劉任 辛美果

摘 要：本文建立了基于表面增強拉曼光譜技術(shù)快速檢測西瓜中的噁霉靈農(nóng)藥殘留的方法。結(jié)果表明，密度泛函計算與固體標準品對比得出噁霉靈在600 cm-1、924 cm-1、1 258 cm-1、1 489 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1和3 155 cm-1處有明顯的特征峰。當硝酸銀與鹽酸羥胺按照5∶1體積比配制銀溶膠時，且在保持10 ?L噁霉靈農(nóng)藥體積不變的情況下，加入7.5 ?L的銀溶膠，噁霉靈的拉曼特征峰強度最大，表面增強效果最好。在實際食品基質(zhì)西瓜中，噁霉靈的最低檢出濃度為10-4 mol·L-1。該方法檢測限低，靈敏度高，無需復(fù)雜的前處理，可實現(xiàn)西瓜中噁霉靈的快速檢測。

關(guān)鍵詞：密度泛函理論；表面增強拉曼光譜；噁霉靈

Rapid Detection of Hymexazol in Watermelon Based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy

LIU Ren， XIN Meiguo*

（Foshan University， Foshan 528000， China）

Abstract： In this paper， a method for rapid detection of hymexazol pesticide residues in watermelon was developed based on surface-enhanced Raman spectroscopy. The results showed that the density functional calculation compared with the solid standard product showed that hymexazol had obvious characteristic peaks at 600 cm-1，

924 cm-1， 1 258 cm-1， 1 489 cm-1， 1 623 cm-1， 2 937 cm-1 and 3 155 cm-1. When silver nitrate and hydroxylamine hydrochloride were prepared according to the volume ratio of 5∶1， the Raman characteristic peak strength of hymexazol ?was the highest and the surface enhancement effect was the best when the volume of hymexazol ?pesticide was kept unchanged at 10 ?L and 7.5 ?L silver sol was added. In the actual food substrate watermelon， the lowest detectable concentration of hymexazol ?was 10-4 mol·L-1. This method has low detection limit， high sensitivity and no need for complex pretreatment， and can achieve rapid detection of hymexazol ?in watermelon.

Keywords： density functional theory; surface-enhanced raman spectroscopy; hymexazol

農(nóng)藥是用來控制害蟲、抑制真菌、消滅雜草的具備多種物理或化學(xué)特性的有機化合物[1]。我國是一個農(nóng)業(yè)大國[2]，殺菌劑類農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用極其廣泛[3]。但是，過多地使用殺菌劑類農(nóng)藥，很容易在農(nóng)作物中形成農(nóng)藥殘留，食用含農(nóng)藥殘留的農(nóng)作物可能會引發(fā)人體的慢、急性中毒。因此，有必要對食品中的農(nóng)藥殘留進行檢測。噁霉靈的化學(xué)名稱是3-羥基-5-甲基異噁唑，CAS號是10004-44-1[4]，屬噁唑類殺菌劑[5]，是日本三共株式會社研發(fā)的一種效果極佳的內(nèi)吸性廣譜殺菌劑[6-7]。噁霉靈可被用于真菌引起的各種疾病的治療。目前文獻中關(guān)于噁霉靈殘留檢測的常規(guī)方法主要是液相、氣相、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，常規(guī)方法具有預(yù)處理時間長、需要專業(yè)檢測人員檢測、不能滿足食品監(jiān)管部門的現(xiàn)場快速檢測的缺點[4]。因此，有必要研究噁霉靈的快速現(xiàn)場檢測方法。

密度泛函理論（Density Functional Theory，DFT）不僅能夠直觀地描述分子振動情況，而且能夠極大地減少計算量，被廣泛應(yīng)用于分子的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、反應(yīng)機理、振動光譜等方面的研究[8]。借助密度泛函理論，可以預(yù)測噁霉靈的理論拉曼光譜。表面增強拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是基于表面增強拉曼散射現(xiàn)象發(fā)展而來的技術(shù)。SERS技術(shù)反映的是單個分子的振動信息。因此，即使是極低濃度的樣品，也能通過具有超高靈敏度的SERS技術(shù)檢測出來[9]。而SERS技術(shù)作為一種高效的光譜檢測方法，已經(jīng)在農(nóng)產(chǎn)品檢測、食品安全檢測、醫(yī)藥及生物安全等多個領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了廣泛應(yīng)用。

