王玉花 王瑞倩 修冬 石磊

摘 要：依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素C的測定》（GB 5413.18—2013），采用熒光法測定嬰幼兒食品和乳品中維生素C的含量。通過單因素實驗研究樣品的儲存條件、酸性活性炭的質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)溶液氧化液與硼酸的反應(yīng)程度、樣品氧化液與硼酸的反應(yīng)程度和熒光反應(yīng)時間等對維生素C測定結(jié)果的影響，進一步提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，滿足實驗室對質(zhì)量控制的要求。

關(guān)鍵詞：維生素C；熒光法；影響因素；硼酸

Analysis of Influencing Factors on the Determination of Vitamin C in Food and Dairy Products for Infants and Young Children

WANG Yuhua， WANG Ruiqian， XIU Dong， SHI Lei

（SGS-CSTC Standards Technical Services （Qingdao） Co.， Ltd.， Qingdao 266071， China）

Abstract： According to GB 5413.18—2013， fluorescence method is used to determine the content of vitamin C in food and dairy products for infants and young children. Through single factor experiments， the effects of sample storage conditions， quality of acidic activated carbon， reaction degree between standard solution oxidation solution and boric acid， reaction degree between sample oxidation solution and boric acid， fluorescence reaction time， and other factors on the determination of vitamin C were studied to improve the accuracy of analysis results and meet the laboratorys requirements for quality control.

Keywords： vitamin C; fluorimetric method; influencing factor; boric acid

維生素C，化學(xué)名稱為L-抗壞血酸，是一種無法由人體自身代謝產(chǎn)生，必須通過食物攝取的人體必需微量營養(yǎng)素，對于維持人體正常的新陳代謝至關(guān)重要[1-2]。維生素C分子中的烯二醇結(jié)構(gòu)使其具有強還原性，不僅具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、促進鐵吸收等功能，還能夠提高機體免疫力，預(yù)防乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等癌癥的發(fā)展[3-5]。因此，對于處在人體生長發(fā)育重要階段的嬰幼兒來說，攝入充足的維生素C十分重要。維生素C作為嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品、幼兒配方食品的必需成分，現(xiàn)行的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，允許添加量在2.4～16.7 mg·kJ-1。測定嬰幼兒食品和乳品中維生素C含量對食品營養(yǎng)價值分析具有重要意義。

目前，文獻報道的測定食品中維生素C含量的方法有高效液相色譜法[6-7]、熒光法[8]、2，6-二氯靛酚滴定法[9]、直接碘量法[10]、紫外-可見分光光度法[11-12]以及鉬藍比色法[13]等。熒光法是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素C的測定》

（GB 5413.18—2010）中規(guī)定的方法，具有靈敏度高、線性關(guān)系好、操作簡便的優(yōu)點。作為一種含有6個碳原子的酸性多羥基化合物，維生素C易溶于水，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱、氧、堿都會被破壞，在實際檢測過程中很容易受到影響。本文以GB 5413.18—2010為基礎(chǔ)，探討不同實驗條件對嬰幼兒食品和乳品中維生素C測定結(jié)果的影響，確定影響維生素C測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，為該法的實際應(yīng)用提供有益的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%），Sigma公司；乙酸、偏磷酸、硼酸、鄰苯二胺、活性炭，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；市售嬰幼兒配方食品。

1.2 儀器與設(shè)備

F97熒光分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；AL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；101-1-S數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 維生素C的檢測方法

參照GB 5413.18—2010。如圖1所示，熒光法測定維生素C含量的原理是維生素C與酸性活性炭發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成脫氫抗壞血酸，脫氫抗壞血酸與鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的喹唔啉，其熒光值與維生素C的濃度成正相關(guān)[14-15]。由于硼酸與脫氫抗壞血酸形成的絡(luò)合物不與鄰苯二胺發(fā)生反應(yīng)，空白試驗組可加入硼酸作為脫氫抗壞血酸的掩蔽劑，以此檢測試樣中各種雜質(zhì)的總熒光值，試樣溶液熒光值減去試樣空白溶液熒光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得對應(yīng)的維生素C質(zhì)量濃度。

