陳江龍，吳麗麗，周麗紅，李莎

遵義醫(yī)科大學(xué)（珠海校區(qū)）生物工程學(xué)院（珠海 519041）

橘子，又稱為“桔子”，為常綠喬木、朱橘等各種橘類成熟后的果實(shí)，色澤鮮亮，酸甜可口，是日常生活中最受人們歡迎的水果之一，其肉、皮、絡(luò)、核、葉等都能入藥。橘皮在中藥中又被稱為陳皮，研究表明橘皮中含有多種天然功能成分，如橘皮多糖、橘皮精油、橘皮果膠、橘皮色素、橘皮多酚、橘皮黃酮等[1]，使其具有祛痰止咳、消食開胃、降血壓、抗氧化、抑菌等功效[2-3]，被認(rèn)為在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

多酚是一種具有多元酚結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量在500～3 000之間的次生代謝物，具有重要的生理意義和形態(tài)意義，在植物成長中起保護(hù)作用，并可影響植物顏色和感官特征。此外，研究報(bào)道植物多酚具有抗癌、抗血栓、抗氧化、抗微生物、心臟保護(hù)和防治血管舒張等多種生理特性[4-10]。其中，抗氧化活性是植物多酚利用最廣的藥理作用之一，攜帶酚羥基的天然多酚類化合物具備良好的抗氧化性，故其對自由基（如活性氧）有較強(qiáng)的清除能力[11]。我國橘子產(chǎn)量很大，但是絕大部分橘皮被直接丟棄，不僅浪費(fèi)資源，且會造成環(huán)境污染。試驗(yàn)以橘皮為原料，95%乙醇為提取劑，提取橘皮中總多酚物質(zhì)，并研究橘皮總多酚分別對2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-硝酸）二銨鹽自由基（ABTS+·）、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羥自由基（·OH）和2-苯基-4, 4, 5, 5-四甲基咪唑啉-3-氧代-1-氧自由基（PTIO·）的清除作用，以評價(jià)其抗氧化活性。試驗(yàn)旨在為橘皮的高值化利用提供理論基礎(chǔ)，并為橘皮的附加價(jià)值和利用前景提供參考[12]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

柑橘[市售，產(chǎn)于粵東，橘皮洗凈去掉白色橘絡(luò)自然曬干，粉碎過0.250 mm孔徑（60目）篩備用]；沒食子酸（HPLC≥98%）、無水碳酸鈉、維生素C、無水碳酸鈉、福林酚、碳酸亞鐵、過硫酸鉀、水楊酸、DPPH等（上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇（麥克林生化科技有限公司）；ABTS（上海阿拉丁生化有限公司）。所用試劑均為分析純或分析純以上級別。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)（SB-5200DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司）；離心機(jī)（TG16-WS，湖南湘儀離心機(jī)有限公司）；萬分之一電子天平（BSA 224S，德國賽多利斯公司）；酶標(biāo)儀（MULTISKAN GO，美國ThermoFisher公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 橘皮總多酚的提取

將橘皮洗凈，去白色橘絡(luò)后自然曬干，用九陽榨汁機(jī)打碎過0.250 mm孔徑（60目）篩。稱取20 g粉碎橘皮加入裝有95%乙醇的錐形瓶內(nèi)（200 mL），振蕩搖勻，超聲（60 ℃，300 W）浸提60 min直到乙醇變亮黃色。浸提結(jié)束后，離心（4 000 r/min，10 min），取亮黃色上清液作為待測物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)95%乙醇溶液，得到1.050 g暗黃色液態(tài)浸膏。取提取物浸膏，用95%乙醇稀釋成不同濃度，并用于后續(xù)測其抗氧化活性。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考李梅梅等[13]的方法進(jìn)行部分修改，使用福林酚法測量橘皮總多酚含量。將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品精密稱取5 mg，放入蒸餾水中混合均勻后定容，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，將質(zhì)量濃度依次稀釋為40，60，80，100和120 μg/mL，備用。移取200 μL不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與100 μL福林酚（10%，V/V）混合均勻，和100 μL 7.5% Na2CO3混合反應(yīng)，置于暗處室溫下顯色30 min。顯色后，通過酶標(biāo)儀檢測樣品在波長765 nm處吸光度，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 總多酚濃度測定

