胡海梅 江峰 陳開松 李泓利 賈雯

摘 要：冰箱是保存食品的常用設(shè)備，其低溫條件可有效延長食品的貯藏期，延緩食品的腐敗變質(zhì)，也在很大程度上保留了食品的營養(yǎng)物質(zhì)。但在低溫條件下仍有部分嗜冷、耐冷微生物可以存活甚至生長繁殖，是人們感染食源性疾病的可能來源。本文以雞胸肉為研究對象，經(jīng)過在冰箱中不同溫度條件下的短期貯藏，通過微生物多樣性檢測和微生物分離純化測序，分離鑒定出在低溫下仍可生存的微生物，其中包括可能的致病微生物，以期為肉類食品在冰箱貯藏過程中的食品安全問題研究提供參考。

關(guān)鍵詞：冰箱；低溫；雞胸肉；微生物；食源性疾病

Microbial Changes in Chicken Breast Stored in Refrigerator

HU Haimei1， JIANG Feng1， CHEN Kaisong1， LI Hongli2， JIA Wen2

（1.Changhong Meiling Co.， Ltd.， Hefei 230031， China; 2.School of Food Science and Nutrition Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： Refrigerator is a common equipment for preserving food， and its low temperature conditions can effectively extend the storage period of food， delay the deterioration of food， and also retain the nutrients of food to a large extent. However， under low temperature conditions， some cold-loving and cold-tolerant microorganisms can survive and even grow and reproduce， which is a possible source of food-borne diseases. This paper takes chicken breast as the research object. After short-term storage in the refrigerator at different temperatures， microorganisms that can survive at low temperatures， including possible pathogenic microorganisms， are isolated and identified through microbial diversity detection and microbial isolation and purification sequencing， in order to provide references for the study of food safety problems in the storage process of meat in the refrigerator.

Keywords： refrigerator; low temperature; chicken breast; microorganism; foodborne disease

溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一。但在低溫條件下，部分嗜冷、耐冷微生物仍能存活甚至生長繁殖，長時間貯藏也會導(dǎo)致食材品質(zhì)劣變，一些致病微生物可能會引發(fā)食源性疾病[1]。雞肉是最常見的肉類之一，是人們膳食結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂的重要來源[2]。為進(jìn)一步降低食材自身攜帶微生物給消費者帶來的潛在危害，并提高食材的貯藏期限，了解在冰箱不同貯藏環(huán)境中食材攜帶的微生物種類尤為重要。因此，本文選用雞胸肉進(jìn)行短期貯藏，通過微生物多樣性檢測分析在冰箱不同溫度條件下可存活的微生物種類以及優(yōu)勢菌種，以期為家用冰箱低溫保鮮技術(shù)、低溫殺菌技術(shù)等的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022年6月至2022年8月在北京市海淀區(qū)3個大型超市（5份/超市）購買共15份雞胸肉樣品，在超凈工作臺中，將每份雞胸肉品分成5份，分別放入5個無菌袋中，確保每個保鮮袋中的樣品質(zhì)量為25 g。將無菌保鮮袋封好后分別放置于常溫（25 ℃）、4 ℃、?3.5 ℃、?18 ℃和?32 ℃條件下貯藏24 h。

1.2 儀器與試劑

LB固體培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）瓊脂培養(yǎng)基，北京酷來搏科技有限公司；孟加拉紅（Rose Bengal Chloramphenicol Agar，RBC Agar）培養(yǎng)基，上海申啟生物科技有限公司；Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶，New England Biolabs公司；瓊脂糖，美國Amresco公司；DC301凝膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；T100? PCR儀，美國Bio-Rad公司；DYY-7C型電泳儀，北京市六一儀器廠；5424型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 微生物的培養(yǎng)

將雞胸肉樣品在常溫（25 ℃）、4 ℃、?3.5 ℃、?18 ℃和?32 ℃條件下貯藏24 h后取出，在超凈工作臺中待其解凍后用一次性無菌棉簽取樣棒蘸取樣品不同部位浸出液，將棉簽取樣棒浸入25 mL無菌水中，使取下的微生物溶于無菌水中，重復(fù)20次上述操作制成混合微生物樣品。將上述獲得的25 mL混合樣品加入盛有225 mL無菌水的錐形瓶中進(jìn)行10倍梯度稀釋，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。再取1 mL的1∶10樣品勻液注入含有9 mL無菌稀釋液的15 mL滅菌管中，反復(fù)吹吸混勻，制成1∶100的樣品勻液。重復(fù)上述操作程序至制備得到10-7梯度稀釋液。

制備LB固體培養(yǎng)基、麥芽汁固體培養(yǎng)基和孟加拉紅固體培養(yǎng)基，分別用于分離細(xì)菌、酵母菌和霉菌。選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，每個稀釋梯度分別吸取1 mL樣品至上述3種選擇性固體培養(yǎng)基表面，使用經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的涂布器將樣品均勻涂布至培養(yǎng)基表面，直至培養(yǎng)基表面干燥。同時分別取無菌水作為空白對照。細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，真菌（酵母和霉菌）于28 ℃培養(yǎng)48～72 h，培養(yǎng)過程中平板倒置。

