吳 婷，王夢迪，黃情兒，朱 波*，秦路平*

延胡索不同組織器官中內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)與多樣性分析

吳 婷1, 2，王夢迪1，黃情兒1，朱 波1*，秦路平1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402 2. 浙江省麗水市人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 麗水 323000

明確延胡索不同組織器官中內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)與多樣性。通過形態(tài)和分子手段相結(jié)合的方法對延胡索塊莖、葉、莖、根中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定及菌群結(jié)構(gòu)分析。共分離得到內(nèi)生真菌2161株，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征劃分成106個(gè)形態(tài)型，分子鑒定為57個(gè)分類單元，歸屬到41個(gè)屬，其中木霉屬、毛鏈孢屬為塊莖的專有屬，腐霉屬、白僵菌屬為葉的專有屬，亞球殼屬、核瑚菌屬為莖的專有屬，小囊菌屬為根的專有屬；相似性分析表明，延胡索不同組織器官內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)上存在差異；Shannon-wiener 多樣性指數(shù)及Simpson指數(shù)分析顯示延胡索根和莖中內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)、豐度均顯著高于塊莖和葉。延胡索組織器官中內(nèi)生真菌資源豐富，為延胡索內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)資料和參考依據(jù)。

延胡索；內(nèi)生真菌；組織器官；菌群結(jié)構(gòu)；多樣性

延胡索W. T. Wang是罌粟科紫堇屬植物，藥用部位為干燥塊莖，具有活血、行氣、止痛的功效，可用于胸脅、脘腹疼痛、胸痹心痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻、跌撲腫痛[1]。延胡索分布于浙江、安徽、陜西、重慶、河南等地，臨床應(yīng)用廣泛，市場需求巨大?，F(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)，延胡索具有催眠、抗心肌缺血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降壓以及抗胃腸潰瘍、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、提高抗應(yīng)激能力等藥理作用[2-3]。

植物內(nèi)生真菌（plant endophytic fungi）是指能與植物體共生存，但不會(huì)引起植物產(chǎn)生明顯病癥的一類微生物[4]。已有研究表明，植物內(nèi)生真菌遍及植物體當(dāng)中，普遍分布在植物的根、莖、葉、塊莖、花、果實(shí)和種子等組織器官或細(xì)胞間隙中，形成了植物體內(nèi)的微生態(tài)體系[5]。

目前關(guān)于延胡索內(nèi)生真菌的研究較少，馬韋韋等[6]對陜西城固縣的延胡索塊莖進(jìn)行分離鑒定，篩選出代謝產(chǎn)功能酶菌株；楊陽等[7]對8個(gè)產(chǎn)地延胡索塊莖的內(nèi)生真菌資源進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)塊莖中存在豐富的內(nèi)生真菌資源。已有研究發(fā)現(xiàn)，廣東化橘紅、麻花秦艽等菌群結(jié)構(gòu)特征在不同組織部位存在差異性與特異性[8-9]，且與藥用植物品質(zhì)密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)對內(nèi)生真菌在延胡索塊莖、葉、莖、根的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，明確延胡索不同組織器官內(nèi)生真菌的分布，旨在為延胡索內(nèi)生真菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步開發(fā)延胡索內(nèi)生真菌及提高延胡索藥材品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

2021年4～5月，采收浙江、陜西、重慶、安徽、河南延胡索新鮮健康植株，分別為安徽宣城（S1）、重慶開縣（S2）、陜西董家營（S3）、河南信陽（S4）、陜西三合鎮(zhèn)（S5）、浙江縉云（S6）、浙江東陽（S7）、浙江磐安（S8），經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張巧艷教授鑒定為罌粟科多年生草本延胡索W. T. Wang。