將1.3.1中配制的橘皮總多酚乙醇溶液，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，在波長765 nm處測定提取液樣品吸光度，并計(jì)算提取液中橘皮總多酚質(zhì)量濃度，將得到數(shù)據(jù)代入式（1）計(jì)算橘皮總多酚提取率（X，%）。

式中：C為提取液質(zhì)量濃度，μg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積，mL；m為曬干橘皮粉末的質(zhì)量，mg。

1.3.4 橘皮總多酚抗氧化活性測定

1.3.4.1 ABTS自由基清除活性測定

參考Li等[14]的方法進(jìn)行部分修改。將二銨鹽ABTS精密稱取3 mg，與0.735 mL蒸餾水混合反應(yīng)，配制7.4 mmol/L的ABTS二銨鹽溶液，備用。精密稱取5 mg K2S2O8，與1.43 mL蒸餾水混合溶解，配制13 mmol/L的K2S2O8溶液，備用。用移液管移取等體積的ABTS二銨鹽儲備液和K2S2O8儲備液，在暗處室溫下反應(yīng)1 h，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）將混合液稀釋，使其在波長734 nm處吸光度約0.7，得到ABTS自由基溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。精密移取800 μL ABTS自由基工作液，分別與200 μL不同質(zhì)量濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮總多酚-乙醇溶液混合，室溫暗處作用30 min。維生素C處理組設(shè)置為陽性對照組，95%乙醇處理組設(shè)置為樣品對照組，去離子水處理組設(shè)置為空白對照組，通過酶標(biāo)儀檢測樣品在波長734 nm處吸光度。ABTS自由基清除率（%）按式（2）計(jì)算。

式中：AABTS為不加樣品扣空白對照后的吸光度；A樣品為加樣品扣空白對照后的吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除活性測定

參照薛海平等[15]方法，略有修改。稱取DPPH固體于15 mL離心管中，加入95%乙醇溶解，配制0.1 mg/mL的DPPH溶液。移取800 μL配制好的溶液，分別與200 μL不同質(zhì)量濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮總多酚-乙醇溶液混合，室溫暗處下作用30 min。維生素C處理組設(shè)置為陽性對照組，95%乙醇處理組設(shè)置為樣品對照組，去離子水處理組設(shè)置為空白對照組，通過酶標(biāo)儀檢測樣品在波長519 nm處吸光度。DPPH自由基清除率（%）按式（3）計(jì)算。

式中：ADPPH為不加樣品扣空白對照后的吸光度；A樣品為加樣品扣空白對照后的吸光度。

1.3.4.3 OH自由基清除活性測定

參照高子怡等[16]方法，略有修改。移取200 μL不同質(zhì)量濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮總多酚-乙醇溶液，分別加入160 μL FeSO4（3.2 mmol/L）和160 μL H2O2（18.2 mmol/L）溶液均勻混合，置于室溫暗處下反應(yīng)10 min。加入480 μL水楊酸-乙醇溶液（3.6 mmol/L）混合搖勻，置于暗處室溫下反應(yīng)30 min。維生素C處理組設(shè)置為陽性對照組，95%乙醇處理組設(shè)置為樣品對照組，去離子水處理組設(shè)置為空白對照組，通過酶標(biāo)儀檢測樣品在波長510 nm處吸光度。OH自由基清除率（%）按式（4）計(jì)算。

式中：AOH為不加樣品扣空白對照后的吸光度；A樣品為加樣品扣空白對照后的吸光度。

1.3.4.4 PTIO自由基清除活性測定

稱取5 mg的PTIO固體加入20 mL 95%乙醇中充分混合溶解，配制PTIO測試液。移取800 μL配制好的PTIO溶液，分別與200 μL不同質(zhì)量濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮總多酚-乙醇溶液混合搖勻，置于暗處室溫下作用30 min。維生素C處理組設(shè)置為陽性對照組，95%乙醇處理組設(shè)置為樣品對照組，去離子水處理組設(shè)置為空白對照組，通過酶標(biāo)儀檢測樣品在波長557 nm處吸光度。PTIO自由基清除率（%）按式（5）計(jì)算。

式中：APTIO為不加樣品扣空白對照后的吸光度；A樣品為加樣品扣空白對照后的吸光度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

測量數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的Mean±SD。使用GraphPrism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

橫坐標(biāo)x為沒食子酸質(zhì)量濃度C（mg/mL），縱坐標(biāo)y為765 nm處吸光度A，經(jīng)過分析計(jì)算可得出線性回歸方程y=0.013 3x-0.102 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 2，說明標(biāo)準(zhǔn)樣品在測定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 總多酚含量的測定