本文基于表面增強拉曼光譜技術(shù)，借助密度泛函理論預(yù)測噁霉靈的理論拉曼光譜，首次獲得了噁霉靈的表面增強拉曼光譜，同時優(yōu)化了表面增強拉曼光譜的檢測條件，實現(xiàn)了在實際食品基質(zhì)西瓜中，通過將噁霉靈加標到西瓜基質(zhì)中檢測噁霉靈的表面增強拉曼光譜，該方法的最低檢出濃度低，為食品監(jiān)管部門快速現(xiàn)場檢測噁霉靈提供了有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

西瓜，學(xué)校超市。

乙腈（分析純）、硝酸銀標準溶液（分析純）、鹽酸羥胺（分析純）、噁霉靈（純度99.8%），廣州春暢生物技術(shù)開發(fā)有限公司；實驗用水為超純水。

LabRAM HR Evolution顯微共焦拉曼光譜儀，HORIBA Scientific公司；BSA2202s電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MINI-10K迷你離心機，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 密度泛函理論計算

在Gaussian View 6.0軟件中繪制噁霉靈農(nóng)藥分子的幾何結(jié)構(gòu)圖，在Gaussian 16W中基于密度泛函理論，設(shè)置參數(shù)為b3lyp/6-31g（d，p），計算獲得噁霉靈分子的幾何優(yōu)化結(jié)構(gòu)圖和理論拉曼光譜圖。

1.2.2 噁霉靈固體標準品的拉曼光譜的檢測

取噁霉靈固體標準品適量于干凈的載玻片上，平鋪置于顯微共焦拉曼光譜儀的載物臺上，進行檢測得到拉曼光譜圖。

1.2.3 表面增強拉曼檢測條件的優(yōu)化

準確稱量噁霉靈標準品0.019 8 g溶解于1 mL乙腈中，得到10-1 mol·L-1的標準品溶液，然后依次稀釋得到10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1、10-4 mol·L-1、10-5 mol·L-1和10-6 mol·L-1系列濃度梯度的標準品溶液。

（1）探究噁霉靈的特征峰峰強與按照不同體積比配制銀溶膠的關(guān)系。利用鹽酸羥胺還原法制備納米銀增強基底[10]，將硝酸銀與鹽酸羥胺分別按照1∶1、3∶1、5∶1、7∶1和9∶1比例配制1 000 ?L體系的銀溶膠增強基底，取配制好的7.5 ?L銀溶膠與10 ?L 10-2 mol·L-1的噁霉靈溶液，混合均勻，取

10 ?L上述混合均勻的銀溶膠與噁霉靈溶液滴加在干凈的載玻片上檢測拉曼光譜。

（2）探究噁霉靈的特征峰峰強與銀溶膠加入量的關(guān)系。選擇上述對噁霉靈增強效果最好的體積比銀溶膠，分別將2.5 ?L、5.0 ?L、7.5 ?L、10.0 ?L和

12.5 ?L的銀溶膠加入10 ?L 10-2 mol·L-1的噁霉靈標準溶液中，混合均勻，取10 ?L上述混合均勻的銀溶膠與噁霉靈溶液滴加在干凈的載玻片上檢測拉曼光譜。

1.2.4 表面增強拉曼光譜的檢測

將學(xué)校超市的西瓜切塊、榨汁、過濾和離心后取上清液，將配制好的系列濃度梯度噁霉靈標準溶液各取10 ?L分別加標到10 ?L的上清液中作為待檢測溶液，將硝酸銀和鹽酸羥胺按照優(yōu)化后的體積比配制成銀溶膠，取優(yōu)化后的銀溶膠的加入量加入待檢測溶液中混合均勻，立即對噁霉靈進行表面增強拉曼光譜檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 噁霉靈分子的幾何優(yōu)化結(jié)構(gòu)和特征峰峰位歸屬

2.1.1 經(jīng)過DFT優(yōu)化后的噁霉靈分子結(jié)構(gòu)圖

根據(jù)密度泛函理論計算獲得優(yōu)化后的噁霉靈分子結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

2.1.2 噁霉靈密度泛函理論計算的拉曼光譜和固體標準品的實驗拉曼光譜

圖2為噁霉靈密度泛函理論計算拉曼光譜圖和固體標準品的拉曼光譜圖，從圖中可以明顯看出噁霉靈的拉曼特征峰有600 cm-1、924 cm-1、1 258 cm-1、1 490 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1和3 156 cm-1。