1.2 試劑與儀器

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊20 g，1000 mL，pH自然）；Takara9770A試劑盒購自美谷生物科技（浙江）有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司）；YXQ-LS-75S Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱、手術(shù)剪、手術(shù)刀、濾紙等。DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳槽（北京六一有限公司）；ABI Proflex型PCR（賽默飛世爾科技中國有限公司）；GelDocXR型凝膠成像儀（北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）；Eppendorf 5427R型離心機(jī)（Eppendorf中國有限公司）。無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)），次氯酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)），青霉素鈉（上海索寶來有限公司）。

2 方法

2.1 不同形態(tài)型內(nèi)生真菌菌株的分離與純化

將收集的延胡索植株自來水下沖洗30 min除去表面的泥土和雜質(zhì)，用無菌濾紙吸干其表面水分，進(jìn)行3步表面消毒處理（75%乙醇1 min，2.5%次氯酸鈉5 min，75%乙醇1 min），用無菌水洗滌延胡索植株表面殘留酒精后再用無菌濾紙吸干其表面水分。接著用無菌手術(shù)刀將延胡索根、莖、葉、塊莖切成小組織塊（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），置于含50 mg/L青霉素的PDA平板中，密封，25 ℃培養(yǎng)，定期觀察。待內(nèi)生真菌充分長出后，采用尖端挑取法進(jìn)行純化，直至出現(xiàn)形態(tài)單一的菌落。

2.2 不同形態(tài)型菌株的DNA提取與PCR擴(kuò)增

采用Takara9770A試劑盒對內(nèi)生真菌進(jìn)行基因組DNA提取。PCR擴(kuò)增采用引物ITS（5’-GGAA- GTAAAAGTCGTAAGG-3’）和ITS5（5’-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）組成：模板DNA，2 μL；引物ITS4，1 μL；引物ITS5，1 μL；2×TapPCR MasterMix（含染液），25 μL；ddH2O，21 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)與步驟：95 ℃初始變性3 min；95 ℃變性40 s；52 ℃退火50 s；72 ℃延伸 1 min；變性-退火-延伸循環(huán)35次；最后72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物有限公司進(jìn)行序列測定。

2.3 序列數(shù)據(jù)分析

登陸NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用BLAST將測序獲得的各菌株IT S和5.8 S基因序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對，查找相似性最高的菌種，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定分離菌株的分類地位。

2.4 內(nèi)生真菌多樣性及相似性分析

定殖率指植物受到內(nèi)生真菌侵染的組織塊數(shù)占所有組織塊數(shù)的百分比；分離率指分離得到的某個(gè)指定類型的內(nèi)生真菌菌株數(shù)占分離樣本組織塊總數(shù)的百分比；相對頻率（relative frequency，RF）表示所有樣本中分離得到的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離的總菌株數(shù)的百分比；運(yùn)用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（’）與Simpson多樣性指數(shù)（）來分析內(nèi)生真菌菌群的生物多樣性；運(yùn)用Soenson相似性指數(shù)來計(jì)算比較不同組織器官之間內(nèi)生真菌種類組成的相似性程度。優(yōu)勢屬或優(yōu)勢目的判定方法為P＞1/。P為內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)的比值，為每個(gè)組織器官內(nèi)生真菌種類數(shù)，當(dāng)P＞1/時(shí)即可判定為優(yōu)勢屬或優(yōu)勢目[10]。

3 結(jié)果與分析

3.1 延胡索不同組織器官的內(nèi)生真菌分布

從延胡索健康植株共分離得到內(nèi)生真菌2161株，其中根109株、莖114株、葉196株，塊莖1742株，見表1。4個(gè)組織器官內(nèi)生真菌的定殖率和分離率，見表2。結(jié)果表明，不同組織器官的內(nèi)生真菌的定殖率和分離率均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。塊莖、葉、莖、根的定殖率高低為塊莖＞葉＞莖＞根，分離率高低為塊莖＞葉＞莖＞根，表明延胡索植株不同組織器官中內(nèi)生真菌的侵染程度與豐富程度存在顯著差異。