利用式（1）及2.1中得到的線性回歸方程，計(jì)算得到橘皮總多酚提取率，結(jié)果為1.77%。

2.3 抗氧化活性的評價(jià)

2.3.1 ABTS+自由基清除率測定

經(jīng)活性氧化的ABTS會產(chǎn)生穩(wěn)定的ABTS+自由基，當(dāng)被清除劑作用時，清除劑會與ABTS+自由基產(chǎn)生反應(yīng)而得到淺色溶液。由圖2可知，隨著橘皮總多酚質(zhì)量濃度逐漸增加，ABTS+自由基清除率也逐漸上升。橘皮總多酚質(zhì)量濃度在10～100 μg/mL時，其對ABTS+自由基的清除率為8.74%～90.00%。維生素C質(zhì)量濃度在10～30 μg/mL時，ABTS+自由基清除率從68.41%上升至99.93%。質(zhì)量濃度30～100 μg/mL時，清除率達(dá)100%。由此可見，橘皮總多酚對ABTS+自由基具有較強(qiáng)的清除能力，但弱于維生素C。

圖2 ABTS+自由基清除率

2.3.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH是一種在波長519 nm處有較強(qiáng)吸光度的紫色溶液，被自由基清除劑充分作用時，將變成無色物質(zhì)[17-18]。由圖3可知，橘皮總多酚質(zhì)量濃度從20 μg/mL上升至100 μg/mL時清除率逐漸上升，最大可達(dá)86.88%，而維生素C質(zhì)量濃度為10～20 μg/mL時，清除率由66.27%迅速增長到96.25%。由此可見，橘皮總多酚提取物對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，但仍比同等濃度下維生素C能力弱。

圖3 DPPH自由基清除率

2.3.3 OH自由基清除率測定

OH自由基具有短壽命而高反應(yīng)活性的特性，其與水楊酸反應(yīng)可生成紫色化合物，在波長510 nm處此化合物可達(dá)到吸收峰，根據(jù)測量可知吸光度與羥自由基含量呈良好的線性關(guān)系[19]。如在反應(yīng)體系中加入自由基清除劑，可發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系顏色變淺或者消失。由圖4可知，質(zhì)量濃度10～100 μg/mL時，隨著橘皮總多酚和維生素C濃度的增加，其對OH自由基的清除率未發(fā)生太大變化，這可能與OH自由基壽命短的特性有關(guān)。此外，橘皮總多酚與同等濃度維生素C對OH自由基的清除率無太大區(qū)別，基本保持在40%左右，表明橘皮總多酚提取物對OH自由基具有一定清除能力，且與同等濃度下維生素C能力相當(dāng)。

圖4 OH自由基清除率

2.3.4 PTIO自由基清除率測定

通過水解處理后的PTIO會產(chǎn)生藍(lán)紫色溶液，與抗氧化劑反應(yīng)時，溶液顏色會變淺，PTIO自由基較穩(wěn)定，可以長時間存在于不同pH溶液中，其清除效率與溶液pH有關(guān)[20]。由圖5所示，PTIO清除率沒有隨著橘皮總多酚質(zhì)量濃度的增大而增大，清除率在2.71%～6.78%浮動，而維生素C對PTIO清除率則隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，最大清除率達(dá)99.15%。與維生素C相比，橘皮總多酚對PTIO清除率則很低。結(jié)果表明所提取的橘皮總多酚對于氧自由基的清除能力較弱。

圖5 PTIO自由基清除率

3 結(jié)論

以橘皮為原料，采用溶劑超聲浸提法提取橘皮總多酚，并研究其抗氧化活性。結(jié)果表明所提取的橘皮總多酚對ABTS+、DPPH、OH、PTIO自由基表現(xiàn)出不同程度的清除能力。同等濃度下其對ABTS+和DPPH這2種自由基的清除能力更強(qiáng)，對OH和PTIO這2種自由基的清除能力相對較弱。表明所提取橘皮總多酚對氮自由基的清除能力優(yōu)于氧自由基。科學(xué)開展橘皮總多酚生物學(xué)活性研究，以便更加充分、準(zhǔn)確地利用這一大量的綠色資源，不但能對人民健康提供保障，還可以創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)效益。