取上述7個特征峰的密度泛函理論計算的拉曼位移與固體標準品實驗拉曼光譜的拉曼位移，分析這7個特征峰拉曼位移的吻合程度。由圖3可知，實驗拉曼光譜位移與密度泛函理論計算的拉曼光譜位移線性擬合的R2達到了0.999 36，R2數(shù)值越接近1，表示實驗與理論計算的拉曼位移吻合程度越高，說明密度泛函理論計算得到的理論拉曼光譜與固體拉曼光譜位移非常接近，密度泛函理論預(yù)測的理論拉曼光譜的準確性高，可作為較好的理論依據(jù)，后續(xù)將進一步對噁霉靈固體標準品峰位的拉曼位移偏移進行分析。

2.1.3 噁霉靈的峰位歸屬

根據(jù)密度泛函理論計算的拉曼光譜圖和優(yōu)化后的分子結(jié)構(gòu)圖，可以指認出噁霉靈的拉曼光譜峰位歸屬（表1），其中位于474 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的C-C面內(nèi)彎曲振動和O-H彎曲振動。位于600 cm-1處的拉曼位移是C-C的伸縮振動和苯環(huán)上的C-C彎曲振動。位于924 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的N-O伸縮振動和CH3上的C-H彎曲振動。位于997 cm-1處的拉曼位移是N-O伸縮振動和CH3上的C-H彎曲振動。位于1 031 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的N-O伸縮振動和苯環(huán)上的C-C伸縮振動。位于1 146 cm-1處的拉曼位移是C-H面內(nèi)彎曲振動和C-C伸縮振動。位于1 258 cm-1處的拉曼位移是O-H彎曲振動和苯環(huán)上的C-N伸縮振動。位于1 351 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H彎曲振動。位于1 442 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H面內(nèi)彎曲振動。位于1 490 cm-1處的拉曼位移是O-H面內(nèi)彎曲振動和苯環(huán)上的C-C伸縮振動和苯環(huán)上的C-N伸縮振動。位于1 623 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的C-C伸縮振動和苯環(huán)上的C-N伸縮振動。位于2 937 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H的對稱伸縮振動。位于2 982 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H非對稱性伸縮。位于3 156 cm-1處的拉曼位移是C-H的伸縮振動。從理論光譜與實驗光譜之間的位移對比，可以看到實驗光譜和理論光譜之間的偏移量和偏移率都較小，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。

2.2 表面增強拉曼光譜檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 銀溶膠體積的優(yōu)化

加入硝酸銀和鹽酸羥胺按照不同體積比配制銀溶膠增強基底后，噁霉靈的表面增強拉曼光譜見圖4。噁霉靈的表面增強拉曼光譜與固體拉曼光譜特征峰略有偏移。例如，600 cm-1處固體特征峰藍移到607 cm-1處，1 623 cm-1、2 937 cm-1處固體特征峰紅移到1 611 cm-1、2 928 cm-1。

選取特征峰最高的2個特征峰607 cm-1、

2 928 cm-1，探究特征峰峰強與不同體積比配制的銀溶膠關(guān)系。由圖5可知，隨著硝酸銀與鹽酸羥胺體積比的增大，兩個特征峰（607 cm-1、2 928 cm-1）的峰強在5∶1的體積比時峰強最大，因此按照5∶1體積比配制銀溶膠，對噁霉靈的表面增強效果最好。后續(xù)實驗將一直保持此體積比配制銀溶膠。

2.2.2 銀溶膠加入量的優(yōu)化

圖6是保持噁霉靈農(nóng)藥10 ?L不變，銀溶膠加入量的不同對噁霉靈的表面增強效果也不同。

選取峰強最大的兩個特征峰（600 cm-1、2 924 cm-1），探究特征峰峰強與銀溶膠不同加入量的關(guān)系。由圖7可知，銀溶膠加入量由2.5 ?L增加到12.5 ?L的過程中，特征峰峰強先增加后減小，在7.5 ?L時特征峰峰強最大，因此加入7.5 ?L的銀溶膠增強基底，在保持10 μL噁霉靈農(nóng)藥體積不變的情況下，噁霉靈的表面增強效果最好。