表1 延胡索中內(nèi)生真菌的分離

Table 1 Endophytic fungi isolated from C. yanhusuo

代號分類參考序列相似度/%分離數(shù)量/株總計(jì) S1S2S3S4S5S6S7S8 T5腐皮鐮刀菌Fusarium solaniMK027264100.00108(Rh)61(Rh)79(Rh)98(Rh)100(Rh)70(Rh)79(Rh)50(Rh)645(Rh) T7木賊鐮刀菌Fusarium equisetiMK764999100.0069(Rh),2(Ra)56(Rh)50(Rh),2(Fo)41(Rh),2(Ra)50(Rh),1(Ra)49(Rh), 2(Ca),6(Ra)63(Rh)30(Rh),2(Fo),3(Ca)408(Rh),4(Fo),5(Ca),11(Ra) T79銳頂鐮刀菌Fusarium acuminatumMH782585100.00016(Rh)03(Ra)5(Rh),2(Ra)9(Rh)6(Rh),2(Ca)8(Rh)44(Rh),2(Ca),5(Ra) T89層出鐮刀菌Fusarium proliferatumMH933697100.0000007(Rh)11(Rh)0018(Rh) T97粉紅螺旋聚飽霉Clonostachys roseaMH911376100.002(Ra)71(Rh)41(Rh)12(Rh)30(Rh)20(Rh),3(Ra)22(Rh)21(Rh)217(Rh),5(Ra) T83木霉屬Trichoderma sp.KU93347589.1601(Ca)8(Rh)004(Rh),2(Ca)9(Rh)10(Rh)31(Rh),3(Ca) T86Volutella consorsMH89258197.96014(Rh)0004(Rh)6(Rh)024(Rh) Y81緊密帚枝霉Sarocladium strictumMF497404100.00000003(Fo)003(Fo) Y92球孢白僵菌Beauveria bassianaMG34508199.380000002(fo)02(fo) T25Monilochaetes melastomaeNR16112497.6649(Rh)26(Rh)27(Rh)24(Rh)20(Rh)31(Rh)27(Rh)20(Rh)224(Rh) G94黃瓜織球殼菌Plectosphaerella cucumerinaMH855387100.00003(Ca)0001(Ra)03(Ca),1(Ra) J86變黑輪枝菌Gibellulopsis nigrescensMH856082100.00003(Ca)000003(Ca) T17球毛殼Chaetomium globosumMK120280100.000000016(Rh)6(Rh)20(Rh),10(Ra)42(Rh),10(Ra) Y77Chaetomium lentumMH861858100.000007(fo)00007(fo) J88Arcopilus aureusMG889930100.003(Ca)00000019(Ra)3(Ca),19(Ra) G78Dichotomopilus variostiolatusMG889985100.004(Ra)00000004(Ra) T11菜豆間座殼Diaporthe phaseolorumMH78258999.04000000011(Rh)11(Rh) T99Microdochium bolleyiMH860598100.000009(Rh)00009(Rh) Y89Peroneutypa scopariaMK99342299.6100000002(Fo)2(Fo) Y82帚霉屬Scopulariopsis sp.LM65247972.6600002(Fo)0002(Fo) G81Microascus alveolarisKX923834100.001(Ra)00000001(Ra) T15Ophiosphaerella agrostidisKM43427298.5500000007(Rh)7(Rh) T22土棲棘殼孢Setophoma terrestrisKY56133799.1700002(Ra)3(Ca)6(Rh)06(Rh),3(Ca),2(Ra) Y75菊異莖點(diǎn)霉Paraphoma chrysanthemicolaMH24508299.7901(Fo)2(Fo)000003(Fo) Y10Stemphylium solainMH14245699.59000001(Fo)001(Fo) Y85新西蘭匍柄霉Stemphylium eturmiunumMH843731100.0000002(Fo)0002(Fo) Y95鏈格孢菌Alternaria alternataMK881030100.0096(Fo),16(Ca)03(Fo),3(Ca)9(fo),1(Ca)2(Fo),2(Ra)4(Ra)02(Fo),1(Ca)112(Fo),21(Ca),6(Ra) Y96極細(xì)鏈格孢霉Alternaria tenuissimaKF99674899.3920(Ca)2(Ca)6(Fo),4(Ca),1(Ra)15(fo),2(Ca)2(Fo),1(Ca)4(Ra)5(fo),2(Ca)2(Ca)28(fo),33(Ca),5(Ra)

