姜 恒,張 哲,江 申 綜述,董 妥△ 審校

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生微生物學(xué)教研室,黑龍江哈爾濱 150081;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室,黑龍江哈爾濱 150081

呼吸道感染常由多種病原體,包括病毒、細(xì)菌、支原體等引起[1],其中呼吸道病毒或直接、或作為增效病原體、或作為輔助因素參與呼吸道感染的發(fā)生和發(fā)展[2]。常見(jiàn)的呼吸道病毒包括流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒及引發(fā)全球大流行的新型冠狀病毒等。由于呼吸道病毒傳染性強(qiáng)、傳播途徑廣且缺乏特效藥物[3],因此,早檢測(cè)、早診斷是阻斷呼吸道病毒傳播的重要手段。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)雖在準(zhǔn)確性和權(quán)威性方面有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),但因操作繁雜、耗時(shí)較長(zhǎng)及生物安全風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)[4],無(wú)法滿(mǎn)足臨床檢測(cè)需求?，F(xiàn)階段主要使用的檢測(cè)方法包括核酸檢測(cè)及免疫學(xué)檢測(cè),均存在需配備專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室、人員需經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)、成本過(guò)高、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)等特點(diǎn)[5],已無(wú)法滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的呼吸道病毒大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。因此,新型呼吸道病毒檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)迫在眉睫。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)作為一種已在多領(lǐng)域應(yīng)用的重要光譜學(xué)檢測(cè)技術(shù)[6-7],具有優(yōu)良的靈敏度和特異度[8],具備成為一種大規(guī)模呼吸道病毒快速檢測(cè)新技術(shù)的潛力。拉曼散射是指當(dāng)光照射到物質(zhì)上發(fā)生散射時(shí),波長(zhǎng)發(fā)生變化的散射光被稱(chēng)為拉曼散射。波長(zhǎng)發(fā)生改變的原因是光子與被照射物質(zhì)分子間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移后,分子振動(dòng)能級(jí)發(fā)生了改變[9],而光子在不同物質(zhì)上發(fā)生拉曼散射時(shí)轉(zhuǎn)移的能量不同,就可特異性識(shí)別被照射物質(zhì)種類(lèi)。而SERS技術(shù)則是在普通拉曼散射的基礎(chǔ)上將被照射物質(zhì)貼附于粗糙貴金屬表面,使拉曼信號(hào)強(qiáng)度獲得極大提升。目前,SERS增強(qiáng)機(jī)制主要包括物理增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)。物理增強(qiáng)主要依靠電磁場(chǎng)增強(qiáng)[10];化學(xué)增強(qiáng)主要依靠非共振增強(qiáng)、共振增強(qiáng)及類(lèi)共振增強(qiáng)[11]。在普通拉曼散射固有的無(wú)損分析、不受水成分影響、樣品不需要復(fù)雜處理、檢測(cè)速度快、使用便攜式儀器可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)分析等優(yōu)勢(shì)基礎(chǔ)上,SERS技術(shù)具有更高的靈敏度,在某些條件下可以達(dá)到單分子檢測(cè)水平。本文利用SERS技術(shù)對(duì)以新型冠狀病毒、腺病毒、流感病毒為代表的多種呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)的研究進(jìn)展及應(yīng)用作一綜述,為尋求更理想的呼吸道病毒檢測(cè)方法提供可行的研究思路。