1.3.2 探究儲存條件對嬰幼兒食品和乳品中維生素C測定結(jié)果的影響

（1）光照的影響。將嬰幼兒乳粉和液態(tài)奶分別在密封光照以及密封避光的條件下儲存，分別在儲存第1 d、3 d、5 d和7 d后，測定樣品中維生素C含量。

（2）儲存溫度的影響。將嬰幼兒乳粉分別在

25 ℃、50 ℃、75 ℃和100 ℃恒溫放置1 h、2 h、3 h后，測定樣品中維生素C含量。

1.3.3 探究酸性活性炭的質(zhì)量對嬰幼兒食品和乳品中維生素C測定結(jié)果的影響

稱取5.0 g混合均勻的嬰幼兒乳粉，用偏磷酸-乙酸溶液溶解，定容至100 mL。將相同條件下制備的100 mL樣液分別轉(zhuǎn)移到有1.6 g、1.8 g、2.0 g、2.2 g和2.4 g酸性活性炭的250 mL三角瓶中，劇烈振動后過濾，其余操作步驟和實驗條件同GB 5413.18—2010，測定樣品中維生素C含量。

1.3.4 探究“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值的影響因素

（1）硼酸-乙酸鈉溶液濃度對“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值的影響。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液氧化液5 mL于5個50 mL容量瓶中，分別加入硼酸濃度為10.0 g·L-1、20.0 g·L-1、30.0 g·L-1、40.0 g·L-1和50.0 g·L-1的硼酸-乙酸鈉溶液5 mL，其余操作步驟和實驗條件同GB 5413.18—2010，測定“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值。

（2）加入硼酸-乙酸鈉溶液后的靜置時間對“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值的影響。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液氧化液5 mL于5個50 mL容量瓶中，加入5 mL硼酸-乙酸鈉溶液，混合均勻后分別放置15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min，其余操作步驟和實驗條件同GB 5413.18—2010，測定“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液氧化液與硼酸-乙酸鈉溶液的反應(yīng)溫度對“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值的影響。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液氧化液5 mL于5個50 mL容量瓶中，加入5 mL硼酸-乙酸鈉溶液，混合均勻后在4 ℃和25 ℃分別放置10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，其余操作步驟和實驗條件同GB 5413.18—2010，測定“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值。

1.3.5 探究“待測樣液空白溶液”的影響因素

“待測樣液空白溶液”熒光值影響因素檢測方式同1.3.4。

1.3.6 熒光反應(yīng)時間對嬰幼兒食品中維生素C測定結(jié)果的影響

按照GB 5413.18—2010處理樣品，得到待測樣液，各取2 mL于5支10 mL具塞比色管中，加入5 mL鄰苯二胺溶液后放置在避光環(huán)境中分別反應(yīng)15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min和180 min，其余操作步驟和實驗條件同GB 5413.18—2010，測定樣品的維生素C含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲存條件對嬰幼兒食品和乳品中維生素C含量的影響

由表1中避光和曝光條件下嬰幼兒乳粉和液態(tài)奶中維生素C含量的變化情況可知，光照能夠使樣品中的維生素C發(fā)生分解，光照時間越長，樣品中維生素C損失越多。相比于嬰幼兒乳粉類的固體樣品，曝光條件下液態(tài)奶中維生素C含量的下降尤為明顯，曝光條件下第7天液態(tài)奶中的維生素C含量僅為第1天的17.8%，這與維生素C的性質(zhì)有關(guān)，維生素C易溶于水，在水溶液中會更快分解。

由表2可知同一奶粉樣品中維生素C含量與溫度的關(guān)系。25 ℃放置3 h 后，奶粉中的維生素C含量沒有明顯變化；100 ℃放置1 h后，奶粉中的維生素C含量就下降到原來的82.5%；100 ℃放置3 h后，含量僅為初始含量的44.0%。在高溫條件下，維生素C在短時間內(nèi)損失嚴(yán)重。由此可知，嬰幼兒食品和乳品應(yīng)該避光保存在陰涼處，避免陽光直射和高溫造成維生素C的流失。

2.2 酸性活性炭的質(zhì)量對嬰幼兒食品和乳品中維生素C測定結(jié)果的影響

酸性活性炭是氧化劑，能與維生素C發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成脫氫抗壞血酸。當(dāng)酸性活性炭用量不足時，樣品中的維生素C無法完全轉(zhuǎn)化為脫氫抗壞血酸，會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。因此，實驗過程中要保證酸性活性炭與維生素C反應(yīng)充分。如表3所示，當(dāng)活性炭質(zhì)量為1.6～2.4 g時，檢測到的維生素C含量沒有明顯區(qū)別，說明在這個范圍內(nèi)試樣中的維生素C能夠完全被氧化為脫氫抗壞血酸。