續(xù)表1

代號分類參考序列相似度/%分離數(shù)量/株總計(jì) S1S2S3S4S5S6S7S8 Y96極細(xì)鏈格孢霉Alternaria tenuissimaKF99674899.3920(Ca)2(Ca)6(Fo),4(Ca),1(Ra)15(fo),2(Ca)2(Fo),1(Ca)4(Ra)5(fo),2(Ca)2(Ca)28(fo),33(Ca),5(Ra) J96Dokmaia monthadangiiKJ18870999.3200000002(Ca)2(Ca) Y100小球腔菌Leptosphaeria microscopicaMK304184100.0010(Ca)03(Fo)002(Fo),2(Ca)6(fo),3(Ca)2(Fo)13(Fo),15(Ca) Y94Didymella ellipsoideaNR15825799.7602(Ra)0001(Ca)002(Ra),1(Ca) Y93亞隔孢殼屬Didymella americanaKY099740100.000000002(fo)02(fo) Y97Phaeosphaeriaceae sp.MF58887399.201(Ca)0002(Ra)2(Fo)002(Fo),1(Ca),2(Ra) J99Sphaerulina cercidisMH86506199.780000001(Ca)01(Ca) T91Penicillium raphiaeMH186002100.0000008(Rh)8(Ra)03(Ca),7(Ra)8(Rh),3(Ca),15(Ra) Y80湯姆青霉Penicillium thomiiMH865966100.0003(Ca)0002(Fo)002(Fo),3(Ca) G98微紫青霉菌Penicillium janthinellumKP88146299.80000004(Ra)004(Ra) J87光孢青霉Penicillium glabrumMH865723100.000002(Ca),1(Ra)02(Ca)004(Ca),1(Ra) Y83曲霉菌Aspergillus cibariusMK267410100.0000002(Fo)0002(Fo) J90亮白曲霉Aspergillus candidusMH398524100.0002(Ca)0000002(Ca) G77費(fèi)希爾曲霉Aspergillus f ischeriMK775036100.001(Ra)0003(Fo)0003(Fo),1(Ra) T1糙刺藍(lán)狀菌Talaromyces trachyspermusLC31779899.901(Ra)00000001(Ra) G79Talaromyces tratensisKY991066100.001(Ra)000001(Ra)02(Ra) J84Talaromyces diversiformisNR147446100.0003(Ca)0000003(Ca) G99蘭淡領(lǐng)瓶霉Cadophora orchidicolaKX44015299.82002(Ra)000002(Ra) G74Helotiales sp.HQ649975100.0000002(Ra)0002(Ra) G80Oidiodendron setiferumNR077127100.0000000005(Ra)5(Ra) G93Oidiodendron truncatumLC317709100.0001(Ra)0000001(Ra) T13絲核菌屬Rhizoctonia sp.MG54790789.59000009(Rh)009(Rh) T96絲核菌屬Rhizoctonia sp.MH85568589.760000007(Rh)07(Rh) T4黑管菌屬Bjerkandera sp.FJ81014795.59000008(Rh)008(Rh) Y88粗毛栓菌Trametes hirsutaMH11489999.5000000002(Fo)2(Fo) Y98Peniophora nudaDQ41153399.630000002(fo)02(fo) J98Typhula sp.MF61503491.5500002(Ra)001(Ca)2(Ra),1(Ca) T82總狀毛霉Mucor racemosusKX06058598.2500019(Rh)000019(Rh) T102犁頭霉Absidia spJX50176561.58005(Rh)002(Ca)005(Rh),2(Ca) Y87異絲腐霉Pythium diclinumJQ89845999.7600000002(Fo)2(Fo)