2.3 表面增強拉曼光譜的檢測

圖8是保持上述最優(yōu)條件，檢測不同濃度的噁霉靈標準溶液的表面增強拉曼光譜圖。由圖8可知，在噁霉靈標準溶液濃度為10-1 mol·L-1、

10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1濃度時，噁霉靈的各個特征峰較為清晰可見，在10-4 mol·L-1時，604 cm-1、1 628 cm-1、2 941 cm-1處有微弱的特征峰，直到10-5 mol·L-1時，只剩下1 035 cm-1處的特征峰，由于至少需要兩個特征峰才能判斷這個物質(zhì)，因此噁霉靈的表面增強拉曼光譜的檢測限是10-4 mol·L-1。

圖9為在實際食品基質(zhì)西瓜中通過加標噁霉靈，檢測噁霉靈的表面增強拉曼光譜圖，在西瓜上清液中添加噁霉靈的濃度為10-1 mol·L-1、10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1和10-4 mol·L-1時，604 cm-1、1 628 cm-1、2 941 cm-1處的特征峰清晰可見。比固體拉曼特征峰600 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1向右發(fā)生極少的藍移，可能是西瓜中的成分略微影響了噁霉靈分子振動，而加標濃度為10-5 mol·L-1時已經(jīng)無法分辨出完整的特征峰峰形，由此得出噁霉靈加標到西瓜中的檢測限為10-4 mol·L-1。

3 結(jié)論

食品中的農(nóng)藥殘留問題一直是影響蔬菜水果食品安全的重要因素，噁霉靈農(nóng)藥是一種廣泛應(yīng)用在瓜果中的殺菌劑，目前關(guān)于噁霉靈農(nóng)藥殘留的檢測方法主要是液相色譜、氣相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，本文首次使用基于表面增強拉曼光譜計算，通過密度泛函理論計算與固體標準品對比，得到噁霉靈分子的拉曼特征峰和峰位歸屬，優(yōu)化表面增強拉曼光譜檢測條件，獲得不同濃度梯度噁霉靈標準溶液的表面增強拉曼光譜，在實際食品基質(zhì)西瓜中加標噁霉靈，得到檢測限為10-4 mol·L-1，該方法檢測限低，無需復(fù)雜的前處理，可應(yīng)用于現(xiàn)場的快速檢測，為監(jiān)管部門提供有效依據(jù)。

參考文獻

[1]SOLIMAN M，KHORSHID M，EL-MARSAFY A M，

et al.Determination of 10 pesticides， newly registered in egypt， using modified QuEChERS method in combination with gas and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometric detection[J].Int J Environ Anal Chem，2019，99（3）：224-242.

[2]LIU Y，ZHANG J，SHENG X R，et al.Adsorption and release kinetics， equilibrium， and thermodynamic studies of hymexazol onto diatomite[J].ACS Omega，2020，5（45）：29504-29512.

[3]HAMED S M，HASSAN S H，SELIM S，et al.Differential responses of two cyanobacterial species to R-metalaxyl toxicity： growth， photosynthesis and antioxidant analyses[J].Environmental Pollution， 2020，258：113681.

[4]堵宇，陳福良，張奇珍，等.噁霉靈微球劑高效液相色譜分析方法研究[J].世界農(nóng)藥，2022，44（9）：32-36.

[5]宋強勇，晏姣，曾利紅，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水稻中稻瘟靈和噁霉靈殘留量[J].精細化工中間體，2022，52（3）：77-81.

[6]HASSANEN E I，HUSSIEN A M，HASSAN N H，et al.A comprehensive study on the mechanistic way of hexaflumuron and hymexazol induced neurobehavioral toxicity in rats[J].Neurochem Res，2022，47（10）：3051-3062.

[7]YU Z Q，F(xiàn)AN H C，CAO C H，et al.Development of a continuous flow process for the synthesis of mesotrione[J].Journal of Flow Chemistry，2022，12（2）：1-9.

[8]梁小蕊，叢靜嫻，李蔭，等.基于密度泛函理論的氯氰菊酯振動光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2023，43（5）：1381-1386.

[9]NENG J，ZHANG Q，SUN P L.Application of surface-enhanced raman spectroscopy in fast detection of toxic and harmful substances in food[J].Biosensors and Bioelectronics，2020，167：112480.

[10]翟晨，徐田鋒，彭彥昆，等.基于銀溶膠表面增強拉曼光譜對菠菜毒死蜱農(nóng)藥的快速檢測[J].光譜學(xué)與光譜分析，2016，36（9）：2835-2840.