1 SERS在新型冠狀病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

新型冠狀病毒是第7種可感染人類(lèi)的冠狀病毒類(lèi)型[12],由于其傳染性極強(qiáng)且尚無(wú)具有明確效果的治療藥物[13],因此,開(kāi)發(fā)一種超快速、高靈敏的新型檢測(cè)方法尤為重要。樂(lè)瑋等[14]利用金納米顆粒(Au NPs)對(duì)新型冠狀病毒的刺突蛋白進(jìn)行了無(wú)標(biāo)記SERS檢測(cè),帶負(fù)電的羧基基團(tuán)與Au NPs表面吸附的檸檬酸根離子產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)吸附而發(fā)生分子增強(qiáng),氨基則與Au NPs發(fā)生了電磁增強(qiáng)效應(yīng),使新型冠狀病毒的刺突蛋白拉曼信號(hào)明顯增強(qiáng),其最低檢測(cè)下限達(dá)到1 mmol/L。樂(lè)瑋等[14]方法不同于以病毒核酸或抗體為靶點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),而是從病毒抗原蛋白入手,與目前常用的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)比較,該新型檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)更短;與膠體金試紙法比較則避免了出現(xiàn)假陰性誤判的問(wèn)題。ZHANG等[15]開(kāi)發(fā)了一種基于新型的油/水/油三相液-液界面自組裝工藝的超靈敏生物傳感器以檢測(cè)未處理唾液中的新型冠狀病毒,利用上述工藝將兩層Au NPs固定在硅晶片上形成SERS活性基底,再將特異性刺突蛋白抗體偶聯(lián)到基底上以捕獲刺突蛋白,并使用拉曼報(bào)告分子標(biāo)記的銀納米顆粒(Ag NPs)作為標(biāo)記來(lái)識(shí)別抗原的種類(lèi)和濃度。這種夾層免疫結(jié)構(gòu)自組裝方式使納米顆粒單層具有良好的均勻性和重復(fù)性,保證SERS檢測(cè)的高靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。LEONG等[16]設(shè)計(jì)了一款基于SERS的手持式新型冠狀病毒檢測(cè)儀,其內(nèi)包含了搭載3組SERS探針?lè)肿?分別為2-巰基苯甲酸、4-巰基吡啶和三磷酸腺苷)的芯片,SERS探針?lè)肿痈街贏g NPs表面。被檢者向設(shè)備呼氣10 s左右,由于呼氣中的新型冠狀病毒生物標(biāo)志物會(huì)與傳感器發(fā)生化學(xué)反應(yīng),故可根據(jù)SERS信號(hào)的變化對(duì)反應(yīng)后的化合物進(jìn)行表征。在醫(yī)院和機(jī)場(chǎng)對(duì)501人進(jìn)行的新型冠狀病毒現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果表明,LEONG等[16]設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法的假陰性率為3.8%,假陽(yáng)性率為0.1%,這與聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性相當(dāng),但費(fèi)用更低,可在5 min內(nèi)完成檢測(cè)。此外,LEONG等[16]設(shè)計(jì)的儀器不僅可檢測(cè)生物源揮發(fā)性有機(jī)物種類(lèi)改變,還可用于篩查其他類(lèi)型呼吸道病毒感染。

為滿(mǎn)足超快速、高靈敏、低成本的檢測(cè)需求,無(wú)標(biāo)記直接捕獲病毒粒子本身SERS信號(hào)顯得尤為重要。ZHANG等[17]采用硼氫化鈉作為還原劑制備Ag NPs,不僅可避免檸檬酸鈉本身的雜峰信號(hào),而且還會(huì)阻止Ag NPs表面氧化銀的形成,以增強(qiáng)其與病毒表面氨基的結(jié)合,硼氫化鈉還可以誘導(dǎo)Ag NPs聚集成熱點(diǎn),明顯增強(qiáng)病毒粒子的拉曼信號(hào),最低檢測(cè)下限可達(dá)10 copy/mL。此外,可通過(guò)主成分分析方法,利用SRES技術(shù)無(wú)標(biāo)記鑒別唾液及血清中的新型冠狀病毒、H1N1流感病毒、人腺病毒,具有較好的臨床應(yīng)用前景。

2 SERS在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

流感病毒具有較高的傳染性和突變率,可造成季節(jié)性流行甚至全球性大流行,給公共健康帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[18]。因此,需要探索一種較常規(guī)的、更加準(zhǔn)確敏捷的流感病毒檢測(cè)方法,以便在流感暴發(fā)前通過(guò)及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)來(lái)遏制其蔓延。將SERS技術(shù)應(yīng)用到流感病毒檢測(cè)這一方向已有諸多研究,CHEN等[19]開(kāi)發(fā)了一種基于SERS的雙模DNA適配體傳感器,可實(shí)現(xiàn)對(duì)H1N1流感病毒的快速診斷與鑒別診斷,該傳感器裝配了包裹有H1N1流感病毒特異性DNA適配體的罌粟花狀A(yù)u NPs,當(dāng)流感病毒靠近傳感器時(shí),相應(yīng)的DNA適配體與病毒結(jié)合,Au NPs選擇性地脫離底物,使報(bào)告分子峰強(qiáng)度發(fā)生改變,此外,該傳感器還能夠定量評(píng)估流感病毒濃度且不受交叉反應(yīng)的影響。KIM等[20]開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)流感病毒H275Y耐藥突變株(pH1N1)的SERS檢測(cè)免疫探針。將可與突變株特異性結(jié)合的6E3抗體包被在Au NPs表面,當(dāng)探針與pH1N1毒株結(jié)合后,其會(huì)在納米顆粒和基板之間形成熱點(diǎn),可明顯增強(qiáng)報(bào)告分子的SERS特征峰強(qiáng)度,且特征峰強(qiáng)度與病毒濃度呈正相關(guān)。利用KIM等[20]的檢測(cè)方法可在人鼻咽部抽吸物中捕獲到pH1N1毒株的SERS信號(hào),說(shuō)明該技術(shù)在診斷耐藥突變毒株感染方面具有應(yīng)用潛力。此外,吳佳豈[21]將免疫磁珠與SERS技術(shù)聯(lián)合,通過(guò)H5N1亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體與鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)制備成免疫磁珠,與Au NPs分別組合成“一抗三明治”和“雙抗夾心式”兩種結(jié)構(gòu)。其中,利用“雙抗夾心式”結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)基底對(duì)H5N1亞型禽流感的最低檢測(cè)下限可達(dá)6×103copy/μL,具有高特異度、高穩(wěn)定性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì),并且可在1 h內(nèi)快速完成檢測(cè)。WANG等[22]利用SERS-側(cè)流免疫層析技術(shù),將Fe3O4包被的Ag NPs作為磁性材料,特異性地識(shí)別和磁性富集溶液中的H1N1流感病毒?；诖?磁性SERS試紙條可直接用于真實(shí)的臨床標(biāo)本檢測(cè),而不需要任何預(yù)處理步驟。WANG等[22]的研究方法針對(duì)H1N1病毒的最低檢測(cè)下限可達(dá)50 PFU/mL,相對(duì)于傳統(tǒng)膠體金抗原檢測(cè)法提高了2 000倍,是一種可用于病毒感染早期診斷的潛在工具。