Ra-根 Ca-莖 Fo-葉 Rh-塊莖

Ra-root Ca-stem Fo-leaf Rh-tuber

表2 不同組織器官內(nèi)生真菌定殖率與分離率

Table 2 Colonization rate and isolation rate of endophytic fungi in different tissues of C. yanhusuo

組織定殖率/%分離率/% 根10.6112.04 莖10.6211.88 葉17.0820.41 塊莖83.65 181.45

根據(jù)菌株的培養(yǎng)特征將其劃分為106個(gè)形態(tài)型，通過5.8S和ITS區(qū)片段序列的相似性對比和系統(tǒng)學(xué)分析，其中有57個(gè)鑒定到種，41個(gè)鑒定到屬，30個(gè)鑒定到科，18個(gè)鑒定到目。66.67%的延胡索內(nèi)生真菌表現(xiàn)出組織特異性，但未發(fā)現(xiàn)4個(gè)部位共有菌種。

延胡索內(nèi)生真菌的分布具有明顯的組織特異性。在目的分類水平上，塊莖的優(yōu)勢目為肉座菌目（Hypocreales，RF＝79.62%）和球團(tuán)目（Glomerellales，RF＝12.86%）；葉的優(yōu)勢目為腔菌目（Pleosporales，RF＝82.14%）；莖的優(yōu)勢目為腔菌目（Pleosporales，RF＝65.79%）、散囊菌目（Eurotiales，RF＝13.16%）、肉座菌目（Hypocreales，RF＝8.77%）；根的優(yōu)勢目為腔菌目（Pleosporales，RF＝13.76%）、肉座菌目（Hypocreales，19.27%）、散囊菌目（Eurotiales，RF＝22.02%）、糞殼菌目（Sordariales，RF＝30.28%）。在屬的分類水平上，塊莖的優(yōu)勢屬為粘帚霉屬（RF＝12.46%）、鐮刀菌屬Link ex Fr.（RF＝64.01%）、毛鏈孢屬Halst. ex Harter（RF＝12.86%）；葉的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬Nees（RF＝71.43%）、小球腔菌屬Ces.（RF＝6.63%）；莖的優(yōu)勢屬Nees為鏈格孢屬（RF＝47.37%）、小球腔菌屬Ces.（RF＝13.16%）、鐮刀菌屬Link ex Fr.（RF＝6.14%）；根的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬Nees（RF＝10.09%）、鐮刀菌屬Link ex Fr.（RF＝14.68%）、青霉菌屬Link（RF＝18.35%）、（RF＝17.43%）、毛殼屬（RF＝9.17%）（圖1和圖2）。其中木霉屬Pers.、毛鏈孢屬Halst.ex Harter為塊莖的專有屬，腐霉屬Pringsh.、白僵菌屬Vuillemin為葉的專有屬，亞球殼屬Sacc.、核瑚菌屬(Pers.) Fr.為莖的專有屬，小囊菌屬為根的專有屬。

圖1 4個(gè)組織器官中優(yōu)勢目的RF值

圖2 4個(gè)組織器官中優(yōu)勢屬的RF值

3.2 內(nèi)生真菌多樣性及豐度分析

方差分析和結(jié)果表明，4個(gè)組織器官延胡索內(nèi)生真菌豐度和值具有極顯著差異，多樣性指數(shù)（’）具有顯著性差異，見表3。延胡索根和莖中內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)、豐度均明顯高于塊莖和葉，根中的內(nèi)生真菌’是葉的1.62倍。這表明植物不同組織器官內(nèi)生真菌菌群的分布及組成不同。

表3 4個(gè)組織器官多樣性指數(shù)和豐度

Table 3 Diversity index and relative frequency of endophytic fungi in different tissues of C. yanhusuo