2.3 “標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值對維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響

“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值的大小與維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線密切相關(guān)。當(dāng)硼酸與脫氫抗壞血酸反應(yīng)不充分時，“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值偏高，會導(dǎo)致維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線上的點對應(yīng)的熒光值降低，從而對整條標(biāo)準(zhǔn)曲線造成影響。為了保證硼酸與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的脫氫抗壞血酸反應(yīng)充分，設(shè)置單因素實驗探究硼酸-乙酸鈉溶液濃度、加入硼酸-乙酸鈉溶液后的靜置時間和反應(yīng)溫度對“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值的影響。

由表4可知，在其他條件不變的情況下，硼酸-乙酸鈉溶液中硼酸濃度越高，硼酸與脫氫抗壞血酸反應(yīng)越充分，“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值越低。當(dāng)硼酸-乙酸鈉溶液的濃度小于GB 5413.18—2010規(guī)定的30.0 g·L-1時，“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值偏高。由表5可知，加入硼酸-乙酸鈉溶液后，靜置時間越長，硼酸與脫氫抗壞血酸反應(yīng)越充分，“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值越低。當(dāng)靜置時間不足30 min時，“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值明顯偏高。因此，為了保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在硼酸-乙酸鈉溶液與脫氫抗壞血酸混合均勻后，一定要確保足夠的靜置時間，使其充分反應(yīng)。

由表6可知，溫度會影響硼酸與脫氫抗壞血酸的反應(yīng)，較低的溫度下“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值偏高，因此應(yīng)保證反應(yīng)在25 ℃的條件下進行。

分別繪制“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值為25和70對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2?！皹?biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值為25和70對應(yīng)的線性回歸方程分別為Y1=113.440 4X＋2.85（R2=0.999 9）和Y2=110.640 4X-17.15（R2=0.999 0）。3種不同品牌的奶粉在2條標(biāo)準(zhǔn)曲線下的維生素C含量見表7。由表7可知，當(dāng)“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值偏高時，樣品中的維生素C測定結(jié)果也會偏高。

2.4 “待測樣液空白溶液”熒光值對嬰幼兒食品中維生素C測定結(jié)果的影響

由表8可知，硼酸-乙酸鈉溶液中硼酸濃度越高，“試樣待測液空白溶液”熒光值越低。由表9可知，加入硼酸-乙酸鈉溶液后的靜置時間越長，“試樣待測液空白溶液”熒光值越低。由表10可知，較低的溫度下“試樣待測液空白溶液”熒光值偏高，在樣品溶液與硼酸-乙酸鈉溶液反應(yīng)時，要保持在合適的溫度。

2.5 熒光反應(yīng)時間對嬰幼兒食品中維生素C測定結(jié)果的影響

由圖3中熒光反應(yīng)時間對維生素C測定結(jié)果的影響可知，在熒光反應(yīng)時間為15～40 min時，試樣的熒光值總體上呈現(xiàn)上升趨勢。在熒光反應(yīng)時間為40～180 min時，試樣的熒光值基本穩(wěn)定，沒有明顯的變化，部分樣品開始呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。

3 結(jié)論

嬰幼兒奶粉應(yīng)密封儲存在避光、陰涼的常溫環(huán)境中。采用熒光法測定樣品中的維生素C含量的過程中，硼酸和脫氫抗壞血酸復(fù)合反應(yīng)的條件、熒光反應(yīng)時間是影響樣品中維生素C檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素。硼酸和標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液中的脫氫抗壞血酸反應(yīng)不充分會導(dǎo)致“標(biāo)準(zhǔn)溶液空白溶液”熒光值偏高，從而影響標(biāo)準(zhǔn)曲線，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高；硼酸和“試樣待測液空白溶液”中的脫氫抗壞血酸反應(yīng)不充分會導(dǎo)致“試樣待測液空白溶液”熒光值偏高，從而影響標(biāo)準(zhǔn)曲線，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高。為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，加入硼酸-乙酸鈉溶液后，標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣液與硼酸-乙酸鈉溶液需充分振蕩混合均勻，并在25 ℃下放置30 min。在待測樣液中加入鄰苯二胺后的60～90 min，試樣的熒光值基本保持穩(wěn)定，應(yīng)在此時間段內(nèi)盡快進行熒光檢測。

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