3 SERS在腺病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

腺病毒可在兒童和成人中引起多種疾病,主要影響呼吸系統(tǒng)、眼睛和消化系統(tǒng),是呼吸道感染的主要病原體之一[23]。近年來(lái),我國(guó)多出現(xiàn)呼吸道人腺病毒的局部暴發(fā)[24],尤其是在學(xué)校、軍隊(duì)等聚集人群中,腺病毒的危害更加明顯[25]。劉真真等[26]利用基于雙層拉曼分子2-硝基苯甲酸修飾的銀包金納米顆粒構(gòu)建了拉曼報(bào)告分子-抗原-抗體特異性結(jié)合的“三明治”夾心結(jié)構(gòu),結(jié)合SERS-側(cè)流免疫層析技術(shù)可在15 min內(nèi)對(duì)人腺病毒實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)。同時(shí),由于劉真真等[26]研究的方法具有較高的穩(wěn)定性,其定量范圍可達(dá)0.1～1 000.0 ng/mL,理論最低檢測(cè)下限為0.1 ng/mL,可視化最低檢測(cè)下限為10.0 ng/mL。此外,利用劉真真等[26]研究的增強(qiáng)基底還將腺病毒與包括登革熱病毒、黃熱病毒、西尼羅河病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒在內(nèi)的5種新發(fā)傳染病病原體進(jìn)行特異性鑒定,結(jié)果表明,基于SERS-側(cè)流免疫層析技術(shù)的檢測(cè)方法具有高度特異性,不存在交叉反應(yīng)。作者認(rèn)為,劉真真等[22]研究的檢測(cè)方法耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、成本低,在腺病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域有巨大應(yīng)用潛力。張曉蕾[27]設(shè)計(jì)了一種“蓮藕狀”的增強(qiáng)基底,通過(guò)將PS材質(zhì)的球體進(jìn)行刻蝕,得到適合病毒尺寸的微納結(jié)構(gòu),克服了傳統(tǒng)納米顆?！盁狳c(diǎn)”較小而無(wú)法包裹腺病毒的弊端。由于張曉蕾[27]設(shè)計(jì)的增強(qiáng)基底的中空結(jié)構(gòu)內(nèi)存在較多“熱點(diǎn)”,且病毒在隨機(jī)擴(kuò)散的過(guò)程中會(huì)優(yōu)先進(jìn)入微納結(jié)構(gòu),因此其SERS信號(hào)會(huì)明顯增強(qiáng)。利用張曉蕾[27]設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)陣列,作者成功捕獲了人5型腺病毒,相對(duì)于傳統(tǒng)的金膜基底在靈敏度上有了明顯提升。CHOI等[28]設(shè)計(jì)了一種聯(lián)合液滴沉積技術(shù)的SERS檢測(cè)平臺(tái)(DCD-SERS),利用該方法檢測(cè)對(duì)諸如淚液等生物流體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)分析。DCD-SERS技術(shù)具有高重復(fù)性、噪聲獨(dú)立性及均勻性等特點(diǎn),用來(lái)檢測(cè)生物流體中是否存在腺病毒時(shí),其拉曼位移核心區(qū)域內(nèi)(1 242～1 342波數(shù))的檢測(cè)靈敏度及特異度均為100%。配合主成分分析,在不需要其他標(biāo)簽或化學(xué)修飾的情況下即可實(shí)現(xiàn)高化學(xué)結(jié)構(gòu)檢測(cè)靈敏度,使SERS技術(shù)成為腺病毒早期診斷的理想選擇。