組織SH’D 塊莖191.857 50.773 8 葉201.709 60.645 1 莖212.407 70.854 7 根242.767 50.913 3

3.3 不同組織器官內(nèi)生真菌相似性比較

相似性指數(shù)（s）用于比較2個(gè)不同組織器官的內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。在種水平上，不同組織器官的s在0.051 3～0.577 8，莖部與根部內(nèi)生真菌菌群相似度最高，塊莖部與葉部相似性最低；在屬的水平上，不同組織器官的s在0.062 5～0.666 7，莖部與根部相似度最高，塊莖部和葉部相似性最低?？偟膩砜?，各組織器官內(nèi)生真菌類群之間存在較大的差異，組織差異性明顯，見表4和表5。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從延胡索塊莖、葉、莖、根4個(gè)組織器官中分離得到2161株內(nèi)生真菌，通過5.8 S和ITS區(qū)片段序列的相似性對比和系統(tǒng)學(xué)分析，鑒定歸屬為41個(gè)屬，顯示出豐富的內(nèi)生真菌多樣性。在延胡索不同的組織器官中，莖部與根部內(nèi)生真菌菌群相似度最高，塊莖部與葉部相似性最低。內(nèi)生真菌的分布規(guī)律可能與宿主本身的特性及內(nèi)生真菌的種類相關(guān)，因此在宿主的不同組織器官中具有不同的分布和結(jié)構(gòu)。延胡索各組織器官既有特殊的菌群，也有廣泛存在的菌群，體現(xiàn)了延胡索不同組織器官內(nèi)生真菌的特異性和差異性，原因可能是各組織器官的結(jié)構(gòu)差異和營養(yǎng)物質(zhì)的差異影響了內(nèi)生真菌的種類、侵染能力、方式與生存能力。

表4 不同組織器官在種水平上的內(nèi)生真菌Cs

Table 4 Similarity index of endophytic fungi in different tissues of C. yanhusuo at species level

組織器官Cs 塊莖葉莖根 塊莖1.000 0 葉0.051 31.000 0 莖0.300 00.292 71.000 0 根0.279 10.227 30.577 81.000 0

表5 不同組織器官在屬水平上的內(nèi)生真菌Cs

Table 5 Similarity index of endophytic fungi in different tissues of C. yanhusuo at generic level

組織器官Cs 塊莖葉莖根 塊莖1.000 0 葉0.062 51.000 0 莖0.312 50.294 11.000 0 根0.294 10.222 20.666 71.000 0

鏈格孢屬、鐮刀菌屬、粘帚霉屬、毛鏈孢屬、毛殼屬為延胡索的優(yōu)勢菌株。優(yōu)勢屬中，鐮刀菌屬和毛鏈孢屬內(nèi)生真菌可引起植物病害，而粘帚霉屬和毛殼屬內(nèi)生真菌已經(jīng)廣泛用于生物防治。鏈格孢屬廣泛存在于土壤及植物組織中，在枸杞[11]、鐵皮石斛[12]等多種植物中都有發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬是生態(tài)系統(tǒng)中最為常見的病原菌，但同時(shí)也是一種新的微生物資源，在抑菌、殺蟲和抗原生生物方面發(fā)揮著重要作用，蘊(yùn)藏巨大潛在應(yīng)用價(jià)值[13]。鐮刀菌屬會(huì)侵染多種植物，引起嚴(yán)重的根腐病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。目前對毛鏈孢屬的研究較少，趙永強(qiáng)等[15]發(fā)現(xiàn)毛鏈孢屬能導(dǎo)致甘薯黑皮病。近年來，人們利用粘帚霉屬真菌對立枯絲核菌、腐霉菌等土傳植物病原菌的抗菌、溶解、競爭、寄生等作用來防治它們對植物造成的脫落、根腐等病害。在國外，鏈孢粘帚霉和綠粘帚霉已被開發(fā)成生防制劑產(chǎn)品[16]。毛殼屬真菌是常見的內(nèi)生真菌類群，也是具有重要應(yīng)用價(jià)值的資源真菌,其能夠通過誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、重寄生作用以及產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物拮抗病原菌等方式防治植物病害[17]。

