42.9%到屬水平;Autof MS系統(tǒng)58.7%菌株鑒定到物種水平,60.3%到屬水平[12]。在鑒定不同物種復(fù)合物內(nèi)的酵母分離物方面,Autof MS系統(tǒng)比VITEK MS系統(tǒng)具有更高的鑒定準(zhǔn)確性,在系統(tǒng)密切相關(guān)的物種復(fù)合物中鑒定不太常見的物種方面,VITEK MS系統(tǒng)的鑒定能力仍有待提高[13]。性能識別方面,Autof MS系統(tǒng)與Biotyper系統(tǒng)相當(dāng),但Autof MS系統(tǒng)在數(shù)據(jù)庫中提供了更多的真菌物種級結(jié)果,測試時間大約是Biotyper系統(tǒng)的一半[14],在臨床微生物實驗室中,能夠提供更高的通量。

在數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建過程中,其覆蓋范圍、類型等至關(guān)重要。目前有很多機構(gòu)致力于構(gòu)建內(nèi)部參考數(shù)據(jù)庫,以提高MALDI-TOF MS技術(shù)對罕見的、新興的或地方性真菌的識別率。MALDI-TOF MS技術(shù)自建庫的構(gòu)建需用數(shù)據(jù)庫中沒有的真菌分離株或物種不斷擴展和更新,并用其他數(shù)據(jù)庫或者方法相互驗證。目前由于各實驗室相對獨立,不同自建庫不能夠共享,因此,開發(fā)可在線獲取的參考頻譜數(shù)據(jù)庫十分必要。在線獲取的參考頻譜數(shù)據(jù)庫的開發(fā),能促進不同實驗室間進行相互驗證和補充,達到資源優(yōu)化和共享,提高MALDI-TOF MS技術(shù)的診斷效率和拓寬應(yīng)用范圍。

4 MALDI-TOF MS技術(shù)在檢測抗真菌藥敏試驗(AFST)方面的應(yīng)用

現(xiàn)階段,根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)和歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會的指南,AFST的參考方法為肉湯稀釋法,但這種方法需要較長的時間,會延誤患者及時抗真菌治療的時間。

基于MALDI-TOF MS技術(shù),對AFST進行了兩種相對較新的嘗試:第一種是基于暴露在不同濃度抗真菌藥物時真菌圖譜的變化,根據(jù)得到的復(fù)合相關(guān)指數(shù)(CCI)作出推斷[15]。第二種是基于MALDI Biotyper系統(tǒng)快速測定抗菌藥物敏感性試驗(MBT ASTRA),針對不同濃度的抗真菌劑確定感染因子的生長狀況,并與提供相對生長比(RG)的無藥物對照組比較,通過定義臨界值且根據(jù)相應(yīng)抗真菌濃度的RG,將病原體的生長量分類為易感或耐藥[16]。

基于MALDI-TOF MS技術(shù)的AFST,目前沒有廣泛應(yīng)用于臨床真菌性疾病的診斷,各實驗室仍處于探索研究階段,一些研究通過CCI獲得了很高的診斷值,但這些結(jié)果具有一定差異[17-18]。VATANSHENASSAN等[16]通過采用MBT ASTRA和CLSI指南推薦的肉湯稀釋法,比較分析了對卡泊芬凈耐藥的白色念珠菌和光滑念珠菌的檢測數(shù)據(jù),驗證了MBT ASTRA方法,結(jié)果顯示,與肉湯稀釋法比較,白色念珠菌MBT ASTRA檢測的靈敏度和特異度均為100.0%;光滑念珠菌MBT ASTRA檢測的靈敏度、特異度和有效性分別為94.0%、80.0%和95.0%[16]。KNOLL等[19]通過Meta分析,系統(tǒng)評價了基于MALDI-TOF MS技術(shù)檢測酵母菌和絲狀真菌對唑類和棘白菌素類抗真菌藥物的耐藥性,與肉湯稀釋法比較,基于MALDI-TOF MS技術(shù)的耐藥性檢測具有91.1%的靈敏度和95.1%的特異度。MBT ASTRA方法的總體靈敏度達到96.0%,優(yōu)于CCI的85.3%,兩種方法的特異度相似,分別為93.2%和94.2%[19]。

AFST模式在物種之間可能有較大差異,因此,快速、可靠地鑒定真菌耐藥性對患者管理及改善預(yù)后至關(guān)重要[20]。AFST常用方法的周轉(zhuǎn)時間為24～48 h,MBT ASTRA周轉(zhuǎn)時間在8 h以內(nèi)[19]。因此,基于MALDI-TOF MS技術(shù)的AFST,有望成為臨床實驗室快速準(zhǔn)確檢測真菌耐藥性的一種方法。

5 展 望

盡管MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床真菌診斷領(lǐng)域存在一定局限,但在過去幾年中,MALDI-TOF MS技術(shù)具有的易用性、低耗時、低成本及高通量等特點改變了臨床實踐,為臨床實驗室診斷真菌感染做出了貢獻。由于新病原體的出現(xiàn)及不斷變化的微生物分類學(xué)的推動,未來的研究需進一步改進和擴展真菌參考數(shù)據(jù)庫,優(yōu)化培養(yǎng)和提取蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序,加強MALDI-TOF MS技術(shù)在真菌藥敏試驗、真菌菌株分型等方面的應(yīng)用,實時探索臨床真菌物種的演變多樣性?？傊?MALDI-TOF MS技術(shù)的發(fā)展為真菌病的臨床和治療管理提供了新方向,為個性化醫(yī)療提供了巨大潛力。