4 SERS在其他呼吸道病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

呼吸道合胞病毒具有較強(qiáng)的傳染性,是嬰幼兒急性呼吸道感染的主要原因,可引起細(xì)支氣管炎和肺炎等嚴(yán)重下呼吸道感染[29]。詹蕾[30]構(gòu)建了以酶反應(yīng)產(chǎn)物為報(bào)告分子的SERS免疫分析技術(shù),該技術(shù)以免疫學(xué)檢測(cè)原理為基礎(chǔ),構(gòu)建了病毒-抗體-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗的“三明治”免疫結(jié)構(gòu)。辣根過(guò)氧化物酶經(jīng)過(guò)氧化氫催化形成TMB+,通過(guò)靜電吸附作用吸附至帶有負(fù)電荷的Ag NPs表面,并產(chǎn)生強(qiáng)烈的SERS信號(hào)。相比傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法,SERS免疫分析技術(shù)對(duì)呼吸道合胞病毒檢測(cè)的靈敏度提高了50倍。ZHAN等[31]也利用了相似的原理對(duì)呼吸道合胞病毒進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)下限為0.05 pg/mL,相對(duì)于比色法的靈敏度提高了20倍。

針對(duì)多種呼吸道病毒的高通量檢測(cè),ZHANG等[32]開(kāi)發(fā)了一種基于SERS納米標(biāo)簽的側(cè)流微陣列技術(shù),該SERS納米標(biāo)簽標(biāo)記編碼包括副流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒在內(nèi)的11種常見(jiàn)呼吸道病毒的核酸序列,因?yàn)闃?biāo)簽的SERS信號(hào)放大效應(yīng)及硝化纖維素膜的高表面積體積比,所以能在一個(gè)側(cè)向流動(dòng)微陣列上實(shí)現(xiàn)對(duì)11種病原體的高通量快速定量,且具有廣泛的線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍[(1～5)×104pmol/L]和超高的靈敏度(最低可達(dá)0.03 pmol/L)。

5 小 結(jié)

隨著SERS技術(shù)的發(fā)展,目前將其應(yīng)用在檢測(cè)方面主要有3種思路:(1)將特異性的核酸序列、抗體附著在納米顆粒表面構(gòu)成SERS標(biāo)簽,使在復(fù)雜體液中準(zhǔn)確檢測(cè)呼吸道病毒成為可能;(2)利用新型增強(qiáng)基底制備技術(shù),使納米顆粒間“熱點(diǎn)”的尺寸更適合于病毒顆粒本身,在提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本的同時(shí),有效避免了唾液、血液等生物背景對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾;(3)與其他檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,例如SERS-色譜聯(lián)合應(yīng)用技術(shù),可以將SERS增強(qiáng)基底組裝到光纖上作為高靈敏的檢測(cè)傳感器。而SERS與等離子體傳感結(jié)合,可用于生物分子相互作用的高靈敏度的定量檢測(cè)。SERS技術(shù)克服了普通拉曼光譜信號(hào)較弱的缺點(diǎn),從而獲得普通拉曼光譜不易得到的結(jié)構(gòu)信息。基于其具有的高靈敏度、高特異度、非侵入性、高穩(wěn)定性及出色的高通量檢測(cè)能力等優(yōu)勢(shì),SERS技術(shù)在呼吸道病毒檢測(cè)方面有巨大的應(yīng)用潛力。

SERS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)決定了其迅速發(fā)展的必然性,但目前尚有一定的技術(shù)瓶頸有待突破:在病毒檢測(cè)方面,仍在探索如何實(shí)現(xiàn)病毒顆粒的高效捕捉,解決因納米顆?！盁狳c(diǎn)”與病毒間大小差異所致的檢測(cè)可靠性較差問(wèn)題。對(duì)于日益興起的無(wú)標(biāo)簽SERS檢測(cè),雖然消除了設(shè)計(jì)特異性標(biāo)簽的成本,且具有良好的普適性,但尚需要結(jié)合其他技術(shù),如深度學(xué)習(xí)、機(jī)器學(xué)習(xí)等以保證其特異性區(qū)分能力。此外,將增強(qiáng)基底材質(zhì)拓寬到金、銀以外的非貴金屬體系以降低成本及如何構(gòu)建增強(qiáng)效果更好的特殊結(jié)構(gòu)納米顆粒等研究還有待深入。

綜上所述,SERS技術(shù)在呼吸道病毒超快速、高靈敏度檢測(cè)應(yīng)用上具有巨大潛力,但仍然需要不斷將技術(shù)完善成熟。