不同產(chǎn)地間延胡索內(nèi)生真菌多樣性存在差異，浙江縉云產(chǎn)延胡索內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)最高，’達(dá)2.734 8；而安徽宣城多樣性最低，’值僅為1.729 7。菌群結(jié)構(gòu)方面，各產(chǎn)地延胡索最優(yōu)勢屬均為鐮刀菌屬，其他優(yōu)勢屬略有區(qū)別，但以毛鏈孢屬、鏈格孢屬、粘帚霉屬為主。供試8個(gè)產(chǎn)地延胡索均存在產(chǎn)地特有菌群，如安徽宣城延胡索特有菌為（RF＝1.04%）、（RF＝0.26%）等；河南信陽特有菌為（RF＝2.86%）、（RF＝3.67%）等；浙江縉云特有菌為草莓花枯病菌（RF＝3.17%）、煙管菌（RF＝2.82%）等。這些產(chǎn)地特異性菌群可能與該產(chǎn)地土壤、降水量、濕度、溫度等生境因子相關(guān)，為延胡索道地性形成機(jī)制提供了參考依據(jù)。

根據(jù)’、指數(shù)表明延胡索根、塊莖中的內(nèi)生真菌種類較豐富。延胡索的藥用部位是塊莖，木霉屬為塊莖的特有種群，楊陽等[7]研究發(fā)現(xiàn)木霉屬內(nèi)生真菌T83與延胡索鎮(zhèn)痛活性成分延胡索乙素積累存在密切關(guān)系。木霉菌被認(rèn)為是防治真菌性植物病害的潛在生防菌，它們可以直接與根相互作用，增加植物生長，抵抗疾病和對非生物脅迫的耐受性[18]。因此，下一步的工作中將重點(diǎn)研究延胡索內(nèi)生真菌對宿主植物生長發(fā)育的作用，對藥用部位活性物質(zhì)形成、含量變化的影響。目前，關(guān)于內(nèi)生真菌對藥用植物活性成分的影響仍處于探索階段，本研究通過對延胡索不同組織器官進(jìn)行內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步研究內(nèi)生真菌與延胡索藥材品質(zhì)關(guān)系奠定了良好的基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 145-146.

[2] 李雅萌, 王亞茹, 周柏松, 等. 延胡索中重金屬及有害元素的測定 [J]. 特產(chǎn)研究, 2019, 41(2): 66-68.

[3] 楊夢萍, 陳曉瑤, 張悅健, 等. 基于文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)的延胡索研究現(xiàn)狀及熱點(diǎn)分析 [J]. 藥物評價(jià)研究, 2023, 46(7): 1406-1416.

[4] 張志東, 朱靜, 唐琦勇, 等. 不同擴(kuò)增引物對高通量測序分析鹽角草內(nèi)生真菌多樣性的影響 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2020, 47(2): 411-419.

[5] 李夢歌, 惠建超, 阿依佳瑪麗·依瑪爾, 等. 陜西宜君核桃內(nèi)生真菌多樣性研究 [J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué), 2018, 33(5): 818-825.

[6] 馬韋韋, 鄧百萬, 陳文強(qiáng). 延胡索內(nèi)生真菌的分離鑒定及產(chǎn)功能酶菌株的初步篩選 [J]. 陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2016, 32(4): 65-72.

[7] 楊陽, 李茜茜, 唐藕鳳, 等. 延胡索塊莖中內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)及其與延胡索乙素含量的相關(guān)性研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(7): 1901-1908.

[8] 舒永馨, 羅梅, 陳欣瑜, 等. 廣東化橘紅內(nèi)生真菌多樣性分析 [J]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2021, 34(1): 8-11.