1.3.2 微生物的分離純化

本研究僅針對?18 ℃貯藏條件下樣品中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行微生物的分離與純化操作。選擇適宜稀釋梯度的平板（平板上有盡可能多的單菌落，同時不出現(xiàn)菌苔）進(jìn)行分離操作，對該平板上每個單菌落采用平板劃線法進(jìn)行分離，并進(jìn)行編號。對第1次分離得到的菌落按照上述操作挑取單菌落進(jìn)行分離，直至完成微生物的純化。將純化后的菌株置于?80 ℃保藏，以備后續(xù)研究使用。

1.3.3 微生物的多樣性檢測和菌株鑒定

選擇1.3.1中適宜稀釋梯度的平板（菌落多且無菌苔），采用0.9%生理鹽水（提前滅菌）進(jìn)行平板洗脫，將洗脫的菌液收集于15 mL離心管中。對細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，引物為27F和1429R[3]；對真菌進(jìn)行ITS擴(kuò)增子測序（ITS-1和ITS-4）[4]。引物序列如表1所示，真菌擴(kuò)增片段為400～700 bp，細(xì)菌擴(kuò)增片段約1 400 bp。PCR程序設(shè)置為預(yù)變性（94 ℃）5 min，變性（94 ℃）0.5 min，退火（58 ℃）0.5 min，延伸（72 ℃）1.6 min，最終延伸（72 ℃）10 min，循環(huán)30次。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增片段，用凝膠回收試劑盒回收和純化目的片段。PCR產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測序。利用SnapGene軟件將DNA序列進(jìn)行拼接校對后，在美國國立生物技術(shù)信息中心進(jìn)行Blast檢索，根據(jù)比對結(jié)果獲得序列對應(yīng)的種屬信息。單個菌株的鑒定方法與此一致。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用DADA2[5]方法生成每個去重的序列應(yīng)用安全驗證標(biāo)準(zhǔn)（Amplicon Sequence Variants，ASVs），采用QIIME2的classify-sklearn算法[6-7]對每個ASV使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器進(jìn)行物種注釋。根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各樣品特征表，獲得物種豐度表。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰箱不同溫度貯藏環(huán)境中雞胸肉攜帶微生物的多樣性檢測

雞胸肉中共檢測到184個細(xì)菌菌屬。其中，在常溫（25 ℃）條件下共檢測到109個菌屬，4 ℃條件下共檢測到73個菌屬，-3.5 ℃條件下共檢測到94個菌屬，-18 ℃條件下共檢測到128個菌屬，-32 ℃條件下共檢測到82個菌屬。在各溫度條件下，巨球菌屬（Macrococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為主要的優(yōu)勢菌。在檢測到的細(xì)菌Top30中，可能的致病菌屬為8個。其中，共有常見致病菌屬4種，條件致病菌屬4種。假單胞菌屬（Pseudomonas）在-18 ℃條件下豐度較高，葡萄球菌屬（Staphylococcus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）在-32 ℃條件下豐度較高。

雞胸肉中共檢測到104個真菌菌屬。其中，在常溫（25 ℃）條件下共檢測到70個菌屬，4 ℃條件下共檢測到64個菌屬，-3.5 ℃條件下共檢測到50個菌屬，-18 ℃條件下共檢測到77個菌屬，-32 ℃條件下共檢測到62個菌屬。在各溫度條件下，皮膚皮狀新絲孢酵母屬（Cutaneotrichosporon）為主要的優(yōu)勢菌。在檢測到的所有真菌中，可能的致病菌數(shù)為2個，且均為常見致病菌。鐮刀菌屬（Fusarium）在-18 ℃條件下豐度較高。

2.2 雞胸肉中分離純化的微生物單個菌株的鑒定

將-18 ℃條件下短期貯藏雞胸肉中的微生物通過選擇性培養(yǎng)基分離、劃線純化等操作步驟，分離、純化得到細(xì)菌（37個）和真菌（50個）。對細(xì)菌的DNA 16S V4區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增測序，對真菌的ITS1區(qū)和18S V4區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增測序。細(xì)菌和真菌的多樣性分析結(jié)果均基于屬水平進(jìn)行分析與討論。測序結(jié)果顯示雞胸肉樣品中共分離出6株細(xì)菌、3株酵母菌和1株霉菌，如表2所示。

3 結(jié)論與討論

本研究以雞胸肉為研究對象，經(jīng)過在冰箱中不同溫度環(huán)境下的短期貯藏，通過微生物多樣性檢測和微生物分離純化測序，分離鑒定出大量在低溫條件下仍可生存的微生物，其中包括可能的致病微生物。目前的家用冰箱設(shè)備均以低溫手段抑制微生物的生長或?qū)δ承┎荒屠涞奈⑸锲鸬綒⒕饔肹8]，但研究表明簡單的低溫貯藏仍會使人們具有一定的感染微生物的風(fēng)險。因此，需對冰箱合理分區(qū)、定期清潔冰箱、及時關(guān)注食材保存狀態(tài)，從而預(yù)防食品受到微生物污染，保障人們的飲食安全。冰箱冷凍室貯藏的肉類食品含有各種耐冷微生物，可能導(dǎo)致冰箱冷凍室的污染，存在安全風(fēng)險。本研究在-18 ℃條件下純化的細(xì)菌和真菌可以作為開發(fā)冰箱冷凍殺菌方法的目標(biāo)菌，具有潛在的應(yīng)用價值。

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