[9] 陳昕, 李琪, 曹倩倩, 等. 麻花秦艽不同組織部位可培養(yǎng)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)及其與龍膽苦苷含量的相關(guān)性 [J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2019, 38(4): 21-29.

[10] 吳令上. 南方紅豆杉內(nèi)生真菌多樣性、次生代謝產(chǎn)物及其與宿主的相關(guān)性研究 [D]. 上海: 第二軍醫(yī)大學(xué), 2012.

[11] 劉偉, 張勤德, 王多文, 等. 枸杞新病害葉枯病癥狀表現(xiàn)及病原菌鑒定 [J]. 北方園藝, 2018(12): 141-145.

[12] 劉國華, 趙楠, 趙桂華. 鐵皮石斛枯梢病的病原菌及發(fā)病規(guī)律研究 [J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 37(1): 138-143.

[13] 周素婷, 任兵楊, 李欲軻, 等. 鏈格孢致病機(jī)制、防治措施與開發(fā)利用研究進(jìn)展 [J/OL]. 分子植物育種, 2021. [2021-10-15]. https://kns.cnki.net/kcms/detail/ 46.1068.S.20211014.1715.008.html.

[14] 文增葉, 李定華, 代夢瑤, 等. 三七根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性分析 [J]. 中藥材, 2019, 42(9): 1978-1984.

[15] 趙永強(qiáng), 徐振, 楊冬靜, 等. 甘薯黑痣病菌的生物學(xué)特性研究 [J]. 北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 46(5): 89-92.

[16] 董錦艷, 李銣, 張克勤. 粘帚霉屬真菌代謝物的研究進(jìn)展 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2006, 33(2): 124-131.

[17] 唐保宏. 玉米葉斑病拮抗性毛殼屬內(nèi)生真菌的篩選 [A] // 中國菌物學(xué)會(huì)第七屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨2017年學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集 [C]. 宜昌: 中國菌物學(xué)會(huì), 2017: 202.

[18] Silva R N, Monteiro V N, Steindorff A S,. Trichoderma/pathogen/plant interaction in pre-harvest food security [J]., 2019, 123(8): 565-583.

Fungal community and diversity of endophytic fungi in different tissues of

WU Ting1, 2, WANG Meng-di1, HUANG Qing-er1, ZHU Bo1, QIN Lu-ping1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311402, China 2. Department of Pharmacy, Lishui People's Hospital, Lishui 323000, China

To clarify fungal community and diversity of endophytic fungi in different tissues of.Endophytic fungi in tubers, leaves, stems and roots ofwere isolated, identified and analyzed by morphological and molecular methods.A total of 2162 endophytic fungal strains were isolated and divided into 106 morphological types. Through molecular systematical analysis, they were divided into 57 taxons, belonging to 41 genera, whileandwere the exclusive genera of tubers,andwere the exclusive genera of leaves, andandwere the exclusive genera of stems,is a proprietary genus in roots. Similarity analysis showed that there were significant differences in the endophytic fungal community in different tissues. Shannon Wiener diversity index and Simpson index analysis showed that the diversity index and abundance of endophytic fungi in roots and stems were significantly higher than those in tubers and leaves.There are abundant endophytic fungi in varioustissues. The paper provides basic information and scientific reference for the development and utilization of endophytic fungal resources in.

W. T. Wang; endophytic fungi; tissues; fungal community; diversity

R286.2

A

0253 - 2670(2023)16 - 5372 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.025

2023-03-03

浙江中醫(yī)藥大學(xué)人才專項(xiàng)（2021ZR09）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生青年創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（2022RC052）

吳 婷（1983—），女，在讀研究生，研究方向?yàn)橹参飪?nèi)生菌。E-mail: 513303983@qq.com

朱 波，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参飪?nèi)生菌。E-mail: zhubo@zcmu.edu.cn

秦路平，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及品質(zhì)評價(jià)。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]